从多个中枢神经系统区域解剖和分离小鼠神经胶质细胞

该协议很重要，因为我们正在了解神经胶质细胞在形态学、功能和遗传学上是区域异质性的。这项技术的主要优点是您可以研究来自中枢神经系统四个不同区域的三个独立的神经胶质细胞亚群。演示此程序的是我自己和我实验室的研究生 Rachel Tinky。

用细剪刀沿着幼犬头部的中线剪开皮肤层，从尾部开始，向喙部移动，直到到达鼻子。避免切入颅骨深处，以防止任何组织损伤。将头部向下倾斜，将皮肤层拉到颅骨的每一侧，然后用弹簧剪刀沿着颅骨中线切开，从枕骨大孔开始。

用细尖镊子将颅骨两半拉开，露出皮层、小脑和脑干。暴露后，轻轻地将大脑从颅骨中取出，并将其放入装有 10 毫升 PBS 和抗生素溶液的 10 厘米培养皿中。确保大脑在连接后脑的情况下保持完好无损。

用细弯曲的镊子捏掉小脑。放入指定的 15 毫升冰锥形管中。将中脑与皮层分开。

去除皮质脑膜并将其放入指定的锥形管中。必须仔细检查组织以确保完全去除脑膜。如果脑膜细胞残留在培养物中，它们可能对神经胶质细胞的生长有害。

要解剖脊髓，请将其腹侧朝上放置，并使用细弹簧剪刀剪断椎骨，在左右两侧交替，直到脊髓组织暴露出来。轻轻去除脊髓和脑膜，并将它们放入指定的冰锥形管中。向每根装有组织的试管中加入 1 毫升含 0.53 毫摩尔 EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶。

用 10 毫升移液管研磨混合物约 20 次。然后将细胞悬液转移到空的 50 ml 锥形管中。将溶液在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 15 分钟。

8 分钟后轻轻搅动裂解物。孵育后，向每个试管中加入 5 毫升 MGM 和 200 微升 DNase I 1，最终浓度为 50 μg/mL。用 10 毫升移液管将每种裂解物研磨 10 次。

然后让细胞悬液在室温下静置 3 分钟，让未解离的组织沉淀在试管底部。将细胞悬液转移到新的 50 ml 锥形管中，留下未解离的组织。离心后，将细胞沉淀重悬于 5 ml MGM 中并研磨 20 次将细胞悬液接种在包被的 T25 烧瓶上，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞。

24 小时后更换培养基以去除细胞碎片。要进行少突胶质细胞前体细胞分离，请摇动细胞 15 小时，然后从培养瓶中取出上清液，并将其接种在无菌培养皿上。将上清液在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 30 分钟。

15 分钟后旋转以去除剩余的小胶质细胞。去除非贴壁细胞上清液，对细胞进行计数，并以所需浓度将它们接种在 Poly-D-赖氨酸包被的表面上。将细胞放回培养箱中至少一小时。

然后轻轻吸出 95% 的培养基，缓慢加入温热的 OPC 培养基，将其移液到孔壁上，以尽量减少 OPC 的破坏。该方法用于证明干扰素 γ 信号传导影响 OPC 分化和成熟。没有干扰素 γ 受体，皮质 OPC 不会分化成成熟的髓鞘少突胶质细胞，这可以通过没有 MBP 染色来证明。

还分析了 GFAP 的表达。干扰素 γ 缺陷细胞强烈表达 GFAP，表明它们可能采用星形胶质细胞表型。中枢神经系统细胞的区域异质性表现为皮层、小脑、脑干和脊髓中星形胶质细胞形态的不同。

来自同一区域的星形胶质细胞也可能表现出形态异质性，支持这种神经胶质细胞亚型是高度动态的这一观点。还探讨了 OPCs 对差异细胞因子刺激的区域反应。细胞因子信号转导显着影响干细胞和免疫细胞的行为，并可能影响 OPC 分化为成熟髓鞘少突胶质细胞的方式。

以下区域神经胶质细胞分离细胞可以使用多种技术（包括免疫组织化学、定量实时 PCR 和蛋白质印迹）在各种实验条件和酸中使用。