Name: 阳性肽载体软骨内运输特性的特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 了解阳离子肽载体在软骨中的平衡摄取、渗透深度和非平衡扩散率等运输特性表征方法。该体外实验技术有助于设计最佳电荷药物载体，提高软骨疾病治疗效果。

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本工作由美国国防部通过国会指定的医学研究项目（CDMRP）资助，合同号为 W81XWH-17-1-0085，以及美国国立卫生研究院资助项目 R03 EB025903-1。AV 获得东北大学工程学院院长奖学金的资助。

已获得大学批准，允许使用死亡组织进行实验。牛关节从屠宰场商业采购。
1. 软骨组织块提取
<ol>
	<li>使用解剖刀（#10 刀片）切开并去除脂肪、肌肉、韧带、肌腱及其他所有结缔组织，暴露牛膝关节股骨髌骨沟处的软骨。</li>
	<li>使用 3 mm 和 6 mm 的皮肤打孔器，垂直穿入软骨以获取圆柱形软骨组织块。立即将组织块分别放入含有 500 μL 添加了 1% v/v 抗生素-抗真菌剂的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的 48 孔板各孔中。</li>
	<li>将软骨组织块的表层面向下放入切片装置的孔中（图 2）。使用剃刀刀片沿切片装置表面切割组织块，获得包含表层区域的 1 mm 厚软骨组织片。对每个软骨组织块重复此操作。</li>
	<li>将软骨组织片分别储存于含有 500 μL 添加蛋白酶抑制剂的 1× PBS（PBS-PI，每 50 mL 1× PBS 中加入 1 片蛋白酶抑制剂小片）的聚丙烯管中，并于 -20 °C 保存。</li>
	<li>在进行以下每一项运输实验前，将含有组织片的管子置于 37 °C 水浴中解冻 30 分钟。</li>
</ol>
<img alt="带多个孔的板示意图；俯视图显示直径测量值；正视图表示深度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：定制设计的切片夹具。 用于切割直径为3和6 mm软骨外植体的不锈钢切片夹具的设计参数。通过在孔内放置不同厚度的塑料嵌件，以调节切片外植体的厚度。不锈钢圆柱销 &lt;使用直径为1 mm的工具将外植体从固定装置中推出。所有数值均以mm为单位表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 软骨中阳离子肽类化合物的平衡摄取
<ol>
	<li>用洁净的擦拭纸轻轻蘸取软骨组织块（直径 3 mm，厚 1 mm），去除组织表面多余的 1× PBS。使用天平迅速记录每个组织块的湿重，然后立即放入 1× PBS 浸泡液中，以防脱水。</li>
	<li>在 1× PBS-PI 中配制荧光标记 CPC 的 30 μM 溶液（每块组织 300 μL）。使用无 RNase 的聚丙烯管进行重悬。</li>
	<li>在 96 孔板中，将每种 30 μM 的 CPC 溶液各 300 μL 分别加入不同的孔中。避免使用靠近板边缘的孔，以减少蒸发。使用刮铲将每块组织转移至含有溶液的孔中。</li>
	<li>在周围孔中加入 300 μL 的 1× PBS，并用盖子盖住 96 孔板。用封口膜密封板的边缘，以最大限度减少蒸发。</li>
	<li>将 96 孔板置于 37 °C 培养箱内，并放置在摇床上，以减少颗粒沉降。在温和旋转条件下（15 mm 轨道直径，50 rpm）孵育 24 小时，使 CPC 在软骨中达到平衡摄取（图 3）。</li>
	<li>建立荧光强度与 CPC 浓度相关性的标准曲线
	<ol>
		<li>在聚丙烯管中，用 1× PBS-PI 将 CPC 溶液从 30 μM 至 0 μM 进行系列稀释（共 10 次两倍稀释）。确保每种稀释液至少有 500 μL。</li>
		<li>将每种稀释液各 200 μL 加入黑色 96 孔板的连续孔中。另设一排重复加样，以增加样本量。</li>
		<li>使用酶标仪，在荧光标记物的激发和发射波长下测定各样本的荧光值。</li>
		<li>绘制荧光读数与 CPC 浓度的关系曲线，并拟合曲线的线性部分，获得方程。 
		注意：为减少荧光读数的变异性，在制备标准曲线前，应将 CPC 储存液与样品板在相同条件下孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育 24 小时后，从各孔中分别收集平衡后的浸泡液至不同的聚丙烯管中。</li>
	<li>将每种溶液各 200 μL 转移至黑色 96 孔板的不同孔中。在与标准曲线相同的荧光检测条件下测定各样本的荧光值。如有必要，用 1× PBS-PI 稀释样品，确保读数落在标准曲线的线性范围内。</li>
</ol>
<img alt="平衡摄取示意图、培养孔扩散、96孔板、24小时延时" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：平衡摄取实验示意图。将软骨组织块（直径3 mm，厚1 mm）置于96孔板的各个孔中，每孔含有荧光标记的CPC溶液。经过24小时后，软骨组织摄取了CPC，从而降低了周围溶液的荧光强度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. CPCs 在软骨中的渗透深度
<ol>
	<li>在1× PBS-PI中配制荧光标记的CPCs溶液，浓度为30 μM（每块组织外植体300 μL）。使用无RNase的聚丙烯管进行重悬。</li>
	<li>使用手术刀将软骨外植体（直径6 mm × 厚度1 mm）切成两半，制成半圆形薄片。切割过程中，用一层1× PBS-PI保持外植体湿润。</li>
	<li>使用环氧树脂将一块半圆形外植体粘贴至定制的一维转运室的某一孔中央（图4，图5）。确保环氧树脂仅涂抹于外植体的周向（弯曲）侧面。清除孔内多余的胶水，防止其接触软骨的扩散表面，并记录外植体的表浅面位置。</li>
	<li>在软骨外植体两侧各加入80 μL的1× PBS-PI。用移液器从一侧吸取液体并反复吹打，检查是否存在向另一侧的泄漏。若发现泄漏，需重新调整外植体位置并按需补加环氧树脂。</li>
	<li>将面向软骨表浅面的一侧（上游）的1× PBS-PI替换为80 μL的30 μM CPC溶液。在面向软骨深层区域的一侧（下游）保持80 μL的1× PBS-PI。</li>
	<li>小心地将转运室放入可密封的容器中。在容器底部铺一层1× PBS，以防止溶液蒸发。确保上游与下游腔室的溶液之间无直接接触。</li>
	<li>将密封后的容器置于平板摇床上，以减少颗粒沉降。在室温下轻轻旋转孵育4小时或24小时（转速50 rpm，振荡直径15 mm）。</li>
	<li>孵育结束后，将外植体从室中取出，并从其中心部位切下约100 μm厚的切片。 
	注：该横切面应包含软骨的表浅层、中层和深层。</li>
	<li>将切片置于载玻片与盖玻片之间。用一层1× PBS-PI润湿切片，保持其水合状态。</li>
	<li>在10倍物镜下，使用共聚焦显微镜对切片全厚度进行成像，获取荧光图像的z轴层扫（z-stack）数据。</li>
	<li>使用ImageJ软件对z轴层扫图像中的平均荧光强度进行投影，以确定CPCs在软骨中的渗透深度。
	<ol>
		<li>点击 文件 | 打开，打开图像堆栈。</li>
		<li>点击任务栏中的“图像”，在下拉菜单中选择 图像 | 堆栈 | Z轴投影。</li>
		<li>输入从第1层到最后一层的切片编号。在“投影类型”中选择“平均强度”，点击“确定”。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="静力平衡梁示意图；包含尺寸和力作用点的顶视图与侧视图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：定制设计的一维传输室。PMMA 一维传输室的设计参数，包含 6 个独立小室。所有数值均以 mm 为单位。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="穿透深度示意图，SZ区和DZ区，详细尺寸，材料横截面分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：穿透深度研究的示意图。 将软骨组织块（直径6 mm，厚度1 mm）切成两半，并固定在1-D扩散传输小室的中央。将荧光标记的CPC溶液加入与软骨表层区（SZ）接触的小室一侧，将1x PBS-PI加入与软骨深层区（DZ）接触的小室一侧。扩散完成后，使用共聚焦显微镜对软骨横截面（3 mm × 1 mm）进行成像。该图已根据Vedadghavami等4和Bajpayee等3的文献修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
4. 软骨中CPCs的非平衡扩散速率
<ol>
	<li>将定制设计的运输室的两半（图6）合拢，组装并关闭腔室。使用垫圈、螺母和螺栓，用扳手将腔室紧密固定。 
	注意：运输室必须为半透明材质，以免干扰荧光读数。本实验方案中使用的运输室由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成。</li>
	<li>用1×PBS中的0.5% w/v脱脂牛乳溶液（每个腔室2 mL）润洗腔室内腔，孵育15分钟，以防止CPCs非特异性结合到腔室壁上。随后用1×PBS（每个腔室2 mL）冲洗腔室。</li>
	<li>使用定制设计的切片夹具（图2）和剃刀刀片，将直径为6 mm的软骨组织块沿横断面切至500–800 μm厚度，需包含表层区域。用1×PBS保持组织块湿润。</li>
	<li>使用锤击式或皮肤打孔器，从橡胶片上制备垫圈，如图7所示。</li>
	<li>将每个半腔室依次组装，每侧包含1个大橡胶垫圈、1个PMMA插件和1个小橡胶垫圈。将组织块置于塑料插件的孔中，确保表层区域朝向上游腔室。将两个半腔室对合，完成组装，并用扳手拧紧螺钉（图7）。</li>
	<li>向上游腔室中加入2 mL 1×PBS-PI，观察下游腔室是否有液体渗漏。若出现渗漏，需重新组装腔室，调整垫圈位置并拧紧螺钉。若无渗漏，则同样向下游腔室加入2 mL 1×PBS-PI。</li>
	<li>在上下游腔室中各加入一个微型搅拌子，并将腔室置于搅拌台上。调整腔室位置，使分光光度计的激光束聚焦于下游腔室中心。将分光光度计的信号接收部分置于下游腔室后方（图8）。 
	注意：分光光度计的激光发射器和接收器必须配备适当的滤光片，以激发、发射和接收荧光标记蛋白的信号。实验过程中应使用黑色盒子遮蔽运输腔室，避免外界光线干扰荧光信号。建议用柔性封口膜密封腔室顶部开口，防止蒸发。</li>
	<li>采集下游腔室的实时荧光发射信号，并确保信号稳定至少5分钟。 
	注意：若无定制分光光度计或半透明运输腔室，可从下游腔室取样，使用酶标仪检测荧光强度。</li>
	<li>将预先计算好体积的荧光标记CPCs储备液用移液器加入上游腔室，确保上游腔室中终浓度为3 μM。观察下游荧光信号，待溶质传输的斜率趋于稳定上升。 
	注意：较厚的软骨组织块达到稳态所需时间更长。</li>
	<li>达到稳态后，从上游腔室中取出20 μL液体并加入下游腔室（“加标测试”）。 
	注意：下游腔室的荧光信号将出现明显上升。该操作可用于建立荧光读数与CPC浓度之间的相关性。</li>
	<li>继续采集下游腔室的实时荧光读数。</li>
</ol>
<img alt="机械部件的技术图纸；包含尺寸的顶视图、侧视图和前视图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：定制设计的非平衡扩散传输室。PMMA非平衡扩散传输室的设计参数。该室体必须具有半透明性，以避免干扰荧光读数。完整的传输室由图中所示夹具的两个相同半部分组成。需要两根圆柱形不锈钢销钉（直径约2.94 mm，长约18 mm）以确保腔室两半部分的对齐和完全闭合。在腔室的每个角落加工出四个相同的用于6-32螺纹螺钉的槽，以便通过螺钉紧固组装。所有数值均以毫米为单位。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="软骨外植体运输室的实验装置示意图，包含橡胶垫圈和插件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：非平衡扩散运输室的组装。（A）黑色PMMA插件和（B）大、小橡胶垫圈的设计参数。橡胶垫圈的厚度经过调整，以确保运输室紧密闭合。所有数值均以 mm 表示。（C）示意图显示了将软骨外植体置于中心位置时，运输室两半部分的组装顺序。SZ 表示软骨的表层区，朝向上游腔室。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="非平衡扩散示意图；激光装置；搅拌；扩散室；科学实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig08.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：非平衡扩散实验示意图。将软骨外植体（直径6 mm × 厚度1 mm）置于传输室中央，使其表层面向上游腔室。腔室的上游和下游两侧均加入1× PBS-PI，并使用微型搅拌子混匀。将荧光标记的CPC溶液加入上游腔室，同时用激光照射下游腔室以采集荧光读数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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<li>Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+finite+element+protocol+to+investigate+the+transport+of+neutral+and+charged+solutes+across+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).</li>
<li>Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dynamic+loading+on+solute+transport+through+the+human+cartilage+endplate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate.</a> Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).</li>
<li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+interactions+enable+rapid+penetration%2C+enhanced+uptake+and+retention+of+intra-articular+injected+avidin+in+rat+knee+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research+%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints.</a> Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).</li>
<li>Bajpayee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+intra-cartilage+delivery+of+low+dose+dexamethasone+using+a+cationic+carrier+for+treatment+of+post+traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis.</a> European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).</li>
<li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+Mice%2C+Men+and+Elephants%3A+The+Relation+between+Articular+Cartilage+Thickness+and+Body+Mass%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass.</a> PLoS One. 8 (2), 57683(2013).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法与实验方案对靶向递送药物至带负电荷组织领域具有重要意义。由于这些组织内含有高密度的带负电荷聚集蛋白聚糖（aggrecans），形成了一道屏障，阻碍药物到达深藏于基质中的细胞靶点。为应对这一突出挑战，可通过改造药物，使其结合带正电荷的药物载体，从而增强药物在组织内的转运速率、摄取效率及结合能力1,3,4,14,15,16,17,18,19。如本研究中所展示的方法所示，可对带正电荷药物载体的转运行为进行表征，以确定其平衡摄取量、穿透...

将药物递送至体内带负电荷的组织仍然是一项挑战，原因是药物难以深入渗透到组织内部，从而无法到达细胞和基质中的靶向作用位点1。许多此类组织含有密集排列的带负电荷的聚集蛋白聚糖（aggrecans），在组织内形成高密度的负固定电荷（fixed charge density, FCD）2，从而成为大多数大分子药物递送的屏障3,4。然而，在带正电荷的药物载体辅助下，这种带负电荷的组织屏障反而可通过静电相互作用转变为药物储库，实现持续性的药物递送1,5,6,7（图 1）。
<img alt="关节内注射示意图；股骨-胫骨关节中的滑液，软骨结构细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：基于电荷的软骨内CPC递送。 将CPCs注射至膝关节腔内的关节内注射示意图。带正电荷的CPCs与带负电荷的聚集蛋白聚糖（aggrecan）基团之间的静电相互作用，可实现CPCs在软骨组织中的快速且贯穿全层的渗透。该图已根据Vedadghavami等4的文献修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
近年来，研究人员设计出短链阳离子肽载体（CPCs），旨在构建具有小分子阳离子结构域的载体，能够携带较大分子量的治疗药物，递送至带负电荷的软骨组织4。为了有效治疗常见8，9及退行性关节疾病（如骨关节炎，OA）10，药物必须达到治疗浓度并深入渗透至软骨组织内部，因为大部分软骨细胞（软骨细胞）位于该区域11。尽管目前已有多种潜在的疾病修饰类药物，但尚无一种获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，原因在于这些药物无法有效靶向软骨组织12，13。因此，评估药物载体的转运特性对于预测药物是否能够引发有效的治疗反应至关重要。本文中，我们设计了三种独立实验，可用于评估CPCs的平衡摄取量、渗透深度以及非平衡状态下的扩散速率4。
为了确保软骨内有足够的药物浓度以产生最佳治疗效果，设计了摄取实验来定量测定软骨中达到平衡时的CPC浓度4。在此实验设计中，当软骨与其周围溶液达到平衡后，可通过摄取比来确定软骨内溶质的总量（包括与基质结合的或游离的）。该比值通过将软骨内溶质浓度与平衡溶液中的浓度进行归一化计算得到。理论上，中性溶质在穿过软骨时不受电荷相互作用的促进，其摄取比小于1；相反，阳离子溶质由于静电相互作用增强了转运，表现出大于1的摄取比。然而，正如CPC所示，采用适当的正电荷可使摄取比显著提高（大于300）4。
尽管软骨内较高的药物浓度对于实现治疗效果至关重要，但药物扩散至软骨全层同样关键。因此，必须开展评估药物渗透深度的研究，以确保药物能够深入软骨内部，从而到达基质和细胞靶点，提供更有效的治疗。本实验旨在评估溶质单向通过软骨的扩散情况，模拟体内关节腔注射后药物向软骨内的扩散过程。利用共聚焦显微镜进行荧光成像，可评估药物向软骨内部的渗透深度。颗粒的净电荷在调节药物在基质中扩散深度方面起着关键作用。根据组织固定电荷密度（FCD）确定的最优净电荷，可使阳离子颗粒与带负电的组织基质之间发生弱可逆结合。这意味着任何结合都足够弱，使颗粒能够从基质上解离，但又具有可逆性，从而可在组织更深层的另一个基质结合位点重新结合4。相反，颗粒过高的净正电荷会阻碍扩散，因为与基质结合过强，导致颗粒无法从软骨表层区域的初始结合位点解离。这将导致生物学效应不足，因为大部分靶点位于组织深层11。
为了进一步量化结合相互作用的强度，分析药物在软骨中的扩散速率具有重要意义。非平衡扩散研究可实现对不同溶质实时扩散速率的比较。当药物在软骨的表层、中层和深层扩散时，结合相互作用的存在会显著改变其扩散速率。当药物与软骨基质之间存在结合相互作用时，其扩散速率被定义为有效扩散系数（DEFF）。在此情况下，当所有结合位点均被占据后，药物的扩散速率由稳态扩散系数（DSS）决定。通过比较不同溶质的有效扩散系数（DEFF），可确定其与基质结合强度的相对大小。对于特定溶质，若其 DEFF 与 DSS 处于同一数量级，则表明药物在扩散过程中与基质之间的结合作用极弱；然而，若 DEFF 大于 DSS，则说明溶质颗粒与基质之间存在显著的结合作用。
所设计的实验可分别用于表征溶质在软骨中的转运过程，但要设计出具有最优电荷的药物载体，还需综合所有实验结果进行整体分析。电荷相互作用的弱性和可逆性可调控颗粒的扩散速率，并实现软骨内较高的平衡摄取量以及快速的全层渗透。通过平衡摄取实验，应筛选出因电荷相互作用而表现出高摄取量的载体，该特性可通过非平衡扩散速率研究加以验证。然而，这些结合相互作用必须具有弱性和可逆性，以允许溶质在软骨中实现全厚度渗透。理想的药物载体应具有最优电荷，既能产生足够强的结合以实现高效摄取和软骨内高药物浓度，又不至于过强而阻碍全层扩散4。本研究所提供的实验方法将有助于指导基于电荷的组织靶向药物载体的设计。这些实验方案曾用于表征CPC在软骨中的转运过程4，但同样可广泛应用于其他药物及药物载体在软骨及其他带负电荷组织中的转运研究。

<table><tbody><tr><td>316不锈钢SAE垫圈</td><td>McMaster-Carr</td><td>91950A044</td><td>适用于5号螺丝，内径0.14&quot;，外径0.312&quot;</td></tr><tr><td>96孔聚苯乙烯板</td><td>Fisherbrand</td><td>12566620</td><td>黑色</td></tr><tr><td>厚规格丙烯酸板材</td><td>Reynolds Polymer</td><td>N/A</td><td>用于非平衡扩散和一维扩散传输室</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>100倍浓度</td></tr><tr><td>牛软骨</td><td>Research 87</td><td>N/A</td><td>2-3周龄，股骨髌骨沟来源</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP671-1</td><td></td></tr><tr><td>CPC+14</td><td>LifeTein</td><td>LT1524</td><td>定制设计肽段</td></tr><tr><td>CPC+20</td><td>LifeTein</td><td>LT1525</td><td>定制设计肽段</td></tr><tr><td>CPC+8</td><td>LifeTein</td><td>LT1523</td><td>定制设计肽段</td></tr><tr><td>精密任务擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>皮肤打孔器</td><td>MedBlades</td><td>MB5-1</td><td>3、4和6 mm</td></tr><tr><td>经济型普通玻璃显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12550A3</td><td></td></tr><tr><td>平底细胞培养板</td><td>Corning Costar</td><td>3595</td><td>透明，96孔</td></tr><tr><td>柔性包裹膜</td><td>Bemis Parafilm M Laboratory</td><td>1337412</td><td></td></tr><tr><td>Gold Seal盖玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>6378701</td><td>#1.5，18x18 mm</td></tr><tr><td>锤击式打孔器</td><td>McMaster-Carr</td><td>3427A15</td><td>1/2&quot;直径</td></tr><tr><td>锤击式打孔器</td><td>McMaster-Carr</td><td>3427A19</td><td>3/4&quot;直径</td></tr><tr><td>激光器</td><td>Chroma Technology</td><td>AT480/30m</td><td>分光光度计激光光源</td></tr><tr><td>低强度钢六角螺母</td><td>McMaster-Carr</td><td>90480A007</td><td>6-32螺纹规格</td></tr><tr><td>LSM 700共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>微型磁力搅拌子</td><td>Bel-Art Spinbar</td><td>F37119-0007</td><td>7x2 mm</td></tr><tr><td>多用途氯丁橡胶片材</td><td>McMaster-Carr</td><td>1370N12</td><td>1/32&quot;厚度</td></tr><tr><td>脱脂干牛乳粉</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7409</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CGN1802145</td><td>150 mm直径</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-040-CMR</td><td>1倍浓度</td></tr><tr><td>板式振荡器</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32953</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Fisherbrand</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>薄规格R-Cast丙烯酸板材</td><td>Reynolds Polymer</td><td>N/A</td><td>黑色传输室插件</td></tr><tr><td>RTV硅胶</td><td>Loctite</td><td>234323</td><td>环氧型，无腐蚀性，透明</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>TedPella</td><td>549-3</td><td>#10、#11刀片</td></tr><tr><td>信号接收器</td><td>Chroma Technology</td><td>ET515lp</td><td>分光光度计激光信号接收器</td></tr><tr><td>带盖微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>TedPella</td><td>13508</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1微孔板读数仪</td><td>Biotek</td><td>H1M</td><td></td></tr><tr><td>镀锌合金钢内六角螺钉</td><td>McMaster-Carr</td><td>90128A153</td><td>6-32螺纹规格，1&quot;长</td></tr></tbody></table>

阳离子肽载体在软骨内转运特性的表征

Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers

体内多种带负电荷的组织（如软骨）由于富含带负电荷的聚集蛋白聚糖，对靶向药物递送形成屏障，因此需要改进的靶向方法以提高其治疗效果。由于软骨具有较高的固定负电荷密度，可通过将药物与带正电荷的药物载体结合，利用静电相互作用增强药物在软骨内的传输。因此，研究药物载体的传输行为对于预测药物诱导生物学反应的效能至关重要。本文展示了三种实验的设计方法，可用于定量测定阳离子肽类载体在软骨组织片中的平衡摄取量、渗透深度以及非平衡扩散速率。平衡摄取实验可测量软骨内部溶质浓度相对于周围溶液的比值，有助于预测药物载体在软骨中提高治疗浓度的潜力。利用共聚焦显微镜进行渗透深度研究，可实现溶质从软骨表层向深层区域一维扩散的可视化表征，这对于评估溶质是否到达其基质及细胞靶点具有重要意义。使用定制设计的传输室进行非平衡扩散速率研究，可通过表征荧光标记溶质在组织中扩散速率的方式，测量其与组织基质结合相互作用的强度，这对设计与软骨具有最佳结合强度的载体具有重要价值。综合这三种传输实验所得结果，可为设计具有最优电荷特性的药物载体提供指导，以利用弱且可逆的电荷相互作用实现药物递送应用。这些实验方法还可用于评估药物及药物-药物载体偶联物的传输特性。此外，这些方法也可拓展应用于其他带负电荷组织（如半月板、角膜和玻璃体）的靶向研究。

在软骨达到平衡吸收CPCs后，当溶质被组织摄取时，浴液的荧光强度会下降。然而，如果终末浴液的荧光值与初始值相近，则表明溶质几乎没有被摄取。另一个确认溶质摄取的依据是，组织是否明显变为荧光染料的颜色。软骨中溶质的定量摄取通过摄取率（RU）来确定，首先利用标准曲线将荧光值转换为浓度。根据初始浴液浓度（CBath,i）和平衡时浴液浓度（CBath），可按以下公式计算软骨内的溶质浓度（CCartilage），其中VBath=300 μL：
<img alt="软骨浓度的静态平衡方程；公式涉及溶液浓度和体积。" src="/files/ftp_upload/61340/61340equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 1">
使用 CCartilage 和...

本方案用于测定阳离子肽类载体在软骨中的平衡摄取量、渗透深度以及非平衡扩散速率。表征其转运特性对于确保产生有效的生物学响应至关重要。这些方法可用于设计具有最优电荷的药物载体，以靶向带负电荷的组织。

体内一些带负电荷的组织（如软骨）由于富含负电荷，密度较高，对靶向药物递送构成了屏障……

表征治疗药物及其载体的转运特性对于确保有效的生物学反应至关重要。这些方法有助于设计出具有最佳电荷的药物载体，以靶向带负电荷的组织。这些技术的主要优势在于能够通过一系列体外实验来表征溶质在组织中的转运过程，从而更准确地预测药物在体内的治疗效果。由于药物难以穿透致密且无血管的软骨基质，软骨疾病（如骨关节炎）至今仍缺乏有效治疗，因此需要药物载体以延长治疗效果。首先使用精细任务擦拭纸轻轻去除直径3毫米、厚度1毫米的软骨外植体表面多余的PBS。用天平迅速记录每个外植体的湿重，并立即将外植体放入PBS浴液中，以防脱水。接下来，向96孔板内孔中每孔加入300 µL新配制的30 µmol荧光标记阳离子肽载体溶液，并用刮勺将一个组织块加入每孔溶液中。向周围各孔中每孔加入300 µL PBS，并用盖子盖住板子。用封口膜密封板子边缘以减少蒸发，然后将板子置于37 °C培养箱中的摇床上，以每分钟50转、15 mm轨道直径的条件孵育24小时。孵育结束后，将每个孔中的平衡缓冲液转移至单独的聚丙烯管中，并从储备的30 µM阳离子肽载体溶液进行系列稀释，以制备标准曲线。然后，将每种溶液及标准品各200 µL转移至黑色96孔板的各个孔中，根据荧光标记物的激发和发射波长，测定每个样品和标准品的荧光值。为确定阳离子肽载体在软骨组织块中的渗透深度，使用手术刀将直径6 mm、厚度1 mm的软骨组织块切成两半，并用添加了蛋白酶抑制剂的PBS水化所得的半圆片状组织。将环氧树脂涂抹至定制的一维转运室小孔的中心，将半圆盘状组织块固定于小孔中，使组织块的浅层侧朝向室的上游侧。清除小孔中多余的胶水，以防止其接触软骨的扩散表面区域，并在组织块两侧各加入80 µL添加了蛋白酶抑制剂的PBS。用移液器在组织块一侧反复吹打液体，检查是否存在向另一侧的泄漏。若无泄漏，将上游侧含有蛋白酶抑制剂的 PBS 替换为 80 微升 30 微摩尔荧光标记的阳离子肽载体溶液，并小心地将转运室放入细胞培养皿中。用 PBS 覆盖培养皿底部，以防止阳离子肽载体溶液蒸发。注意确保上游室和下游室的溶液之间无直接接触。将加盖的培养皿置于摇床上，在室温下以每分钟50转、15毫米轨道直径的条件振荡4或24小时，以减少颗粒沉降。孵育结束后，取出组织块，从每个组织块中心部位切下约100微米厚的切片。将每片组织置于载玻片与盖玻片之间，用新鲜添加蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液（PBS）润湿切片。将玻片固定在共聚焦显微镜的载物台上，以10倍放大倍数对切片的完整厚度进行Z轴层扫，获取荧光图像的Z轴序列。打开图像文件并导入ImageJ，点击“图像”菜单，从下拉菜单中选择“堆栈”中的“Z轴投影”。然后输入从第一层到最后一层的切片编号，在“投影类型”下选择“平均强度”，点击“确定”。为了评估非平衡阳离子肽载体在软骨中的扩散速率，将运输室的每一半进行组装，包括一个大橡胶垫圈、一个聚甲基丙烯酸甲酯插件和一个小橡胶垫圈。测量软骨外植体的厚度，然后将外植体放置在塑料插件的孔中，使表层面向上游室，并将两半夹紧组合以完成装配。使用扳手将两半紧密地拧紧，然后向上游室中加入两毫升含有蛋白酶抑制剂的 PBS 溶液。检查下游室是否存在来自上游室的泄漏。若未检测到泄漏，则向下游室中加入两毫升含蛋白酶抑制剂的 PBS。在上游室和下游室中各加入一个微型搅拌子，并将装置置于搅拌台上，调整位置，使分光光度计的激光束对准下游室的中心。将分光光度计的信号接收部分置于下游腔室后方，持续采集至少五分钟稳定、实时的下游荧光发射信号。获得稳定读数后，向上游腔室中加入预先计算好体积的荧光标记阳离子肽载体储备液，使其终浓度达到3 µM，并在溶质转运斜率趋于稳定上升的过程中持续监测下游荧光信号。当达到稳态后，从上游腔室转移20 µL溶液至下游腔室进行加标测试，并采集实时的下游荧光读数。正电荷过高会限制溶质向软骨组织表层区域的渗透，因为载体与软骨基质中带负电荷的聚集蛋白聚糖（aggrecan）基团结合过强。相反，能够利用弱且可逆电荷相互作用的载体则可穿透至组织的深层区域。然而，理想的药物载体不仅应能渗透至组织深层，还应表现出较高的组织内摄取率，该参数可通过平衡浴液的荧光测量值与组织湿重来确定，如图所示。非平衡扩散传输实验产生的数据曲线具有逐渐增大的斜率。曲线的初始部分代表溶质在软骨中的扩散过程，此时发生溶质与基质的结合相互作用。一旦溶质到达下游腔室，随着时间推移荧光读数增加，曲线的斜率也随之增大。曲线的第二部分随后达到一个稳定的斜率，代表稳态扩散。在曲线的稳态部分作切线，其在X轴上的截距表示达到稳态扩散所需的时间，即滞后时间（tau lag）。当溶液从上游腔室转移至下游腔室后，可观察到荧光信号的急剧上升，此时稳定的荧光强度可用于建立荧光信号与浓度之间的关联关系。随后可按照所示方法计算出代表性的有效扩散系数和稳态扩散值。需要注意的是，由于所有基于电荷的结合位点均已被占据，稳态扩散系数比有效扩散系数高出两个数量级。因此，在此情况下，扩散行为主要取决于分子大小而非电荷，导致相同尺寸的阳离子聚合物胶束（CPC）具有相似的稳态扩散值。在整个实验过程中，保持外植体的水合状态并尽量减少溶液蒸发，以分别防止软骨形态和溶液浓度发生变化，确保获得准确且可重复的数据。在设计出具有最佳电荷的药物载体后，可采用多种偶联技术对药物进行修饰，以增强其对组织的靶向性，并促进对其生物学功效的评估。

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科研

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生物工程

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关键词：类器官，结直肠癌，SW1222细胞系，自组装肽，三维细胞培养，肿瘤模型，细胞外基质，癌症研究

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阳离子肽载体在软骨内转运特性的表征

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