莱纳尔皮质-希波坎普斯有机切片文化中的癫痫发生模型

癫痫是一种普遍的神经系统疾病。鼻皮质-海马细胞切片描绘了进化的癫痫样事件，类似于体内癫痫，因此可用作癫痫的前活体模型。该系统确实是监测癫痫发生动态和进展，以及筛查这种脑病理学的潜在治疗目标的极好工具。

和我一起演示程序的是我的学生弗朗西斯科·梅达和马法达·卡瓦略。为了从产后第六天到第七天收获大脑，首先用五毫升的 GBSS 洗头三次。在生物安全柜中工作，将锋利的钳子牢牢地插入眼窝，将头部固定到位，并使用细尖剪刀将头皮沿中线从椎骨前额切到前叶。

以同样的方式切割头骨，沿着大脑横向裂变，并使用弯曲的长钳将头骨碎片分开。使用铲子丢弃嗅球，并将大脑的后侧转移到含有5毫升冷GBSS的60毫米板中。将细钳插入小脑，沿中线插入铲子，小心地打开半球。

使用短弯曲的钳子小心地去除覆盖海马体的多余的组织，而无需接触海马结构，然后切到每个海马体下面。一次将一个半球移到海马区，并平行到一张滤纸上。将滤纸放在组织切碎器上，半球垂直于刀片，将半球切成350微米切片。

将切片组织转移到含有五毫升冷 GBSS 的新培养皿中，并使用圆尖电极小心地分离切片，只保留结构完整的鼻皮质和海马的样品。DG 和 CA 区域应完美定义以及腹腹和腹皮质区域。使用铲子和圆形尖端电极，将多达四个完好无损的切片放入六井板的适当数量的单独插入物上，每口井含有 1.1 毫升培养介质。

使用 P20 移液器从每个切片周围去除任何多余的解剖介质。将盘子放在细胞培养孵化器中。每两到三天更换一次介质。

使用钳子解除插入。从相应的井中吸气介质，并将插入物放回原位。使用 P1000 移液器为每口井添加一毫升 37 摄氏度的新鲜介质。

在闭路中准备电生理学设置。验证接口类型腔室的流速设置为每分钟两毫升，并打开碳水化合物-牛阀。检查系统中的水位，并将一张滤纸放入接口记录室，以排出任何多余的介质。

将一张透镜清洁纸放在框架下方，为切片提供介质，并打开温度控制器、放大器和微型操纵器。使用注射器用新制备的人造脑脊液装载玻璃电极。将玻璃电极放入接收电极中，等待接口腔中的温度稳定在 37 摄氏度。

在生物安全柜中工作，将插入物放在一个 60 毫米的板中，并放置一滴介质。使用锋利的刀片从插入处切下一片，将切片与海马放在右下角的接口室中，然后将接收的电极放入CA3金字塔细胞层，启动连续采集协议，并将切片记录30分钟。要执行丙酸碘化物吸收检测，请在生物安全柜中工作。

将插入物从井中提起，在中等温度下加入碘化物，最终浓度为每口油井两微摩尔。在将插入物放回井中之前，请慢慢搅拌板，注意切片下方没有气泡。处理好所有切片后，将板返回细胞培养孵化器。

对于切片的免疫染色，在硫化物培养的末尾，从每个井的底部吸气介质，并在每个插入物的顶部和底部加入一毫升4%的副甲醛。在室温下一小时后，每次洗两次10分钟和一毫升PBS，然后用疏水笔在显微镜幻灯片上画两个矩形。使用锋利的刀片从插入处切下切片，并将一片切片放入每个矩形中。

在每片上加入渗透阻塞溶液，在室温下进行三小时的孵化。在孵化结束时，在每片中加入主要的抗体，在一夜之间进行四摄氏度的潜伏。第二天早上，用PBS-Tween清洗切片三次，每次洗涤10分钟，并在室温下用适当的二次抗体孵育切片4小时。

之后，按演示清洗切片，并在每个切片中加入 50 微升的 Hoechst 溶液，在室温下进行 20 分钟的孵化。在 Hoechst 孵化后，再次清洗切片，并在每个切片上加入 50 微升安装介质，然后在切片上放置盖片，然后用指甲油密封。在允许幻灯片在室温下干燥 24 小时后，通过共焦显微镜可视化免疫染色和碘化物的吸收。

鼻皮质-海马细胞切片描绘了体外七天的混合间歇和冰晶状活动。在体外14天，自发活动的特点是ictal放电，在体外21天进化为压倒性的ictal活动，ictal事件持续超过1分钟。对神经元标记NeuN的碘化物吸收和免疫化学在7天内在体外切片中暴露出一些神经元死亡，在海马体的所有区域，体外14天时，神经元死亡显著增加。

在体外七天，低CD68表达的充血微胶质比Iba1正CD68正反应微胶质更丰富。而在体外14天，在海马的所有区域，Iba1正CD68正阿莫博德M1微胶质超过微胶质与低CD68表达。在体外14天，一些Iba1阳性CD68阳性细胞具有超后果的外观可以精确定位，这表明M2抗炎微胶质表型的可能性。

在体外7天，CD3的表达几乎无法检测，而在14天的体外切片中，可以观察到高营养胶质纤维酸性蛋白阳性CD3正星形细胞，这表明A1星形细胞的渐进激活。准备鼻皮质-河马片与极端小心。确保去除海马上方多余的组织，因为它可能会在切片过程中损害切片完整性。

结构性赤字将对切片生存能力产生负面影响。除了演示的方法外，还可以在该系统中应用大量检测方法，如西方污点分析、实时 PCR 和 ELISA，以解决有关癫痫发生的具体问题。