使用组合前体同位素标签和同位素标记 （cPILOT） 实现自动样品多路复用
December 18th, 2020
组合前体同位素标记和同位素标记 （cPILOT） 是一种增强的样品多路复用策略，能够增加可与可用同位素标记同时分析的样本数量。机器人平台的整合大大提高了实验的吞吐量、可重复性和定量精度。
我们的自动化 cPILOT 协议使研究人员能够更轻松地以高吞吐量的方式分析样品。这一点很重要，因为它使我们能够更快地获得有关疾病或不同条件的生物信息。此技术的主要优点是，它有助于并行处理多个样本，从而减少可操作的错误，同时使用高吞吐量样本。
我们的实验室对与衰老和阿尔茨海默病相关的应用感兴趣。然而，这种技术也可以用来研究任何疾病或挑战，哪里涉及生物组织。首先打开正压装置、加热和冷却装置以及真空泵。
将所有附件与液体处理器连接，一旦连接到计算机并准备好操作，该处理程序将显示蓝光。肝脏的Aliquot 300微升均匀质化成500微升管，并放在两毫升深井板上。将样品存放在摄氏四度，直到协议开始。
在软件中打开方法，将所需的提示和实验室软件放入其位置。然后与最终的卡片组布局交叉检查，然后单击"下一步"以继续协议。从储层装载 230 微升尖端，并吸入 90 微升的 8 个摩尔尿素。
然后分配到一排黑色两毫升深井板。卸载 TL1 的尖端并重复此步骤，直到尿素已添加到所有孔中。添加变性缓冲液后，使用90微升尖端将10微升小鼠肝脏均质质转移到深井板。
卸载尖端，然后加载一排 90 微升尖端，从试剂板一中吸气三微升 DTT。将 DTT 分配到深井板的第一行和第二行。用铝箔密封样品板，并在 37 摄氏度下孵育 600 秒，同时以 300 RPM 旋转。
孵育后，加载一排90微升的吸头，从第三排的试剂板中吸出6微升IAM，然后分配到一排样品板。密封样品板，并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，同时在冷却设备上以 300 RPM 转速旋转。然后解封样品板，并加载一排 90 微升尖端。
从试剂板一排第二排吸出五微升的半胱氨酸，然后分配到样品板的第一排和二排。在室温下孵育板30分钟。孵育后，执行1800 RPM的时时摇动30分钟。
然后加入800微升20毫摩尔三叶草缓冲液，在样品板上的每一个井中加入10毫摩尔氯化钙，将尿素浓度稀释至两个摩尔。将 20 微升的 trypsin 添加到 96 井板的第一排，并将板放在甲板上的指定位置。将 trypsin 添加到样品板后，在加热和冷却装置上密封并孵育 15 小时，温度为 37 摄氏度和 600 RPM。
从甲酸板第三行吸入150微升5%甲酸，并分配到第一排和第二行的样品板，停止消化。继续脱盐肽。使用 1070 微升提示吸气 600 微升的乙酰三叶草。
然后将实相萃取（SPE 板）的第一行和第二行分配，以激活 C-18。接下来，将消化的样品两次加载到 SPE 板上。加载两排吸头，吸进 534 微升的消化样品，然后将它们分配到 SPE 板的第一行和第二行。
向板施加压力，然后重复此步骤，直到加载所有样品。通过用水清洗多肽，用 0.1% 的甲酸稀释 60 至 40 乙酰三叶酸。然后将板放在收集板的顶部，使用正压装置对肽进行分管。
向下绘制流式处理并设置软件中所需的提示和实验室软件，与甲板布局交叉检查，然后单击"下一步"以继续二甲基化协议。在1%醋酸中重组肽。为了执行二甲基化标签，从第二排试剂板二中装载90微升尖端，吸制16微升60毫摩尔光甲醛。
将它分配到一个样品板行，然后卸载尖端。从试剂板第三排装载一排90微升尖端，吸气16微升60毫摩尔重甲醛。分配样品板的第二行并卸载尖端。
从试剂板第三行第一排和二排装载两排90微升尖端，吸气16微升24毫摩尔氰氨化钠和24毫摩尔氰硅二甲二甲酸酯钠，然后将试剂分配到样品板第一排和二排，开始二甲基化反应。卸载尖端并使用轨道摇床在 1800 RPM 下执行 15 分钟的时分抖动。然后从试剂板三行第三排和四排装载两排 90 微升尖端，从试剂板三中吸入 32 微升 1%氨气。
将样品板二排第一行和二排分配，以停止反应。将同等体积的轻质和重二甲基多肽组合到新的两毫升深井板中，用于脱盐。脱盐组合的轻质和重肽后，干燥肽并执行等性标记。
在轨道摇床上用100微升100毫摩尔三乙基碳酸氢基化合物缓冲液重建肽。然后使用 90 微升尖端吸气 25 微升组合的二甲基多肽，并将它们分配到 TMT 加工板的第一排。加载一排 90 微升尖端，并吸入 10 微升 TMT。
在 TMT 加工板的第一行中分配，卸载尖端，然后在 1800 RPM 下执行一小时的时分摇动。从 TEAB 板第二排吸入八微升羟基胺，并分配到 TMT 加工板的一排。在 1800 RPM 下摇动 15 分钟后，将 TMT 标记的肽的 30.5 微升转移到 1.5 毫升管中。
然后根据手稿指示进行数据采集和分析。此处显示了来自 22 Plex 组合前体同位素标记和同位素标记实验的所有 22 个记者离子通道中识别的肽的代表性 MS 数据。肽的序列对应于β氨酸-同型半胱氨酸S-甲基转移酶。
轻和重二甲基化峰最强烈的碎片离子被进一步分离为MS3碎片。记者离子强度与样品中的肽丰度成正比。总体而言，这种组合的前体同位素标记和同位素标记实验缩短了样品处理时间，并使得在多个通道或条件下可视化蛋白质表达成为可能。
所有 22 个通道的日志 10 丰度与总记录器离子强度的框图显示的井间或样本间变异性较小。通过检查22个样本中每种蛋白质中报告离子丰度误差，对完全自动化进行了评估。使用机器人平台进行样品处理，导致变化系数非常低。
在3098肽中，轻二甲基多肽的平均离子丰度变化系数为12.36%和15.03%。在尝试此协议时，必须记住同位素和同位素水平在单个实验中使用。因此，需要执行仔细的规划，以指定每个样本与拟在实验中使用的标记。
这种方法可以很容易地集成到其他机器人系统中，并可以应用于各种组织，如组织或细胞利沙酸盐和其他生物流体。
概览
组合前体同位素标记和等质量标记（cPILOT）协议增强了样本多重化，允许同时分析多个样本。这种方法提高了生物学研究的通量、重复性和定量精度。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 蛋白质组学
背景
- cPILOT将同位素标记与等质量标记整合。
- 它特别适用于研究阿尔茨海默病等疾病。
- 该技术允许对生物样本进行高通量分析。
- 机器人平台提高了协议的效率。
研究目的
- 简化生物样本的分析。
- 减少高通量样本处理中的错误。
- 促进更快地获取与疾病相关的生物信息。
使用的方法
- 使用机器人平台自动化样本准备。
- 对样本处理顺序添加试剂。
- 二甲基化标记后接等质量标记。
- 去盐和肽的纯化以供分析。
主要结果
- 增加样本分析的通量和准确性。
- 成功应用cPILOT研究老化和阿尔茨海默病。
- 证明在样本处理过程中减少了可行的错误。
- 协议允许并行处理多个样本。
结论
- cPILOT是高通量生物学研究的有价值工具。
- 该方法提高了蛋白质组学研究的效率。
- 它在各种疾病研究背景下具有广泛应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Automated cPILOT enables high-throughput, quantitative proteomics by multiplexing up to 24 samples in a single mass spectrometry experiment, directly addressing bottlenecks in sample processing and data acquisition. This workflow reduces manual error, increases reproducibility, and accelerates actionable biological insights for disease-relevant research. Its integration into automated platforms positions it as a scalable solution for enterprise-level discovery and translational pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust quantitative comparison of protein expression across multiple biological conditions or disease models.
- Supports functional target validation by minimizing sample variability and maximizing data consistency.
- Facilitates rapid hypothesis testing through parallelized sample processing and analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, multiplexed samples for downstream mass spectrometry-based screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-throughput assay development.
- Reduces inter-sample variability, supporting reliable compound or biomarker evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns proteomic data generation with disease-relevant tissue and biofluid analysis.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting large-scale, comparative studies.
- Provides quantitative metrics that inform risk-adjusted advancement decisions in translational research.
Pipeline & Workflow Integration
Automated cPILOT fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling multiplexed quantitative proteomics from early target validation through translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of protein expression changes across experimental conditions.
- Screening: Provides assay-ready, multiplexed samples with minimized technical variability.
- Analytics: Generates quantitative reporter ion data for robust statistical comparison of sample groups.
- Translational Research: Facilitates large-scale, disease-relevant proteomic profiling for biomarker discovery.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various tissues, cell lysates, and biofluids, supporting broad R&D portfolio needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein quantitation.
- Operational Value: Standardizes and automates complex sample preparation, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables faster, data-driven go/no-go decisions and enhances capital efficiency in discovery programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of multiple candidates or conditions in parallel.
Implementation Considerations
- Requires expertise in quantitative proteomics and automated liquid handling systems.
- Needs access to compatible robotic platforms and mass spectrometry infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample labeling and tag assignment.
- Adaptable across diverse biological matrices, but careful planning of tag/sample mapping is essential.
- Potential limitations include the need for precise reagent handling and validation of automation protocols.
