Name: 使用组合前体同位素标签和同位素标记 （cPILOT） 实现自动样品多路复用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 了解组合前体同位素标签和同位素标记（cPILOT）自动化样品多路复用技术，用于高通量蛋白质组学研究。该方法可并行处理多个样品，提高分析效率与准确性，适用于阿尔茨海默病等神经退行性疾病研究。

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作者感谢范德堡大学的启动资金以及美国国立卫生研究院（NIH）授予 RASR 的资助（项目编号：R01GM117191）。

所有动物实验方案均经匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准。一只雄性对照小鼠（C57/BLJ）从商业渠道购得，并饲养于匹兹堡大学实验动物资源部。小鼠可自由摄取标准啮齿类动物实验室饲料，并维持在12小时光照/12小时黑暗的循环环境中。肝脏组织被采集后于−80 °C保存。
1. 蛋白质提取
注意：这些步骤需手动操作。
<ol>
	<li>用生理盐水清洗小鼠肝脏（100 mg），并使用机械匀浆器在500 µL 8 M 脲溶液中进行匀浆，采用A型裂解珠，以4 m/s速度处理20秒。 
	注意：本研究中未添加蛋白酶或磷酸酶抑制剂，但可根据实验需要在缓冲液中添加。此外，可根据不同样本类型相应调整蛋白质提取步骤。</li>
	<li>将组织匀浆液转移至新的微量离心管中，用100–500 µL含8 M 脲的PBS冲洗并合并裂解管中的液体。</li>
	<li>将匀浆后的组织在12,800 × g、4 °C条件下离心15分钟，并收集上清液。 
	注意：后续所有步骤均在用户实验室现有的自动化液体处理机器人上进行。该液体处理系统必须能够从ANCI指定类型的板中吸取和分配缓冲液，并尽可能减少人工干预。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。</li>
	<li>开启PPA、加热/冷却装置及真空泵，并将所有配件与液体处理系统连接。当液体处理系统与计算机连接并准备就绪时，会显示蓝灯。</li>
	<li>向试剂板1（96孔板）中分别在第1、2、3行加入30 µL 25 mM 1,4-二硫苏糖醇（DTT）、25 mM 半胱氨酸30 µL和25 mM 碘乙酰胺（IAA）30 µL。</li>
	<li>向储液板中加入8 M 脲和含10 mM CaCl2的20 mM Tris缓冲液（pH 8.2）。向2 mL深孔板中加入500 µL 5% 甲酸，向胰蛋白酶板第1行加入20 µL 胰蛋白酶，并按方法指定位置放置于仪器平台。 
	注意：IAA和胰蛋白酶应在加入样本前预先加入96孔板中。</li>
	<li>将300 µL肝匀浆液分装至500 µL离心管中，置于2 mL深孔板上，并于4 °C保存直至实验开始。本实验中，单次肝匀浆液共制备22份分装样品。 
	注意：&#160;加入内标质量控制标准品（如牛α-酪蛋白或其他外源性蛋白），比例为1 µg 标准品 : 100 µg 蛋白质样品。</li>
	<li>根据表1中定义的变量名称和数值，确定需加入样本中的缓冲液体积。依据BCA结果，在电子表格中输入样本体积及归一化缓冲液（8 M 脲）体积，并导入软件（表2）。 
	注意：若蛋白浓度过高，可能需要进一步用缓冲液稀释。本实验中肝组织样本最终浓度为10 µg/µL。缓冲液体积按100 µg蛋白质进行优化。</li>
	<li>从4 °C取出样本管，放置于自动液体处理系统的指定平台位置，静置回温10分钟。</li>
	<li>打开方法程序，按照提示将所需移液吸头（1070、90和230 µL）及实验耗材放置到指定位置。待所有耗材和吸头就位后，对照最终平台布局进行核对，点击下一步继续执行实验流程。 
	注意：引导式设置会根据实验流程和平台位置提示用户向特定耗材中加入指定体积的缓冲液。</li>
</ol>
2. 样品还原、烷基化和消化
<ol>
	<li>装载 230 µL 吸头，从储液槽中吸取 90 µL 的 8 M 尿素，并将其分配至黑色 2 mL 深孔板的第 1 行。卸下吸头。重复此步骤，直至将 8 M 尿素加入对应 22 个样品的所有孔中。 
	注意：变性缓冲液可解开蛋白质的三维结构，使其呈现一级结构，从而使胰蛋白酶能够有效作用并切割蛋白质。八通道移液器可为 8 个通道分别吸取不同体积，并可将液体分配至实验耗材中的不同位置。在此步骤中，所有通道吸取的体积均如软件中所设定的一致。</li>
	<li>加入变性缓冲液后，装载 90 µL 吸头，使用八通道移液器吸取 10 µL（相当于 100 µg）小鼠肝脏匀浆液，并将其转移至黑色 2 mL 深孔板中。卸下吸头。重复此步骤，直至所有 22 个样品均完成转移。</li>
	<li>每次转移后，执行混匀步骤：反复吸取并排出孔内液体 50 µL，共三次，以确保蛋白质与缓冲液充分混合，达到 1:1 的比例。 
	注意：将储备的匀浆样品取出并置于 -80 °C 保存。</li>
	<li>为还原已变性的蛋白质，装载一排 90 µL 吸头，从试剂板 1 中吸取 3 µL DTT，并将其分配至黑色 2 mL 深孔板的第 1 和第 2 行，然后卸下吸头。 
	注意：蛋白质与 DTT 的摩尔比维持在 1:40，以实现二硫键的还原。该摩尔比的计算基于牛血清白蛋白（BSA）的分子质量，即 66.5 × 103 g/mol。</li>
	<li>用铝箔密封样品板，在加热/冷却装置上于 37 °C、300 rpm 条件下孵育 600 秒。</li>
	<li>在使用前，向试剂板 1 的第 3 行加入 30 µL 的 0.25 M IAM，并将其放置于工作台面上。打开样品板的密封，将其放回工作台。 
	注意：IAM 对光敏感。</li>
	<li>装载一排 90 µL 吸头，从试剂板 1 第 3 行吸取 6 µL IAM，并将其分配至样品板的第 1 行，然后卸下吸头。 
	注意：每个样品中蛋白质与 IAM 的摩尔比维持在 1:80。此反应必须在避光条件下进行。</li>
	<li>密封样品板，并在加热/冷却装置上于 4 °C、300 rpm 条件下孵育 30 分钟。 
	注意：密封样品板是为了防止样品暴露于光照、蒸发或从孔中溢出。</li>
	<li>打开样品板密封，装载一排 90 µL 吸头，从试剂板 1 第 2 行吸取 5 µL 半胱氨酸，并将其分配至样品板的第 1 和第 2 行，然后卸下吸头。在室温下孵育 30 分钟。 
	注意：蛋白质与 L-半胱氨酸的摩尔比维持在 1:40。</li>
	<li>将样品板置于轨道摇床上，以 1800 rpm 振荡 30 分钟。</li>
	<li>向样品板的每个孔中加入 800 µL 含 10 mM CaCl2 的 20 mM Tris 缓冲液（pH 8.2），使尿素浓度稀释至 2 M。卸下吸头。 
	注意：高浓度尿素会抑制胰蛋白酶活性，因此必须将其浓度降低至 2 M 以下。本研究中采用的蛋白质与胰蛋白酶的摩尔比为 50:1，消化时间为 14 小时。</li>
	<li>向 96 孔板的第 1 行第 1–12 列中各加入 20 µL 胰蛋白酶，并将其放置于工作台指定位置。</li>
	<li>装载一排 90 µL 吸头，从胰蛋白酶板第 1 行吸取 2 µL 胰蛋白酶，并将其分配至样品板的第 1 和第 2 行，然后卸下吸头。</li>
	<li>密封样品板，并在加热/冷却装置上于 37 °C、600 rpm 条件下孵育 14&#160;小时。</li>
	<li>孵育结束后，打开样品板密封，向深孔收集板的第 3 行第 1–12 列中加入 5% 甲酸，并将其放置于指定工作台位置。</li>
	<li>通过从甲酸板第 3 行吸取 150 µL 的 5% 甲酸，并将其加入样品板的第 1 和第 2 行，以终止消化反应。卸下吸头。</li>
</ol>
3. 脱盐步骤 1
<ol>
	<li>使用含有 20 mg Targa C-18 材料的固相萃取板（SPE 板）对肽段进行脱盐。每次缓冲液置换的体积固定为 600 µL，压力固定为 100 mbar。</li>
	<li>装载 1070 µL 吸头，吸取 600 µL 乙腈并分配至 SPE 板的第 1 和第 2 行。将 SPE 板置于 PPA 上并施加压力。</li>
	<li>使用相同的吸头，吸取 600 µL 乙腈并分配至 SPE 板的第 1 和第 2 行。将 SPE 板置于 PPA 上并施加压力。 
	注意：穿流液可通过抽滤泵排入废液。</li>
	<li>装载 1070 µL 吸头，吸取 600 µL 缓冲液 A（含 0.1 % 甲酸的 100 % 水溶液），并分配至 SPE 板的第 1 和第 2 行。将 SPE 板置于 PPA 上并施加压力。 
	注意：若缓冲液体积未明显减少，可尝试提高压力或延长处理时间。</li>
	<li>装载两行 1070 µL 吸头，吸取 534 µL 消化后的样品，并分配至 SPE 板的第 1 和第 2 行。将 SPE 板置于 PPA 上并施加压力。重复此步骤直至所有样品均被加载。 
	注意：由于加入甲酸后的总体积为 1068 µL，样品分两次加入。</li>
	<li>装载两行已使用过的 1070 µL 吸头，吸取 600 µL 缓冲液 A，并分配至 SPE 板的第 1 和第 2 行。将 SPE 板置于 PPA 上并施加压力。</li>
	<li>重复上述步骤一次，以清洗样品。</li>
	<li>装载一行 1070 µL 吸头，吸取 600 µL 乙腈:水（60:40）溶液，并分配至 SPE 板的第 1 和第 2 行。将 SPE 板置于收集板上方，利用 PPA 施加压力以洗脱肽段。</li>
	<li>重复上述步骤，将肽段洗脱至收集板中。将收集板中的溶液完全干燥后，于 -80°C 保存，待后续处理。</li>
</ol>
4. 二甲基化标记（肽段N端）
<ol>
	<li>在软件中将所需移液吸头（1070、90 和 230 µL）及实验耗材放置到指定位置。所有耗材和吸头就位后，与最终的仪器载架布局进行核对，然后点击 下一步 继续执行实验方案。</li>
	<li>向试剂板 2 中分别向第 1、2、3 和 4 行加入 450 µL 的 1% 乙酸、50 µL 轻型甲醛（CH2O）、50 µL 重型甲醛（13CD2O）和 150 µL 甲酸。</li>
	<li>向试剂板 3 的第 1 和第 2 行各加入 50 µL 轻型 CB，第 3 和第 4 行各加入 50 µL 重型 CB，以及向第 3 和第 4 行加入 50 µL 氨水。</li>
	<li>装载两行 230 µL 吸头，从试剂板 2 的第 1 行吸取 100 µL 的 1% 乙酸，并分配至样本板 2（脱盐步骤的收集板）的第 1 和第 2 行干燥的肽段中，随后在 1800 rpm 条件下定时振荡 5 分钟。</li>
	<li>装载 90 µL 吸头，从试剂板 2 的第 2 行吸取 16 µL 的 60 mM（4%）CH2O（37% wt/v），并分配至样本板的第 1 行。卸下吸头。</li>
	<li>装载一行 90 µL 吸头，从试剂板 2 的第 3 行吸取 16 µL 的 60 mM（4%）13CD2O（20% wt/v），并分配至样本板的第 2 行。卸下吸头。 
	注：本研究中，第 1 行对应轻标记二甲基化样本，第 2 行对应重标记二甲基化样本（见 图 1）。</li>
	<li>装载两行 90 µL 吸头，从试剂板 3 的第 1 和第 2 行分别吸取 16 µL 的 24 mM NaBH3CN 和 24 mM NaBD3CN，并分别分配至样本板的第 1 和第 2 行。</li>
	<li>卸下吸头，并使用轨道振荡器在 1800 rpm 条件下定时振荡 15 分钟。 
	注：加入氰基硼氢化钠会启动反应，因此为减少实验间的变异性，该步骤每批次仅执行一次。</li>
	<li>装载两行 90 µL 吸头，从试剂板 3 的第 3 和第 4 行分别吸取 32 µL 的 1% 氨水（~28–30% v/v），并分别分配至样本板 2 的第 1 和第 2 行。卸下吸头。 
	注：加入氨水可终止反应，因此为减少实验间的变异性，该步骤每批次仅执行一次。</li>
	<li>将等体积的轻标记和重标记（1:1）二甲基化肽段混合，转移至新的 2 mL 深孔板中进行脱盐。 
	注：本研究中，将样本板 2 第 1 行孔内 90 µL 内容物与第 2 行 90 µL 内容物混合至新的 2 mL 收集板（样本板 3）中。轻标记与重标记的混合比例取决于实验设计，本研究采用 1:1 比例。</li>
	<li>装载两行 230 µL 吸头，向混合后的样本中加入 32 µL 的 5% 甲酸，并在 1800 rpm 条件下定时振荡 30 秒。 
	注：二甲基化效率依赖于反应体系的 pH 值，缓冲液 pH 的任何变化均可能导致肽段 N 末端标记不完全。当将肽段 N 末端的二甲基化设为动态修饰进行搜索时，标记效率应高于 97%。本研究中，轻标记和重标记肽段的标记效率分别为 99.7% 和 99.5%。</li>
</ol>
5. 脱盐步骤 2
<ol>
	<li>对合并的样品进行脱盐处理，步骤与步骤1中的脱盐过程类似。</li>
	<li>使用真空浓缩仪将样品板中的样品干燥，并于-80 °C保存，直至后续处理。</li>
</ol>
6. 同重标记（赖氨酸残基）
<ol>
	<li>按照引导的实验耗材设置步骤，放置所需规格的吸头（1070、90 和 230 µL），并加入相应的缓冲液。所有耗材和吸头就位后，对照最终的仪器平台布局图，点击 下一步 继续执行实验方案。</li>
	<li>向4号试剂板的第1行和第2行分别加入250 µL的100 mM三乙基碳酸氢铵（TEAB）和30 µL的羟胺溶液（10% w/v）。根据表3中的电子表格，将TMT管放置在2 mL深孔板中。</li>
	<li>在离心管架中放置一个空的1.5 mL离心管，用于汇集标记后的肽段。将干燥的样品板置于P9位置，TMT处理板置于P14位置。</li>
	<li>为重新溶解肽段，装载230 µL吸头，从TEAB板的第1行吸取100 µL的100 mM三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲液（pH ~8.5），并加入到3号样品板第3行的干燥肽段中。将该板置于振荡器上，以1800 rpm振荡30秒。 
	注意：将100 µg的二甲基化肽段重新溶解至浓度为1 µg/µL。</li>
	<li>装载90 µL吸头，从TMT板的H12孔中吸取10 µL无水乙腈，并分别加入各干燥的TMT管中。</li>
	<li>取下TMT管，涡旋混匀，短暂离心，然后放回深孔板中的原位置。</li>
	<li>装载一排90 µL吸头，从样品板中吸取12.5 µL混合后的二甲基化肽段，加入TMT处理板的第1行，随后卸下吸头。 
	注意：本实验中TMT与肽段的摩尔比维持在1:8。</li>
	<li>装载一排90 µL吸头，从TMT板中吸取10 µL TMT试剂，加入TMT处理板的第1行，卸下吸头后，在1800 rpm条件下定时振荡反应1小时。</li>
	<li>装载一排90 µL吸头，从TEAB板的第2行吸取8 µL羟胺溶液（10% w/v），加入TMT处理板的第1行，卸下吸头后，在1800 rpm条件下定时振荡15分钟。</li>
	<li>将TMT处理板中第1行标记好的肽段各取30.5 µL合并至1.5 mL离心管中。每次转移后均需卸下吸头。</li>
	<li>取出含有合并样品的离心管，干燥以去除乙腈。将肽段重新溶解于含0.1%甲酸的0.2 mL水中，并放回仪器平台。 
	注意：等压标记的标记效率具有pH依赖性，根据制造商说明，标记效率应高于98%。本研究中，终止于赖氨酸的轻标和重标肽段的TMT标记效率分别为99.4%和99.5%。</li>
</ol>
7. 脱盐步骤
<ol>
	<li>对一个样本进行类似于脱盐步骤1的样本脱盐处理。</li>
	<li>将样本干燥后，于-80 °C保存直至分析。</li>
</ol>
8. 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和 MS3
<ol>
	<li>用含0.1%甲酸的质谱级水溶解多肽，获得约1 µg/µL的浓度。使用带有0.65 µm滤膜的微量离心管过滤样品。在12,000 × g下离心3分钟，将滤过液转移至自动进样瓶中。 
	注：如需，此时可测定多肽浓度。需将多肽溶于液相色谱-质谱级水中，并进行BCA多肽定量分析。本研究中未进行多肽BCA测定，所有多肽量均基于初始蛋白质BCA测定结果。</li>
	<li>按如下方式配制流动相缓冲液：含0.1%甲酸的100%（v/v）水溶液（A）和含0.1%甲酸的100%乙腈（B）。</li>
	<li>将1 µL样品注入填充有2 cm C18填料（3 µm，100 Å孔径）的捕获柱中。 
	注：捕获柱上的样品净化条件如下：100% A，10分钟；流速2 µL/min，使用二维液相色谱系统。</li>
	<li>运行分析分离程序。使用内径100 µm、长度26 cm的激光拉制尖端熔融石英毛细管分析柱，填充C18填料（2.5 µm，100 Å）。梯度程序如下：0–10分钟，10% B；10–30分钟，10–15% B；30–75分钟，15–30% B；75–88分钟，30–60% B；88–92分钟，60–90% B；92–99分钟，90% B；99–100分钟，90–10% B；100–120分钟，10% B；流速300 nL/min，总运行时间120分钟。</li>
	<li>在运行分析分离程序的同时，进行质谱仪的数据采集。
	<ol>
		<li>MS一级扫描参数如下：质荷比（m/z）范围375–1,500，分辨率120,000，循环时间3秒（最高速度），自动增益控制（AGC）目标值4.0e5，最大离子注入时间50 ms。</li>
		<li>离子阱CID–MS/MS参数如下：数据依赖采集（DDA），每次触发采集2次MS/MS扫描，隔离宽度2 m/z，归一化碰撞能量（NCE）35%，激活q值0.25，激活时间10 ms，AGC目标值1.0e4，最大离子注入时间100 ms。</li>
		<li>HCD–MS3 SPS 10参数如下：扫描范围100–400 m/z，从属扫描次数10，AGC目标值5.0e4，最大离子注入时间118 ms，HCD碰撞能量55%，MS2隔离窗口2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 数据分析
<ol>
	<li>使用蛋白质分析软件，针对适当的数据库搜索生成的 RAW 文件中的蛋白质和肽段列表。 
	注：本研究中生成的 RAW 文件是针对小鼠 Uniprot 数据库进行搜索的。</li>
	<li>由于一个 RAW 文件中同时包含轻链和重链标记，因此需为每份文件分别设置两个工作流程，用于搜索轻链和重链二甲基化肽段。</li>
	<li>使用以下参数，将 RAW 文件与小鼠 Uniprot 数据库（2019年7月13日版本，共53035条序列）进行比对：胰蛋白酶消化，最多允许两个漏切位点；肽段最小长度为6个氨基酸；母离子质量容差为15 ppm；碎片离子容差为1 Da；静态修饰：轻链二甲基化（+28.031，肽段N端）或重链二甲基化（+36.076 Da，肽段N端）、羧甲基化（+57.021 Da，C）；动态修饰：氧化（+15.995 Da，M）、11重等压标签（229.163 Da，K）；错误发现率（FDR）设为1%；报告离子定量时峰积分容差为30 ppm，积分方法采用最可信质心法。 
	注：重链二甲基化峰还包含另一种修饰，其质量比轻链二甲基化峰高约7 Da（+35.069 Da，肽段N端），因此应额外添加一个搜索节点以包含该修饰。</li>
	<li>基于信号强度进行报告离子定量，设定65% SPS质量匹配，平均信噪比（S/N）为10，不进行同位素校正、归一化和标度调整。 
	注：可根据总肽量或样品中添加的特定蛋白质进行归一化和标度调整。也可在通道中加入质控（QC）样本，利用双尾内部参考标度法实现批次间或批次内归一化18。搜索过程中未提供不同TMT通道的同位素污染信息，建议用户自行添加各报告离子的同位素污染参数。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

cPILOT 是一种增强的多重分析策略，可在单次实验中分析多达 24 个样品。其多重分析能力取决于可用的同位素和等压标记组合的数量。引入能够在一个实验中对 16 个样品进行标记的 TMTpro7 后，可将 cPILOT 的多重检测能力提升至 32-plex。cPILOT 包含多个移液步骤，样品制备过程需要极为谨慎的操作和较高的用户技能。即使由经验丰富的操作者执行，手动操作仍不可避免地存在误差，因此建议在 cPILOT 策略中使用机器人平台处理样品。由于 cPILOT 采用依赖于 pH 的肽段标记方法，因此必须对轻链和重链双甲基化样品组维持适当的 pH 条件。弱酸性至弱碱性 pH 环境可能导致肽段的 N 末端和赖氨酸残基均发生双甲基化。cPILOT 的一个优势在于，由于肽段的 N 末端已被双甲基基团占据，因此仅需使用一半数量的等压标签，从而以一半的成本实现更多样品的标记。在处理较大数量样品时，需确保同一批次中第一个和最后一个样品的试剂作用时间保持一致。使用可同时处理多达 32 个样品的移液分配器时，通过机器人液体处理设备可达到最佳效果。
为了通过cPILOT处理多个样本，对人工操作流程进行了修改以引入自动化。本研究所使用的自动化液体处理机器人配备两个模块，分别具有96通道和8通道移液功能，并配有机械臂，可将微孔板放置于28个可用的板位位置。该液体处理系统集成了正压装置、轨道摇床以及用于对96孔板中样本进行加热/冷却的温控设备。正压装置有助于在固相萃取（SPE）板的纯化过程中实现缓冲液置换，而轨道摇床则用于对样本进行涡旋混合。机器人平台被编程用于向96孔板中吸取和分配缓冲液与样本、孵育、涡旋混合样本以及转移微孔板。对于不同黏度的液体（如乙腈和水），可将相应的移液参数设置编程至方法中。
从BCA法蛋白质定量到使用同重标签（即TMT）对肽段进行标记，cPILOT工作流程在液体处理系统上完成。整个方案采用96深孔板进行，每孔可容纳2 mL。实验开始前配制好缓冲液，并加入96孔板中，以实现样本的并行处理。在本研究中，将22份小鼠肝脏匀浆的工作流程重复样本加入深孔板，并按照cPILOT方案进行处理。最后，将一份由22重等摩尔小鼠肝脏标记肽段组成的混合样本注入质谱仪。对应于样本中肽段丰度的报告离子强度显示，使用液体处理系统处理的样本比手动操作方案具有更低的变异系数（CV）（数据未显示）。该机器人平台还显著提高了样本处理的可重复性。在处理大量样本时，可重复性和稳健性是非常重要的因素。移液误差可能导致对数据的完全误判，而在此，机器人平台实现了较低的样本间变异。此外，使用机器人平台进行cPILOT还减少了样本制备所需时间。例如，在开发自动化方法后，处理22个样本仅需2.5小时，而手动cPILOT则需要7.5小时。我们实验室目前正在进行实验，以进一步评估手动与自动化cPILOT工作流程之间的比较。根据我们实验室此前的报告，手动cPILOT中蛋白质报告离子强度的CV%平均为&#160;20%，部分离群值超过此数值12。
cPILOT 是一种在肽段水平上进行化学衍生化的策略，可适用于细胞、组织和体液等各种样本类型。通过引入自动化，cPILOT 能够增强样本的多重检测能力，从而促进蛋白质组学中的高通量样本多重分析。这种高通量对于进一步推动疾病与生物学机制的理解以及生物标志物的发现至关重要。

基于质谱（MS）的蛋白质组学是识别疾病特异性生物标志物、理解疾病进展以及发现治疗靶点的重要研究工具。该技术可应用于多种与疾病相关的临床样本，如血液血清/血浆、邻近体液和组织1,2。近年来，由于样本多重化策略的强大能力，蛋白质组学生物标志物的发现与验证受到广泛关注3,4。样本多重化是一种可在单次质谱进样中同时比较和定量两个或多个样本条件的技术5,6。该技术通过使用化学、酶法或代谢标签对来自多个样本的肽段或蛋白质进行条形码标记，从而在一次质谱或串联质谱（MS/MS）实验中获取所有样本的质谱信息。目前可用的同重标签包括同重标记试剂（iTRAQ）、商业化的串联质谱标签（TMT）以及实验室自制的同重N,N-二甲基亮氨酸（DiLeu）试剂，其多重检测能力分别可达16-plex7和&#160;21-plex8。
结合前体同位素标记与等重标记（cPILOT）是一种增强型样本多重化技术。cPILOT 将肽段N端的同位素标记与轻量[−(CH₂)₀−]、中等[−(CH₂)₁−]和重量[−(CH₂)₂−]丙氨酸丙酮标记相结合，实现高通量定量蛋白质组学中的多重检测。3)2] 和重链 [−(13C2H3)2在低pH（∼2.5）条件下进行同位素标记，以保持赖氨酸残基的可及性，从而用于后续在高pH（8.5）条件下的等压标记，如TMT、DiLeu或iTRAQ标记3,9,10,11,12,13,14cPILOT 策略的双重标记方案如图所示&#160;补充图1 使用两种样本和一个示例肽段，评估基于TMT定量在质谱水平的准确性和精密度2 水平可能会受到影响&#160;由于存在被称为干扰效应的污染性共分离和共碎裂离子15。这种报告离子比例不准确的局限性可通过三合一Orbitrap质谱仪加以克服。例如，可通过在MS阶段对二甲基化峰对中的峰进行隔离来消除干扰效应1 质谱仪中的水平，对轻峰或重峰进行质谱分析2 在线性离子阱中进行碎裂，然后对最强的MS信号进行分析2 用于HCD-MS的片段3 以获取定量信息。为了提高选中不含可用于生成报告离子的赖氨酸胺基肽段的几率，采用选择性质谱3 基于采集的 y-1 片段也可使用，该方法可提高通过 cPILOT 定量的肽段比例9轻标记与重标记的结合使样本多重检测能力相较于单独使用同量异位标签时提升了2倍。我们近期已利用cPILOT技术结合DiLeu试剂在单次实验中实现了多达24个样本的联合分析16此外，cPILOT 已被用于研究氧化性翻译后修饰14 包括蛋白质硝基化17，其他全局蛋白质组9，并已在阿尔茨海默病小鼠模型的多种组织样本中展现出应用价值11.
稳健的样品制备是cPILOT实验中的关键步骤，可能耗时、费力且操作复杂。增强的样品多重检测需要大量的移液操作和高技能的实验人员，且存在多个因素会显著影响实验的可重复性。例如，必须谨慎处理样品，以确保所有样品具有相似的反应时间，并维持轻链和重链二甲基化样品缓冲液的适当pH值。此外，手动制备数十至数百个样品可能引入较高的实验误差。因此，为了减少样品制备的变异性、提高定量准确性并增加实验通量，我们开发了一种自动化的cPILOT工作流程。该自动化通过机器人液体处理设备实现，可完成工作流程中的多个环节（图1）。从蛋白质定量到肽段标记的样品制备均在自动化液体处理平台上完成。该自动化液体处理系统集成了正压装置（PPA），用于固相萃取（SPE）板之间的缓冲液置换，并配备轨道摇床以及加热/冷却装置。该机器人平台具有28个板位，可用于放置微孔板和缓冲液。系统配备两个带夹爪的模块，可在板位之间转移微孔板：一个96通道固定体积移液头（5–1100 µL）和8通道可变体积移液探针（1–1000 µL）。机器人平台由软件控制，操作人员在使用前需接受专业培训。本研究重点在于实现传统手动cPILOT工作流程的自动化，以解决单批次处理超过12个样品时劳动强度大的问题。为了提高cPILOT方法的通量11，我们将cPILOT方案转移至机器人液体处理系统，以实现同时处理10个以上样品。自动化还可在样品制备过程的各个步骤中，对每个样品并行执行一致的反应条件，而这些条件在手动操作的cPILOT中需依赖经验丰富的操作人员才能实现。本方案重点介绍如何使用自动化液体处理设备实施cPILOT实验。本研究详细描述了该自动化系统的操作流程，并通过22重“概念验证”分析小鼠肝脏匀浆样品展示了其性能表现。

<table><tbody><tr><td>0.6 mL 离心管，500 个装</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td>任何品牌的 0.6 mL 离心管均可满足要求</td></tr><tr><td>0.65 &amp;micro;m Ultrafree MC DV 离心过滤单元</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30DV00</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管，500 个装</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>任何品牌的 1.5 mL 离心管均可满足要求</td></tr><tr><td>2 ml 黑色深孔板</td><td>Analytical Sales and Services, Inc.</td><td>59623-23BKGC</td><td>任何品牌的黑色 96 孔板均可满足要求</td></tr><tr><td>2 ml 透明深孔板</td><td>VWR</td><td>75870-796</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>J.T. Baker</td><td>9508-01</td><td></td></tr><tr><td>乙腈 - 质谱级</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td>4 L 的量并非必需</td></tr><tr><td>Agilent 500&amp;micro;L 板</td><td>Agilent</td><td>203942-100</td><td>用于添加缓冲液的试剂板</td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>Acros Organics</td><td>208-753-9</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵溶液（28 - 30%）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>AL54</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biomek i7 hybrid</td><td>Beckmann</td><td></td><td>任何具备正压操作、加热/冷却及涡旋样品功能的液体处理设备均可满足要求</td></tr><tr><td>C18 填料（2.5 &amp;micro;m，100 &amp;Aring;）</td><td>Bruker</td><td></td><td>该产品已不再由 Bruker 提供。满足上述规格的其他品牌填料亦可使用</td></tr><tr><td>配备板转子的离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>69720</td><td></td></tr><tr><td>Micro 21R 离心机</td><td>Sorval</td><td>5437</td><td></td></tr><tr><td>Dionex 3000 UHPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>该型号已不再提供。任何配备自动进样器的纳米液相色谱系统均可满足要求</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（13CD2O）溶液；D2O 中 20 wt %，D 原子丰度 98%，13C 原子丰度 99%</td><td>Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>596388-1G</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（CH2O）溶液；H2O 中 36.5 - 38%</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>F8775-25ML</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Fluka Analytical</td><td>94318-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Fusion Lumos 质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>该型号已不再提供。其他高分辨仪器（例如 Orbitrap Elite、Orbitrap Fusion 或 Orbitrap Fusion Lumos）均可使用</td></tr><tr><td>盐酸羟胺</td><td>Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>255580-100G</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAM）</td><td>Acros Organics</td><td>144-48-9</td><td></td></tr><tr><td>同重同位素标记试剂盒（TMT 11-plex）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>经 L-1-甲苯磺酰氨基-2-苯乙基氯甲基酮（TPCK）处理的牛胰蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>T1426-100MG</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>168149-25G</td><td></td></tr><tr><td>机械匀浆器（例如 FastPrep-24 5G）</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>pH 10 缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-261</td><td>任何品牌的 pH 10 缓冲液均可满足要求</td></tr><tr><td>pH 7 缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-260</td><td>任何品牌的 pH 7 缓冲液均可满足要求</td></tr><tr><td>pH 计（兼容 Tris）</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-620-183</td><td>任何品牌的 pH 计均可满足要求</td></tr><tr><td>蛋白质分析软件（例如 Proteome Discoverer）</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 ml 储液板</td><td>Agilent</td><td>204017-100</td><td></td></tr><tr><td>氰基硼氘化钠；D 原子丰度 96%，纯度 98% CP</td><td>Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>190020-1G</td><td></td></tr><tr><td>氰基硼氢化钠；试剂级，95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156159-10G</td><td></td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪（Speed-vac）</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD1010</td><td>任何可容纳深孔板的真空离心浓缩仪品牌均可满足要求</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>任何品牌的磁力搅拌器均可满足要求</td></tr><tr><td>Targa 20 mg 固相萃取板</td><td>Nest Group, Inc.</td><td>HNS S18V</td><td>这些为 C18 小柱</td></tr><tr><td>三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲液</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biorad</td><td>161-0716</td><td></td></tr><tr><td>Biomek 24 位试管架支架</td><td>Beckmann</td><td>373661</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Biorad</td><td>161-0731</td><td></td></tr><tr><td>水 - 质谱级</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td>4 L 的量并非必需</td></tr></tbody></table>

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cpilot）实现自动化样本多重分析

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

我们介绍了一种高通量定量蛋白质组学工作流程——组合前体同位素标记与等压标记法（cPILOT），该方法在单次实验中可分别利用串联质谱标签或等压的N,N-二甲基亮氨酸等压标签实现最多22或24个样品的多重检测。这种增强的样品多重检测能力显著减少了质谱采集时间，并提高了昂贵商用等压试剂的使用效率。然而，该策略中手动进行的样品处理和移液步骤可能劳动强度大、耗时较长，并可能引入样品损失和定量误差。通过引入自动化操作可克服这些局限性。本文中，我们将手动cPILOT方案转移至自动化液体处理设备上，能够并行处理大量样品（例如96个样品）。总体而言，自动化显著提升了cPILOT的可行性与可重复性，使得其他研究人员在具备类似自动化设备的情况下也能广泛采用该方法。

图2展示了在22重cPILOT实验（包括流程重复）中，从全部22个报告离子通道鉴定出的一个肽段的代表性质谱数据。图2（上图）显示了一对双电荷峰，其质荷比（m/z）相差4 Da，表明该肽段中引入了一个二甲基基团。轻链和重链二甲基化峰对被分别选择并进行碎裂，以获得该肽段的序列。该肽段的序列为G(二甲基)AAELMQQK(TMT-11重)，对应于甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶蛋白。对轻链和重链二甲基化峰的最强碎片离子（未显示）进一步进行选择，并进行MS3碎裂，其报告离子（m/z 126–131）如图2（下图）所示。报告离子的强度与样品中该肽段的丰度成正比。各样品中肽段丰度的结果表明，该机器人平台的移液能力在22个样品间具有较好的一致性。总体而言，该22重cPILOT实验共鉴定出1326个蛋白（1209个轻链/1181个重链），来源于3098个肽段（6137个轻链/5872个重链）（表4）。图3展示了所有22个通道中log10丰度与总报告离子强度的箱线图，显示了较低的孔间/样本间变异性。通过分析22个样本中每个蛋白的报告离子丰度误差，对整体自动化性能进行了评估。图4显示，使用机器人平台进行样本处理可获得极低的变异系数（CV）值。具体而言，在鉴定出的3098个肽段中，轻链和重链二甲基化肽段的报告离子丰度平均CV值分别为12.36%和15.03%。在这些肽段中，有2032个肽段的报告离子信号高于最低阈值，被认为具有可定量性。
<img alt="小鼠肝脏蛋白质组学工作流程；BCA定量、还原、二甲基化、LC-MS³分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 采用自动化cPILOT方案并行处理22个样品的实验工作流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示用于肽段定量的 MS、MS/MS 数据分析及 m/z 值的质谱图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. 22 个样本中肽段的定量分析。 在 22 重自动化 cPILOT 实验中，对轻链二甲基化（左下）和重链二甲基化（右下）峰进行定量的肽段 G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) 的示例 MS（上图）和 MS3（下图）质谱图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡，ΣFx=0 示意图，同位素分布分析的 log10 丰度箱线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 使用 Proteome Discoverer 2.3 分析22个样本的总报告离子强度与log10丰度的箱线图。 RAW 文件分别对轻链和重链肽段进行两次搜索，蛋白质ID分别以TMT作为动态修饰，肽段N端轻甲基化（+28.031 Da）和重甲基化（+36.076 和 +35.069 Da）作为静态修饰。使用Proteome Discoverer 2.3 运行整合搜索，包含上述所有修饰，以获得所有通道中肽段强度的Log 10 丰度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小提琴图显示蛋白质组学分析中cPILOT轻链和重链检测的变异系数（CV%）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 基于126-131 m/z 通道中报告离子强度总和所得肽段丰度变异系数的小提琴图。 轻链（2373个）和重链（2533个）可定量肽段的平均变异系数（CV）分别为12.36和15.03。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1. 使用单个肽段的cPILOT示意图。 展示两个不同样本的同位素标记以及使用TMT126进行的等重标记，所得混合物被注入质谱仪进行LC-MS3分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>变量名称</td>
			<td>值</td>
			<td>描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DesaltSamp1</td>
			<td>1065</td>
			<td>用于脱盐步骤1的体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DesaltSamp2</td>
			<td>392</td>
			<td>用于脱盐步骤2的体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DesaltSamp3</td>
			<td>100</td>
			<td>用于脱盐步骤3的体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DevMode</td>
			<td>FALSE</td>
			<td>False 将孵育时间缩短至30秒；True 则遵循实验方案中的孵育时间。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>DTT 体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FilterPlate</td>
			<td>Targa</td>
			<td>用于脱盐的板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FilterPlateVol</td>
			<td>600</td>
			<td>脱盐所用体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAWaterWashes</td>
			<td>FALSE</td>
			<td>SPE 板上水洗次数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>碘乙酰胺体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeptideTMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>用于 TMT 标记的肽段体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pressure</td>
			<td>100</td>
			<td>PPA 处的压力（mbar）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempOffSet</td>
			<td>1</td>
			<td>温度变化值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>需添加的等压标签体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisVol</td>
			<td>800</td>
			<td>消化前稀释样品的体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypsinVol</td>
			<td>2</td>
			<td>胰蛋白酶体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UsePopTimer</td>
			<td>TRUE</td>
			<td>True 会显示是否需要对板施加压力的选项</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 自动化cPILOT方案中使用的变量列表。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>稀释液来源</td>
			<td>稀释液孔位</td>
			<td>目标板</td>
			<td>目标孔位</td>
			<td>稀释液体积</td>
			<td>原液来源</td>
			<td>原液孔位</td>
			<td>样品体积</td>
			<td>样品编号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>Samples</td>
			<td>B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 小鼠肝脏匀浆液和8 M尿素的体积。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>源孔1</td>
			<td>源孔2</td>
			<td>报告离子</td>
			<td>目标孔1</td>
			<td>目标孔2</td>
			<td>体积</td>
			<td>样本编号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A5</td>
			<td>C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A7</td>
			<td>C7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4</td>
			<td>E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A9</td>
			<td>C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B4</td>
			<td>D4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6</td>
			<td>D6</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 肽段、蛋白质和肽段谱图匹配（PSMs）的总数。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">自动化 cPILOT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>轻链</td>
			<td>重链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蛋白质</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肽段</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSM</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4. 使用轻链和重链标记样本对等压标签进行条形码标记。

前体同位素标记与等重标记联用技术（cPILOT）是一种增强的样本多重分析策略，能够利用现有的等重标签显著增加可同时分析的样本数量。结合机器人平台的应用，极大地提高了实验通量、重复性以及定量准确性。

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）实现自动化样本多重分析

我们已引入一种高通量定量蛋白质组学工作流程，即联合前体同位素标记与等压标签技术（cPILOT），能够……

我们的自动化cPILOT方案使研究人员能够以高通量方式更便捷地分析样品。这一方法具有重要意义，因为它使我们能够更快地获取有关疾病或不同生理状态的生物学信息。该技术的主要优势在于能够并行处理多个样品，从而在使用高通量样品的同时减少可操作性错误。我们的实验室致力于与衰老和阿尔茨海默病相关的应用研究。然而，该技术也可用于研究任何涉及生物组织的疾病或挑战。首先开启正压装置、加热与冷却设备以及真空泵。将所有配件连接到液体处理仪，当其与计算机连接并准备就绪时，指示灯将显示蓝色。取300 µL肝匀浆液，分装至500 µL离心管中，并置于2 mL深孔板上。在实验方案开始前，将样品保存于4 °C环境中。在软件中打开方法，将所需的吸头和实验耗材放置到指定位置。然后与最终的仪器布局图进行核对，点击“下一步”以继续执行实验方案。装载 230 微升吸头，从储液槽中吸取 90 微升 8 摩尔尿素溶液。然后将其加入黑色2毫升深孔板的第一行。卸下TL1的吸头，并重复此步骤，直至所有孔中均加入尿素。加入变性缓冲液后，使用90微升吸头将10微升小鼠肝脏匀浆转移至深孔板中。卸下移液枪头，然后装载一排90微升枪头，从试剂板1中吸取3微升DTT。将DTT分配至深孔板的第1和第2行。用铝箔密封样品板，并在37摄氏度下孵育600秒，同时以300 RPM转速旋转。孵育结束后，装载一排90微升吸头，从第一试剂板第三行吸取6微升IAM，加入样品板第一行。密封样品板，在冷却装置上以4°C、300 RPM转速旋转孵育30分钟。然后打开样品板密封，装载一排90微升吸头。从第一块试剂板第二行吸取5 µL胱氨酸，加入样本板的第一行和第二行。在室温下孵育30分钟。孵育结束后，以1800 RPM的转速振荡30分钟。然后向样品板的每个孔中加入 800 微升含有 10 毫摩尔氯化钙的 20 毫摩尔 Tris 缓冲液，使尿素浓度稀释至 2 摩尔。向 96 孔板的第一行加入 20 微升胰蛋白酶，并将该板放置在甲板上的指定位置。在向样品板中加入胰蛋白酶后，密封该板，并在加热冷却装置中于 37 摄氏度、600 转/分钟条件下孵育 15 小时。通过从甲酸板的第三行吸取150微升5%甲酸并将其加入样本板的第一行和第二行，终止消化反应。随后进行肽段脱盐。使用1070微升吸头吸取600微升乙腈。然后将液体加入固相萃取（SPE）板的第一和第二排，以活化C-18柱。接着，将消化后的样品分两次上样至SPE板。安装两排吸头，吸取534 µL消化后的样品，转移至SPE板的第一和第二排。对板施加压力，并重复此步骤直至所有样品均完成上样。用水平衡肽段，然后用含0.1%甲酸的60%至40%乙腈溶液稀释肽段。随后将板置于收集板上方，使用正压装置洗脱肽段。吸取流穿液，于软件中设置所需的吸头和实验耗材，并与仪器平台布局核对无误后，点击“下一步”以继续进行二甲基化实验流程。用1%乙酸溶解肽段。为进行二甲基化标记，装载90微升吸头，从第二块试剂板的第二行中吸取16微升60毫摩尔的轻型甲醛。将其加入样品板的第一行，然后卸下吸头。装载一排90微升吸头，从第二试剂板的第三行吸取16微升60毫摩尔的重甲醛。将其加入样品板的第二行，然后卸下吸头。加载两排90微升吸头，从3号试剂板的第一排和第二排分别吸取16微升24毫摩尔的氰基硼氢化钠和24毫摩尔的氰基硼氘化钠，然后将试剂分别加入样品板的第一排和第二排，以启动二甲基化反应。卸下吸头后，使用轨道摇床在1800转/分钟的条件下定时振荡15分钟。然后加载两排90微升吸头，从3号试剂板的第三排和第四排吸取32微升1%氨水。将样本加入第二个样品板的第一和第二行以终止反应。在新的2毫升深孔板中，将等体积的轻链和重链二甲基化肽段混合，用于脱盐。脱盐完成后，将合并的轻链和重链肽段进行真空干燥，并进行同重标记。将肽段与100微升100毫摩尔三乙基碳酸氢铵缓冲液在旋转摇床上重悬。然后使用90微升枪头吸取25微升混合的二甲基化肽段，转移至TMT处理板的第一排。装载一排90微升枪头，吸取10微升TMT试剂。将溶液加入TMT处理板的第一行，卸下吸头，然后在1800 RPM条件下定时振荡一小时。从TEAB板的第二行吸取8微升羟胺，并将其加入TMT处理板的第一行。在1800 RPM振荡15分钟后，将30.5微升TMT标记的肽段转移至1.5毫升离心管中。然后根据论文中的说明进行数据采集和分析。此处展示的是在22重plex联合前体同位素标记与等重标记实验中，从全部22个报告离子通道鉴定出的一个肽段的代表性质谱数据。该肽段的序列对应于甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶。对轻链和重链二甲基化峰中强度最高的碎片离子进一步进行MS3碎裂分析。报告离子的强度与样品中肽段的丰度成正比。总体而言，这种结合前体同位素标记与等重标记的实验方法缩短了样品处理时间，并实现了在多个通道或条件下对蛋白质表达水平的可视化分析。所有22个通道中，以总报告离子强度为基准的log10丰度箱线图显示，孔间或样本间的变异性较低。通过分析22个样本中每种蛋白质的报告离子丰度误差，对整体自动化程度进行了评估。使用机器人平台进行样本处理，所得变异系数极低。在3098种肽段中，轻链和重链二甲基化肽段的报告离子丰度变异系数平均值分别为12.36%和15.03%。在实施本方案时，需注意同位素和同重素标记在同一实验中同时使用，因此必须仔细规划，为每个样本分配实验中拟使用的标签。该方法可轻松整合到其他机器人系统中，并可应用于多种组织样本，例如组织或细胞裂解液以及其他生物液体。

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科研

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化学

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