Name: 用异体皮肤移植重建的烧伤伤口的穆林模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 了解小鼠全层烧伤创面异体皮肤移植模型的构建方法。本研究使用预热黄铜块诱导热烧伤，并通过手术切除坏死组织后进行皮肤移植，为烧伤创面愈合研究提供可重复的实验框架。

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本工作由法国国防总署（La Direction Générale de L'Armement）、国防创新署（Agence de l’Innovation de Défense）和巴黎综合理工大学（École Polytechnique）资助。我们感谢来自巴黎综合理工大学的同事Yann Plantier先生，他在视频文件制作过程中提供了宝贵的见解和专业知识。作者感谢来自巴黎保罗·布罗西医院（Hôpital Paul Brousse）维尔儒伊夫（Villejuif）的法国国家健康与医学研究院（INSERM）拉瓦锡单位（SEIVIL）US 33的Benoit Peuteman先生和Charlotte Auriau女士，他们在本项目进行期间提供了有关实验动物福利与照护的专业支持。

所有实验均获得法国高等教育与研究部批准（研究编号：122162017111616517670v2 和 DAP180012）。所有小鼠到达后单独饲养于塑料笼中，并在研究开始前给予 7 天的适应期。动物房保持 12/12 小时光照/黑暗循环（光照开启时间为 07:00）。食物和自来水均自由供应。BALB/c 和 SKH1-Hrhr 小鼠饲喂传统的以小麦/大豆为基础的饮食。笼内提供木屑垫料以及筑巢材料。
1. 仪器设备准备
<ol>
	<li>准备燃烧装置，并使用温度控制器将其设定为 80 °C（图1A）。验证黄铜模板的温度（图1B，C使用红外热成像相机。</li>
	<li>确保数字压力计正常工作。</li>
	<li>用手术单覆盖手术台，并调节台面高度（图1A).</li>
</ol>
2. 术前和术中动物护理
<ol>
	<li>获取6-8周龄的BALB/c和SKH1-Hrhr小鼠。</li>
	<li>在饮水中加入浓度为3 mg/mL的对乙酰氨基酚混悬液，并在实验操作前12小时开始供给，持续至操作后72小时。</li>
	<li>使用1 mL注射器和26 G针头，在操作前30分钟以及操作后前72小时内每6小时一次，按0.05 µg/g剂量皮下注射布托啡诺。</li>
	<li>使用1 mL注射器和26 G针头，在诱导烧伤前15分钟，于小鼠背部及烧伤区域远端2-3 mm处，按0.05 µg/g剂量皮下注射利多卡因。</li>
	<li>通过腹腔注射给予赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）以麻醉小鼠。使用1 mL注射器和26 G针头进行注射。</li>
	<li>关键步骤：将麻醉后的小鼠置于加热垫上，在麻醉诱导后的前30分钟内以及从麻醉恢复后的至少15分钟内保持小鼠体温，防止低体温。除加热垫外，还可采用其他方式调节体温，包括加热灯、循环的温热液体或空气，以及预热的储热装置。</li>
	<li>在小鼠眼部涂抹润滑凝胶，防止角膜脱水。</li>
	<li>使用足趾夹捏回缩反射评估麻醉深度。</li>
	<li>使用1 mL注射器和26 G针头，皮下注射200 µL含5%葡萄糖的乳酸林格氏液。在麻醉诱导后立即以及操作后6小时进行皮下补液，以防止脱水。</li>
</ol>
3. 全层烧伤创面诱导
<ol>
	<li>用电动剃毛器剃除麻醉小鼠的毛发。</li>
	<li>在小鼠背部涂抹脱毛膏，作用1分钟。用无菌纱布擦去脱毛膏，并用一块湿润的纱布清洁该区域。再用纱布轻轻按压皮肤至干燥。</li>
	<li>将小鼠置于覆盖手术巾的载物台上，并将载物台向上移动，使其靠近预热的黄铜模板。</li>
	<li>将圆形黄铜模板（80 °C，20 s）以0.15 N的恒定压力压在小鼠背部（图2）。</li>
	<li>关键步骤：烧伤造模后立即把麻醉动物放置在加热垫上，以防止低体温，并在操作过程中及之后保持小鼠体温。待小鼠从麻醉中恢复后，将其放回笼中。</li>
	<li>关键步骤：术后前72小时应在笼底提供软质饲料。小鼠在烧伤后有时不愿抬头通过饮水管饮水。</li>
</ol>
4. 供体移植物的获取
<ol>
	<li>用手术刀在供体小鼠尾部上段做一纵行切口，用手术镊轻轻剥离皮肤。</li>
	<li>将尾部皮肤放入盛有10 mL无菌0.9%生理盐水的无菌培养皿中。使用直尺测量并用手术刀将尾部皮肤切成每片15 mm的移植物。</li>
	<li>制备完成后，将皮肤移植物置于4 °C的0.9%生理盐水中保存，最多可保存2小时。</li>
</ol>
5. 外科切除与皮肤移植
<ol>
	<li>烧伤诱导24小时后，通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉准备。将小鼠放入诱导室，在100%氧气中以4 L/min的流速使用5%异氟烷诱导麻醉。手术期间维持麻醉时，使用2%异氟烷，流速为2 L/min。</li>
	<li>在小鼠身上覆盖手术巾，并剪开一个窗口以暴露手术区域。采用无菌技术，先用聚维酮碘擦拭伤口，再用70%酒精擦拭。</li>
	<li>用手术镊轻轻夹起烧伤组织，使用无菌手术剪和手术镊切除所有坏死和无活力的组织。去除皮下组织的肉膜层（panniculus carnosus），以创建稳定的受体床。</li>
	<li>将皮肤移植物置于新制备的创面床之上。用手术镊轻轻将周围皮肤向移植物方向牵拉。涂抹适量外科粘合剂以将移植物固定于创面床，并轻压使皮肤边缘对齐。关键步骤：创面床的面积必须略大于皮肤移植物的面积，以确保成功植活。</li>
	<li>让小鼠从麻醉中恢复。关键步骤：将小鼠置于加热垫上。在手术期间及术后保持小鼠体温，防止低体温。</li>
	<li>在移植伤口上覆盖惰性凡士林纱布敷料，并加用粘性二级敷料。</li>
	<li>将小鼠放入单独的笼子中。关键步骤：手术后前72小时内，在笼底提供一些软化饲料，并每日监测。</li>
	<li>提供玩具并丰富环境。</li>
</ol>
6. 数字成像与死后伤口样本采集
<ol>
	<li>使用数码相机拍摄伤口，拍摄时将尺子放置在伤口旁边（图3）。</li>
	<li>实验终点时，通过暴露于二氧化碳并行颈椎脱位法处死动物。关键步骤：颈椎脱位过程中皮肤过度牵拉可能损伤移植物。</li>
	<li>死后，用剪刀将背部烧伤伤口沿筋膜层手术切除。将伤口一分为二，其中一半用10%中性缓冲福尔马林固定，用于组织学和免疫组织化学分析；另一半在液氮中快速冷冻，用于RNA提取和蛋白质定量，并于-80 °C保存。</li>
</ol>
7. 皮肤组织学、免疫组织化学及胶原蛋白可视化
<ol>
	<li>将皮肤样本包埋于石蜡中，切成4 µm厚的切片，并置于带正电荷的载玻片上。</li>
	<li>使用苏木精-伊红染色的切片评估再上皮化速率（占原始伤口面积的百分比）。新生表皮覆盖的伤口区域可表示为整个伤口面积的百分比（图4）。使用数字显微镜应用程序和ImageJ软件对切片进行显微分析。</li>
	<li>使用由甲醛固定并石蜡包埋的组织制备的组织学切片（厚度为4 µm），并进行免疫组织化学分析。</li>
	<li>为评估伤口中I型胶原和纤连蛋白的表达，加入一抗并孵育1小时。检测可采用种属特异性的辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）偶联的二抗。</li>
	<li>将切片与以下任一试剂反应：(i) HRP与3,3'-二氨基联苯胺（DAB）或(ii) AP与Bond Polymer Refine Red（材料表），后者产生明亮的红色（图5）。使用仪器扫描切片，并通过数字显微镜应用程序和ImageJ进行分析。</li>
	<li>为实现对胶原沉积的组织学评估，使用商用试剂盒对组织学切片进行三色染色。</li>
	<li>为观察胶原纤维，采用多光子显微镜结合二次谐波生成技术（图5）。按照先前描述的方法20使用多光子显微镜进行组织成像。采用中心波长为810 nm的钛：蓝宝石激光器作为激光源，以产生二次谐波和双光子激发荧光信号（TPEF）。</li>
	<li>使用配备25x/0.95 W物镜的激光束激发并收集二次谐波生成（SHG）和TPEF信号。按照先前所述方法21通过NDD PMT探测器检测信号。使用软件控制激光扫描及图像采集。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

根据烧伤深度的分类23，全层烧伤的特征是皮肤全层及部分皮下组织明显受累。此类创面只能通过收缩或植皮愈合2。本文所述方法的一个固有局限性在于，仅从鼠尾获取了全层皮片移植材料，而未获取临床上更常用的中厚皮片移植材料。这是由于技术上的困难，小鼠皮肤过薄，难以获取中厚皮片。必须指出的是，全层皮片移植需要血供良好的创基，而中厚皮片则能够在血供较少的受区存活24。既往研究表明，在小鼠背部诱导的烧伤创面会伴随显著的新生血管形成5。这提示血供丰富的区域，如小鼠背部，可作为诱导烧伤创面的解剖学标志部位。
烧伤创面深度是一个需要考虑的重要因素。不同小鼠之间的烧伤创面深度必须保持一致。烧伤创面深度的可重复性取决于黄铜模板的温度、施加的压力以及热暴露时间。烧伤创面深度必须通过组织学方法进行验证。需要注意的是，过大的压力或皮肤与预热黄铜模板接触时间过长可能会损伤深层组织。脊柱周围的组织，包括中枢和周围神经系统结构，对热敏感，一旦受损可能导致后肢瘫痪。
尽管术后死亡率与手术操作无直接关联，但少数无毛SKH1-Hrhr小鼠（对寒冷特别敏感）在全身麻醉后出现低体温，且未能恢复。因此，在所有麻醉过程中必须提供额外保温措施，并在小鼠处于麻醉状态时进行持续监护。
本研究中描述的方法与手术部位感染无关。然而，必须采用无菌技术，以防止在围手术期将微生物带入手术伤口。可在该操作中引入具有生物发光或荧光特性的微生物接种伤口。该技术可能有助于研究感染性微生物及其致病机制25。例如，外源性添加或注射生物发光细菌，可利用活体全动物成像技术监测微生物负荷量25。鉴于已知小鼠体毛会干扰活体全动物荧光和生物发光成像，无毛的SKH1-Hrhr小鼠是进行荧光或生物发光报告实验的理想宿主。
可在不同时间点采集伤口组织样本，并进行组织学和免疫组织化学分析。可从皮肤活检样本中分离蛋白质和RNA，并利用分子生物学技术检测参与伤口愈合的关键分子的表达水平。
在本研究中，我们描述了一种烧伤创面愈合及同种异体皮肤移植的实验模型。该方法可进行修改，并可作为临床前研究的模型。

外科清创和皮肤移植是临床上常用于治疗慢性伤口1、烧伤伤口2以及急性创伤性伤口3的常见方法。皮肤移植是指通过外科手术从身体某一部位取下健康皮肤并将其移植到另一部位的过程。供体移植物可替代缺失的组织，并为细胞迁移和生长提供结构支架。在整合至受体部位后，皮肤移植物通过防止微生物侵入、抵御外界环境的有害影响以及减少水分过度流失，重建缺失的皮肤屏障功能4。皮肤移植物成功整合依赖于多种因素，包括在微生物感染存在的情况下具备适当的免疫反应、炎症的及时消退、创面部位充分的血管生成，以及受体床与供体移植物之间血管吻合的建立5。随着移植物逐渐降解，原有的真皮细胞必须被能够合成新的细胞外基质的细胞所替代。与此同时，表皮角质形成细胞需在新生成的基质上迁移，形成新生表皮，实现创面的再上皮化。因此，受体床细胞高效迁移至供体移植物内是影响移植物成功整合的另一关键因素。鉴于参与伤口愈合的因素众多6，而在人体试验中由于伦理限制难以对这些因素进行有效控制，因此建立临床前实验性皮肤移植模型十分必要。开发烧伤后伤口愈合及其相关皮肤移植的临床前模型，对于理解皮肤组织修复的复杂机制以及测试新型治疗药物具有重要意义。体外伤口愈合模型无法准确模拟皮肤组织的复杂性，而体内动物模型则是研究组织修复机制不可或缺的实验工具。
已开发出多种用于啮齿类动物的皮肤移植技术，以模拟外科切除和烧伤创面修复7,8,9。然而，大多数先前描述的方法在皮肤移植前未能诱导产生热力烧伤损伤。这些方法并未制造烧伤创面，而是制造全层切除性创面，随后用全层皮肤同种异体移植物进行修复7。在啮齿类动物中，已采用多种解剖部位（如耳部、尾部和背部）作为供体皮肤的取材区域7,8。已有报道采用不同的移植物固定与稳定技术，包括“无缝合技术”9、缝合线7以及外科粘合剂10,11,12。
本研究旨在建立一种小鼠全层烧伤创面模型，以模拟当前烧伤治疗的金标准方法，即切除失活组织并进行皮肤移植。通过使用预热的黄铜模板在小鼠背部表面诱导热力烧伤。随后切除烧伤焦痂，并以取自供体小鼠尾部的全层皮肤移植物替代。该实验模型具有三个主要优势。首先，可在同一只受体小鼠背部诱导多个烧伤创面，且可从单只供体小鼠尾部获取多达四块供皮移植物。这意味着可利用相同的受体和供体动物同时比较多种实验组与对照组处理方案。根据预期给药途径，对照处理可包括局部或全身给予溶媒或安慰剂对照（例如：软膏局部涂抹、皮下、腹腔或静脉注射溶液）。其次，该模型可精确控制治疗时机和实验终点。第三，该模型依赖于取自尾部的全层移植物进行创面重建，相较于取自背部的皮肤，尾部皮肤移植物成功整合至受区的概率更高13。这可能归因于尾部表皮朗格汉斯细胞数量较少，而此类细胞在皮肤免疫生物学中发挥关键作用，并与皮肤移植物排斥反应密切相关14。
所提出的伤口愈合与移植物整合模型也可应用于转基因小鼠和基因敲除小鼠。使用基因修饰小鼠将有助于阐明特定基因在伤口修复过程中可能发挥的作用。此外，还可考虑在损伤部位外用局部伤口制剂或皮下注射治疗性抗体。
由于技术上的困难，由表皮和部分真皮组成的中厚皮片在小鼠中难以获取。已知包含表皮和全层真皮的全厚皮片需要具有良好血管化的创面床才能成功整合。无法在小鼠中获取中厚皮片可被视为该模型的一个局限性。皮肤移植物与受体创面床的固定通过使用外科粘合胶实现，与其他组织固定方法相比，这种方法造成的创伤更小且降解迅速15。先前的研究表明，在手术后24小时，缝合固定的组织牢固性优于外科粘合胶15，这可能被视为该操作的一个缺点。然而，在较晚的时间点，使用外科粘合胶处理的创面其生物力学强度可达到与缝合相当的水平15，并优于钉合固定16。使用外科粘合胶完成组织固定后，创面必须覆盖敷料。尽管小鼠难以触及背部的创面，但敷料本身却容易被动物抓挠并移除。因此，可能需要频繁更换敷料。
小鼠麻醉引起的低体温是一种有充分文献记载的现象17。低体温是该操作的副作用，可导致并发症，并可能影响动物健康和数据质量。因此，该方法需要实施体温管理策略，尤其是在使用无毛SKH1-Hrhr小鼠时。
使用小鼠模拟人类伤口闭合最主要的局限性在于皮肤解剖结构和生理学上的差异。小鼠伤口主要通过收缩愈合，而人类伤口则通过肉芽组织形成和再上皮化过程愈合18。为弥补这一差异，可对当前模型进行改良，结合使用紧贴伤口周围固定的环形夹板，以防止皮肤收缩19。鉴于该体内实验方案存在某些优缺点，此模型仍可作为研究某些无法在体外模拟的伤口愈合过程的工具。

<table><tbody><tr><td>1 毫升注射器</td><td>Terumo</td><td>SS + 01T1</td><td></td></tr><tr><td>26 G 针头</td><td>Terumo Agani</td><td>NN-2613R</td><td>1/2'' - 0.45 X 12mm</td></tr><tr><td>96×21 mm 培养皿</td><td>Dutscher</td><td>193199</td><td></td></tr><tr><td>动物电子秤</td><td>Kern</td><td>EMB 5.2K5</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c 小鼠</td><td>Janvier labs</td><td>BALB/cAnNRj</td><td>6 周龄</td></tr><tr><td>活检泡沫垫 30.2×25.4×2 mm</td><td>Simport</td><td>M476-1</td><td></td></tr><tr><td>Bond polymer Refine Red</td><td>Leica Biosystems</td><td>DS9390</td><td></td></tr><tr><td>黄铜块</td><td>BVG</td><td>定制设计</td><td>直径 10 mm 的圆形</td></tr><tr><td>丁丙诺啡（BUPRECARE）</td><td>Axience</td><td>FR/V/6328396 3/2011</td><td>皮下注射，剂量为 0.05 &amp;mu;g/g</td></tr><tr><td>烧伤装置 Kausistar 400</td><td>Tra&amp;ccedil;aMatrix</td><td>34010</td><td></td></tr><tr><td>CaseViewer</td><td>3DHISTECH Ltd.</td><td></td><td>3Dhistech，布达佩斯，匈牙利</td></tr><tr><td>I 型胶原抗体</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td>推荐浓度 1:50；1:200</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖（右旋糖）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-8769-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9432</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>NIKON</td><td>D3400</td><td>镜头：SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀片</td><td>Swann Morton</td><td>6601</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN biotech</td><td>P04-36300</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR chemicals</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab23750</td><td>推荐稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>0.22 µm 滤器</td><td>Sartorius</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>F.S.T.</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>杜蒙特镊子</td><td>F.S.T.</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>毛发剪</td><td>AESCULAP</td><td>B00VAQ4KUY (ISIS)</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Petelevage</td><td>120070</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal healthcare</td><td>FR/V/03248850/2011</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Imalgene</td><td>FR/V/0167433 4/1992</td><td>手术麻醉剂，腹腔注射，剂量为 100 mg/kg</td></tr><tr><td>乳酸林格氏液</td><td>Flee-Flex</td><td>1506443</td><td></td></tr><tr><td>Lamina 多标签载玻片扫描仪</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS 软件</td><td>Leica</td><td></td><td>版本 2.7.3</td></tr><tr><td>Leica Bond III</td><td>Leica Biosystem</td><td>1757</td><td></td></tr><tr><td>Leukosilk 敷料</td><td>BSN medical</td><td>72669-01</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因</td><td>Aguettant</td><td>N01BB02</td><td>局部镇痛药，皮下注射，剂量为 0.05 &amp;mu;g/g</td></tr><tr><td>压力计</td><td>Kern</td><td>HDB-5K5</td><td></td></tr><tr><td>Masson 三色染色试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT15-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Micromesh 活检盒</td><td>Simport</td><td>M507</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP5 多光子倒置显微镜</td><td>Leica microsystems</td><td>DM500</td><td>扫描频率 8000 Hz，NDD PMT 检测器</td></tr><tr><td>非粘连性敷料 Adaptic</td><td>Systagenix</td><td>A6222</td><td>12.7 cm × 22.9 cm</td></tr><tr><td>Ocrygel</td><td>Tvm France</td><td>###</td><td></td></tr><tr><td>对乙酰氨基酚 300 mg</td><td>Dolliprane</td><td>Liquiz</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>VWR chemicals</td><td>1169945</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>MEDA pharma</td><td>D08AG02</td><td>稀释至 1:2</td></tr><tr><td>SKH1-Hrhr 小鼠</td><td>Charles river</td><td>686SKH1-HR</td><td>6 周龄</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Thermoscientific</td><td>AGAA000080</td><td></td></tr><tr><td>外科粘合剂</td><td>BSN medical</td><td>9927</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>Hartmann</td><td>418545/9</td><td>10 × 10 cm</td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Versylene Fresenius</td><td>B230521</td><td></td></tr><tr><td>手术洞巾</td><td>Hartmann</td><td>2775161</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sapphire ChameleonUltra</td><td>Coherent</td><td>DS 16-02-16 F</td><td>690–1040 nm</td></tr><tr><td>热成像相机</td><td>Testo</td><td>Testo 868</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Rompun 2%）</td><td>Bayer</td><td>FR/V/ 8146715 2/1980</td><td>手术麻醉剂，腹腔注射，剂量为 10 mg/kg</td></tr></tbody></table>

一种利用同种异体皮肤移植物重建的烧伤创面小鼠模型

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

浅表的轻微伤口可通过一期愈合无并发症地愈合。深度伤口（如全层烧伤）则通过二期愈合，需要外科清创和皮肤移植。供体移植物成功整合到受体创面床中，依赖于免疫细胞的及时募集、强烈的血管生成反应以及新的细胞外基质形成。目前，由于缺乏可靠的临床前模型，且无法对伤口闭合进行优化的客观评估，针对伤口愈合关键过程的新型治疗药物的研发受到阻碍。本文介绍一种经济、可重复的实验性全层烧伤创面模型，该模型采用同种异体皮肤移植物进行重建。该烧伤创面在麻醉后的近交系野生型 BALB/C 和 SKH1-Hrhr 背景小鼠背部表面诱导产生。使用直径为 10 mm 的黄铜模板，在 80 °C 预热后，以恒定压力作用 20 秒，形成烧伤。损伤后 24 小时切除烧伤焦痂，并用从遗传背景相似的供体小鼠尾部获取的全层皮肤移植物进行替换。该操作无需特殊设备，手术技术简单易行。该方法可在大多数研究环境中轻松实施和重复。该模型存在一定的局限性。由于技术上的困难，无法获取较薄的断层皮片移植物。本文所述的外科方法仅适用于使用全层皮肤移植物重建烧伤创面，可用于开展临床前治疗试验。

结果表明，所建立的实验方案是一种简单直接的方法，可用于在小鼠体内诱导全层烧伤创面。烧伤通过预热的黄铜模具实现（图1A-C）。烧伤区域呈现为圆形创面，伴有白色焦痂及充血带。烧伤后24小时，烧伤创面面积略有扩大，这是由于已充分描述的“烧伤进展”现象所致，可能与急性炎症反应有关22。清创后，采用同种异体皮肤移植物修复烧伤创面（图3）。烧伤后第7天，创面实现血管化5，提示移植成功。表皮角质形成细胞从邻近受体皮肤迁移，以闭合创面并连接创缘。对创面H&E染色切片的显微分析显示，与烧伤后第3天相比，烧伤后第7天新生表皮长度显著增加（图4B）。在开展大规模研究之前，强烈建议研究人员先进行预实验，以探索新的干预措施、评估可行性，并对方法进行必要的修改以确保可重复性。样本量较小时，难以检测到具有统计学意义的差异；而增加样本量是提高检验统计效能的一种有效方式。例如，若需在组间检测到创面再上皮化速率的统计学显著差异（p &lt; 0.05）（图4），每组应至少包含六至八只小鼠。所有实验应至少重复两次。随着基质生成细胞（如成纤维细胞）从受体组织迁移至移植物中，细胞外基质的关键组分，包括I型胶原和纤连蛋白，在新生基质中呈现高表达（图5）。
<img alt="燃烧装置实验设置，包括数字压力计、温度控制器和黄铜模板。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：燃烧装置设置。（A）燃烧装置的放置与组装。燃烧装置连接至温度控制器，并与数字压力计相连，以便监测压力。燃烧装置悬置于一个可调节的平台上方——该平台为平整表面，用于放置小鼠以诱导烧伤。（B-C）用于诱导创面烧伤的黄铜模板的特写图像。（C）黄铜模板的直径为1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="烧伤诱导过程示意图：铜模板、组织切除、在小鼠模型上移植。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：重现本文所述实验模型所需各步骤的示意图。该操作包含三个主要步骤：（i）使用预热的铜模板诱导烧伤创面；（ii）在烧伤后24小时对手术切除无活力的坏死组织；（iii）采用从供体小鼠获取的全层同种异体皮肤移植物进行外科创面重建。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠皮肤伤口愈合研究，第1-7天，拍摄时使用标尺作为比例参照，观察到愈合进程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠烧伤创面重建的大体观。 烧伤后第0、1、3和7天采用同种异体皮肤移植重建烧伤创面的代表性数码图像。图像中的标尺单位为毫米。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="组织学、再上皮化过程、显微图像、再上皮化、柱状图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：烧伤后第3天和第7天伤口的显微外观。 烧伤后第3天和第7天伤口的H&amp;E染色切片。与（B）第7天的伤口相比，（A）第3天伤口中新表皮的长度（虚线）显著增加。在（A）和（B）中，比例尺为100 µm。（C）伤口再上皮化百分比的图示表示。通过测量烧伤后第3天和第7天新表皮的长度，并以整个伤口长度的百分比表示来评估再上皮化程度。结果以均值±标准误表示（第3天组n = 6只小鼠；第7天组n = 6只小鼠，*p &lt; 0.05；Student t检验）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织学染色，I型胶原，纤连蛋白，马松三色染色，二次谐波生成显微镜" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61339/61339fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：细胞外基质和胶原蛋白I的评估与可视化。 第7天小鼠伤口免疫组织化学分析的代表性图像，染色针对（A）胶原蛋白和（B) 纤连蛋白。注意在细长的梭形I型胶原阳性细胞中呈现强烈的红色染色。注意在第7天伤口真皮层的纤连蛋白阳性细胞中呈现棕色染色。比例尺 = 50 µm 在所有图像中。（A）和（B），e 表示表皮，d 表示真皮。C) 胶原纤维的可视化及胶原沉积的组织学评估。D) 小鼠伤口第7天的代表性TPEF/SHG胶原图像. 使用圆偏振光进行双光子激发荧光/二次谐波（TPEF/SHG）同步采集，并对SHG信号进行阈值处理以获得二值化分布。TPEF图像（绿色）与SHG图像（白色）经伪彩着色后叠加显示。比例尺 = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61339/61339fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本研究旨在建立一种小鼠烧伤创面愈合模型。使用预热的黄铜模板在小鼠背部皮肤上诱导产生热力烧伤。烧伤组织经清创后，覆盖取自遗传背景相似的供体小鼠尾巴的皮肤移植物。

浅表性轻微伤口可一期愈合，且无并发症。深度伤口（如全层烧伤）则通过二期愈合……

本实验的总体目标是建立一种可重复的小鼠全层烧伤创面模型，并采用过敏性皮肤移植物进行修复。皮肤分为两个部分：表皮和真皮。真皮下方为皮下脂肪，其覆盖于骨、肌腱或筋膜之上。烧伤深度的厚度分类常用于界定烧伤损伤的程度。浅表性烧伤仅累及表皮，浅层部分厚度烧伤累及表皮及仅限于乳头层或上层真皮。深层部分厚度烧伤则累及表皮和真皮，包括含有血管、毛囊、皮脂腺及汗腺的网状真皮。全层皮肤烧伤的特点是皮肤全层受累，可能还涉及皮下组织。此类伤口只能通过收缩愈合或植皮修复。本实验的总体目标是建立一个全层皮肤烧伤创面，并采用全层皮肤移植进行修复重建。通过将预热至80摄氏度的圆形黄铜块置于口腔皮肤上持续20秒来实现。烧伤后24小时，手术切除坏死组织。从供体小鼠尾部分离的全层皮肤移植物被覆盖于切除后的烧伤创面。移植物将使用外科粘合剂固定。供体和受体动物均来自同一种近交系小鼠。研究过程中使用活检小鼠。然而，也可使用其他品系的小鼠，包括免疫功能健全的无毛小鼠，这类小鼠在伤口愈合研究中尤为有用。由于无需脱毛，避免了相关炎症反应，且无毛发生长干扰，在进行面积测量及其他类型的显微伤口评估时，不会影响数字图像分析。这一点在感染模型中尤为明显，其中我们将生物体和细菌的悬液应用于伤口表面，并通过检测生物体信号来指示细菌的生长速率。热烧伤损伤装置由一个定制的圆形黄铜块组成，其直径为10毫米，预热至80摄氏度。黄铜块的温度通过红外热成像相机进行验证。为制造全层烧伤创面，将黄铜块以0.15牛顿的恒定压力作用于皮肤20秒，并通过数字压力计进行监测。多模式镇痛是侵入性动物实验操作中疼痛管理的最佳实践。理想的镇痛给药方案应包括预先或操作前给予镇痛药物。在手术前12小时至术后72小时内，将每餐3毫克的对乙酰氨基酚加入饮水中给予小鼠。在手术前30分钟以及术后前72小时每6小时一次，以每克0.05微克的剂量皮下注射布托啡诺。在手术前15分钟，以每千克5毫克的剂量在每只小鼠背部皮下注射利多卡因，并在手术前以及手术后6小时，分别皮下注射200微升含5%葡萄糖的乳酸林格液，以预防脱水。使用10毫克/千克剂量的赛拉嗪和100毫克/千克剂量的氯胺酮进行腹腔注射，对小鼠实施麻醉。可通过夹捏脚趾来评估麻醉深度。麻醉会消除眨眼反射，从而阻止泪膜的更新；而泪膜对于维持角膜水合状态至关重要，暴露在空气中的眼睛会迅速脱水，因此需在眼部涂抹润滑剂以保持角膜的水合状态。用剪刀修剪每只小鼠的背部毛发，然后涂抹脱毛膏持续一分钟以去除残留毛发。将小鼠俯卧位固定于平坦的桌面上，将预先加热至80摄氏度的圆形黄铜块置于背部持续20秒，以制造热损伤。随后将小鼠放回加热垫上以维持体温，防止麻醉剂常见的副作用——低体温的发生。麻醉恢复后，可将小鼠放入单独的笼子中。烧伤诱导24小时后，手术切除坏死组织。从安乐死的供体小鼠尾部采集四块患病皮肤移植物。尽管小鼠尾部的其他部位也可用于该小鼠模型，但人体免疫反应的程度可能因供体皮肤移植物的来源不同而有所差异。例如，与尾部皮肤相比，耳部和背部皮肤已不再常用于移植，且更容易引发强烈的人体免疫反应，可能导致移植排斥。皮肤移植物的厚度也需要考虑，因为它可能是影响皮肤移植物成功植入的关键因素。较厚的皮肤（如背部皮肤）由于组织代谢需求较高，移植失败的概率也相对更高。因此，背部皮肤的变应性皮肤移植成功率低于尾部皮肤移植的报道成功率。麻醉通过吸入5%异氟烷（溶于100%氧气）诱导，氧流量为每分钟4升，随后在手术期间以每分钟2升的流量维持2%异氟烷进行麻醉维持。在操作开始时给予布托啡诺，以提供术后镇痛。使用聚维酮碘对烧伤创面进行预处理，随后用70%酒精处理。用剪刀切除坏死性烧伤组织，以形成圆形全层皮肤缺损，同时去除皮下组织中的肉膜层，以制备稳定的皮肤移植受体床。有作者建议保留皮下组织的肉膜层，因其被认为对移植物的再血管化至关重要。然而，在本例中，该层的活动性及其在移植物与受体床之间可能产生的剪切力可能会带来问题。去除肉膜层并未对移植手术的成功产生不利影响。全层皮片取自安乐死供体小鼠的尾部。沿尾部纵向切开，以便将皮肤与下方的软组织分离。随后将尾部皮肤铺展在装有无菌生理盐水的培养皿中，使用直尺将其切割成圆形片状。然后将移植物转移至另一个含有浸有生理盐水的无菌纱布的培养皿中，并在4°C保存，直至准备进行移植。接着使用外科胶水将移植物固定于受体床部位。轻轻按压供体皮肤移植物与受体创面床之间的间隙，使皮肤边缘对齐。创面使用惰性凡士林纱布覆盖，并加用粘性敷料进行二次包扎。在烧伤后第1、3和7天，对移植创面进行数码拍照。尸检时，将背部烧伤创面外科切除至筋膜层，创面被切成两半，其中一半固定于10%缓冲甲醛中，用于组织学和免疫组织化学处理。皮肤移植物为细胞迁移提供了支架系统。成功的移植物整合依赖于成纤维细胞和角质形成细胞从受体部位有效地迁移至供体移植物中，随后移植物逐渐被降解，并由能够产生细胞外基质的细胞所替代。对大面积伤口的组织切片进行苏木精和伊红染色。伤口苏木精和伊红染色切片的代表性图像显示，与烧伤后第3天相比，第7天近表皮层（以黄色标出）的长度显著增加。为评估再上皮化速率，将近表皮层覆盖的伤口面积表示为整个伤口面积的百分比。细胞外基质是皮肤的非细胞成分，为细胞成分提供结构支架。细胞外基质由纤维蛋白组成，例如胶原蛋白和纤连蛋白。这些分子可促进伤口的成熟，并维持皮肤的结构完整性。通过半定量免疫组织化学法检测I型胶原，以及使用马松三色染色等组织学染色方法，可辅助评估显微照片中细胞外基质的完整性。诸如二次谐波产生显微技术等更为先进的方法已发展成为对胶原结构进行定量分析的有力工具。小鼠皮肤移植为研究移植物在受体部位的整合提供了极具潜力的临床前模型。本研究展示了一种在小鼠模型中成功实施皮肤移植的可靠方法，以及对愈合伤口进行组织学评估的技术。

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科研

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生物学

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