从多个中枢神经系统区域解剖和分离小鼠神经胶质细胞
June 4th, 2020
在这里，我们提出了一种从小鼠CNS体外分离多个神经胶质细胞群的方案。该方法允许分离区域小胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞和星形胶质细胞，以研究每种细胞在各种培养系统中的表型。
该协议很重要，因为我们正在了解神经胶质细胞在形态学、功能和遗传学上是区域异质性的。这项技术的主要优点是您可以研究来自中枢神经系统四个不同区域的三个独立的神经胶质细胞亚群。演示此程序的是我自己和我实验室的研究生 Rachel Tinky。
用细剪刀沿着幼犬头部的中线剪开皮肤层，从尾部开始，向喙部移动，直到到达鼻子。避免切入颅骨深处，以防止任何组织损伤。将头部向下倾斜，将皮肤层拉到颅骨的每一侧，然后用弹簧剪刀沿着颅骨中线切开，从枕骨大孔开始。
用细尖镊子将颅骨两半拉开，露出皮层、小脑和脑干。暴露后，轻轻地将大脑从颅骨中取出，并将其放入装有 10 毫升 PBS 和抗生素溶液的 10 厘米培养皿中。确保大脑在连接后脑的情况下保持完好无损。
用细弯曲的镊子捏掉小脑。放入指定的 15 毫升冰锥形管中。将中脑与皮层分开。
去除皮质脑膜并将其放入指定的锥形管中。必须仔细检查组织以确保完全去除脑膜。如果脑膜细胞残留在培养物中，它们可能对神经胶质细胞的生长有害。
要解剖脊髓，请将其腹侧朝上放置，并使用细弹簧剪刀剪断椎骨，在左右两侧交替，直到脊髓组织暴露出来。轻轻去除脊髓和脑膜，并将它们放入指定的冰锥形管中。向每根装有组织的试管中加入 1 毫升含 0.53 毫摩尔 EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶。
用 10 毫升移液管研磨混合物约 20 次。然后将细胞悬液转移到空的 50 ml 锥形管中。将溶液在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 15 分钟。
8 分钟后轻轻搅动裂解物。孵育后，向每个试管中加入 5 毫升 MGM 和 200 微升 DNase I 1，最终浓度为 50 μg/mL。用 10 毫升移液管将每种裂解物研磨 10 次。
然后让细胞悬液在室温下静置 3 分钟，让未解离的组织沉淀在试管底部。将细胞悬液转移到新的 50 ml 锥形管中，留下未解离的组织。离心后，将细胞沉淀重悬于 5 ml MGM 中并研磨 20 次将细胞悬液接种在包被的 T25 烧瓶上，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞。
24 小时后更换培养基以去除细胞碎片。要进行少突胶质细胞前体细胞分离，请摇动细胞 15 小时，然后从培养瓶中取出上清液，并将其接种在无菌培养皿上。将上清液在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 30 分钟。
15 分钟后旋转以去除剩余的小胶质细胞。去除非贴壁细胞上清液，对细胞进行计数，并以所需浓度将它们接种在 Poly-D-赖氨酸包被的表面上。将细胞放回培养箱中至少一小时。
然后轻轻吸出 95% 的培养基，缓慢加入温热的 OPC 培养基，将其移液到孔壁上，以尽量减少 OPC 的破坏。该方法用于证明干扰素 γ 信号传导影响 OPC 分化和成熟。没有干扰素 γ 受体，皮质 OPC 不会分化成成熟的髓鞘少突胶质细胞，这可以通过没有 MBP 染色来证明。
还分析了 GFAP 的表达。干扰素 γ 缺陷细胞强烈表达 GFAP，表明它们可能采用星形胶质细胞表型。中枢神经系统细胞的区域异质性表现为皮层、小脑、脑干和脊髓中星形胶质细胞形态的不同。
来自同一区域的星形胶质细胞也可能表现出形态异质性，支持这种神经胶质细胞亚型是高度动态的这一观点。还探讨了 OPCs 对差异细胞因子刺激的区域反应。细胞因子信号转导显着影响干细胞和免疫细胞的行为，并可能影响 OPC 分化为成熟髓鞘少突胶质细胞的方式。
以下区域神经胶质细胞分离细胞可以使用多种技术（包括免疫组织化学、定量实时 PCR 和蛋白质印迹）在各种实验条件和酸中使用。
概览
本研究提出了一种从小鼠中枢神经系统（CNS）中体外分离多种胶质细胞种群的协议，包括区域性小胶质细胞、少突胶质前体细胞和星形胶质细胞。该方法使研究人员能够在各种培养系统下研究每种胶质细胞类型的不同表型，突出了它们的区域异质性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 胶质细胞生物学
背景
- 胶质细胞在形态、功能和遗传学上表现出区域异质性。
- 理解胶质细胞的不同种群对于探索它们在CNS中的作用至关重要。
- 该协议允许研究人员研究不同胶质细胞类型的相互作用。
- 分离不同种群可以提供对它们对CNS功能的具体贡献的见解。
研究目的
- 开发一种从CNS不同区域分离特定胶质细胞种群的方法。
- 研究分离的胶质细胞种群的表型特征。
- 检查少突胶质前体细胞对细胞因子刺激的区域反应。
使用的方法
- 采用体外细胞培养方法进行胶质细胞分离。
- 生物模型包括源自小鼠CNS碎片的胶质细胞。
- 未提及多组学工作流程。
- 关键步骤包括解剖、胰蛋白酶处理和细胞悬浮技术。
- 为获得最佳结果，概述了培养和细胞铺板的时间框架。
主要结果
- 该协议成功地从不同CNS区域分离出不同的胶质细胞种群。
- 研究指出，干扰素γ信号传导影响少突胶质前体细胞的分化。
- 星形胶质细胞根据其CNS起源区域显示出形态异质性。
- 强调了细胞因子信号传导如何影响胶质细胞行为的潜在影响。
结论
- 本研究展示了一种有价值的方法来剖析胶质细胞在CNS功能中的作用。
- 通过使特定的胶质细胞亚群分离成为可能，研究人员可以更好地理解它们的独特贡献。
- 该协议支持未来对胶质细胞动力学及其对环境线索的响应进行调查。
常见问题
Executive Industry Relevance
Regional heterogeneity of glial cells impacts target validation and mechanistic de-risking in CNS drug discovery. This protocol enables isolation of microglia, oligodendrocyte progenitor cells, and astrocytes from four murine CNS regions to support phenotypic screening and assay development. By providing disease-relevant systems with defined cellular composition, it improves predictive confidence in preclinical models and informs lead identification strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glial subset phenotypes across cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord regions to clarify target biology and de-risk mechanistic hypotheses.
- Operational Value: Provides reproducible isolation of microglia, OPCs, and astrocytes for consistent target engagement and pathway modulation studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates regionally defined glial cultures for compound screening and assessment of cytokine-mediated effects on OPC differentiation and maturation.
- Operational Value: Standardizes glial preparation via mechanical dissociation and defined matrix plating to ensure assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports evaluation of regional glial responses to interferon gamma and other cytokines, informing biomarker alignment and pathophysiological relevance.
- Operational Value: Enables co-culture and single-cell-type systems to model glial-neuronal interactions and assess target-mediated outcomes in preclinical workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying validated glial populations for target validation, assay development, and mechanistic de-risking prior to lead identification.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on regional glial heterogeneity and cytokine signaling pathways in CNS target modulation.
- Screening: Delivers standardized glial suspensions with defined cellular composition for reproducible compound screening and phenotypic readouts.
- Analytics: Enables quantitative measurements of glial differentiation, marker expression (e.g., MBP, GFAP), and functional responses to cytokine stimulation.
- Translational Research: Connects regional glial phenotypes to disease-relevant systems, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable glial isolation platform applicable across multiple CNS regions and experimental conditions for sustained R&D use.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in glial target validation through reduction of mechanistic ambiguity and region-specific functional insights.
- Operational Value: Standardized dissociation, plating, and cell separation workflows ensure reproducibility and scalability across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying glial target engagement and reducing late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on regional glial phenotype data and cytokine response profiles.
Implementation Considerations
- Expertise in neuroanatomy and sterile tissue dissection is required to isolate CNS regions and remove meninges without contamination.
- Access to centrifuges, pipettes, CO2 incubators, and coated culture flasks is necessary for glial dissociation, plating, and expansion.
- Standardization of trypsinization, DNase treatment, and trituration protocols across teams ensures consistent glial yield and viability.
- Adaptation to alternative model systems (e.g., human iPSC-derived glia) requires validation of regional markers and dissociation efficiency.
- Limitations include the need for rapid tissue processing to maintain glial integrity and avoid meningeal cell overgrowth in culture.
