Name: 细胞性谷胱甘肽S-转移酶潜在抑制剂的分光光度筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: 学习使用分光光度法筛选谷胱甘肽S-转移酶潜在抑制剂，通过测定IC50和Ki值分析抑制模式。该方法适用于多种GST同工酶，为癌症化疗耐药性研究提供可靠的实验方案。

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本研究工作由CANSEARCH基金会资助。作者谨此感谢Laurence Lesne女士和Yoann Sarmiento先生提供的技术协助，特别是在使用抑制剂标准化检测方法过程中进行重复实验的帮助。感谢Denis Marino先生、Simona Mlakar博士和Vid Mlakar博士富有成效的讨论和宝贵建议。我们感谢Patricia Huezo-Diaz Curtis博士在视频旁白方面的协助。感谢Muthukumar博士在in silico预测方面提供的意见。同时感谢Darren Hart先生在本稿件英文语言校对方面给予的帮助。

1. GST酶溶液的制备
注意：酶溶液的配制步骤取决于在测定前是否已知酶活性单位。一个酶活性单位是指每分钟合成 1 µmol 产物所需的酶量。酶活性以单位/毫升（unit/mL）或 µmol/min/mL 表示，其数值取决于酶溶液的稀释倍数。比酶活性以单位/毫克（unit/mg）或 µmol/min/mg 表示，仅取决于溶液的纯度。这两个参数均在下文中确定。如果所分离的 GST 同工酶的酶活性单位未知，则必须对其进行估算，以便调整各反应中的酶浓度，从而获得可重复的实验结果。
<ol>
	<li>如果已知测定中所用 GST 的酶活性单位：
	<ol>
		<li>将 GST 酶用纯水新鲜配制成 0.1 U/mL 的储备液，然后进行第 2 步。 
		注：该溶液可在 -20 °C 下分装保存数月，或在 -80 °C 下长期保存，但应避免反复冻融。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果测定中所用 GST 的酶活性单位未知：
	<ol>
		<li>使用二辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒或其他任意试剂盒测定酶溶液的蛋白浓度。</li>
		<li>将蛋白溶液稀释至终浓度为 0.02 mg/mL。</li>
		<li>向 96 孔板中每孔加入 20 µL 酶溶液、20 µL 25 mM GSH（分子量：307.32 g/mol）和 150 µL Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）。空白对照孔中用 20 µL 纯水代替酶溶液。</li>
		<li>向每孔加入 10 µL 50 mM CDNB（分子量：202.55 g/mol）底物溶液。</li>
		<li>在分光光度酶标仪上设置检测参数，在 340 nm 波长下读取各孔吸光度。建议每分钟测量一次，持续 10 分钟。</li>
		<li>将酶标板放入酶标仪中，按照第 1.2.5 步的设置开始读数。</li>
		<li>计算酶反应样品和空白对照样品每分钟的吸光度变化值。 
		注：通过以吸光度为纵坐标、时间为横坐标作图，验证反应是否呈线性。若反应不呈线性并趋于平缓，表明底物已耗尽，反应过快。此时应将酶用量减半，即对储备液进行两倍稀释。</li>
		<li>对测试样品的吸光度读数进行空白校正。</li>
		<li>利用代表比尔-朗伯定律的公式 1，计算每分钟反应生成的 GS-DNB 浓度（单位：µM）。 
		公式 1： 
		<img alt="浓度计算公式：C=A340/minε*l，吸收光谱方程。" src="/files/ftp_upload/61347/61347equ01v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
		其中 C 为底物浓度（单位：µM），A340/min 为第 1.2.7 步测得的每分钟吸光度变化值，ε 为 CDNB 结合物在 340 nm 处的摩尔消光系数（0.0096 µM-1*cm-1），l 为孔内光程长度（单位：cm）。对于加入 200 µL 酶反应液的 96 孔板，光程长度约为 0.55 cm。该值可能因板型不同而异，应向生产商核实确认。</li>
		<li>为确定每孔中产物的生成量（单位：µmol/min），将公式 1 计算得到的结果乘以反应液体积 2 × 10-4 L。</li>
		<li>将第 1.2.9 步结果除以所用蛋白量 4 × 10-4 mg，以归一化至单位蛋白量。所得结果即为比酶活性，单位为单位/mg 或 µmol/min/mg。 
		注：若因反应非线性而在第 1.2.6 步调整了稀释倍数，则需相应调整所用蛋白量。</li>
		<li>为获得酶活性，将第 1.2.10 步得到的比酶活性乘以 0.002 mg/mL，以换算为每毫升溶液中的酶活性。结果单位为单位/mL 或 µmol/min/mL。 
		注：与比酶活性不同，该酶活性值不随蛋白溶液稀释倍数变化而改变。此处注意事项与第 1.2.10 步类似，但针对的是蛋白浓度。</li>
		<li>将 GST 酶用纯水配制成 0.1 单位/mL 的储备液，然后进行第 2 步。 
		注：该溶液可在 -20 °C 下分装保存数月，或在 -80 °C 下长期保存，但应避免反复冻融。若实验周期较长，建议定期检测酶活性，以防蛋白溶液发生降解。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. GST同工酶对CDNB的米氏常数测定
注意：本实验步骤以CDNB底物为例进行说明，但同样适用于其他底物，如GSH。每种浓度的CDNB均需设置各自的空白对照，因为340 nm处的吸光度会随CDNB浓度的增加而升高。
<ol>
	<li>用95%（v/v）乙醇配制六种不同浓度的CDNB溶液，浓度范围从10 mM至100 mM。</li>
	<li>配制检测溶液：加入10 µL CDNB、20 µL GST酶、20 µL 25 mM GSH和150 µL DPBS。空白对照组中，不加CDNB溶液，仅加入10 µL 95%乙醇。</li>
	<li>为每种CDNB浓度设置空白对照：加入10 µL CDNB、20 µL水、20 µL 25 mM GSH和150 µL DPBS。</li>
	<li>使用酶标仪每分钟记录一次340 nm处的吸光度，持续10分钟。</li>
	<li>通过从各检测孔的吸光度值中减去相应空白对照的吸光度值，进行空白校正。根据测得的数据，使用公式2计算反应速率。 
	公式2： 
	<img alt="酶动力学公式示意图：利用A340吸光度计算反应速率。" src="/files/ftp_upload/61347/61347equ02v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式2"> 
	其中A340/min为实验测定的每分钟吸光度变化值，Vtotal（总体积）为0.2 mL，Venzyme（酶体积）为0.02 mL，εGS-DNB为GS-DNB偶联物在340 nm处的摩尔消光系数（9.6 mM-1·cm-1）。在96孔板的200 µL反应体系中，光程为0.55 cm（取决于板型），此时消光系数为5.3 mM-1。反应速率可用µmol/mL/min或mM/min表示。</li>
	<li>绘制米氏动力学曲线图，以反应速率为纵坐标（y轴），底物浓度为横坐标（x轴）。</li>
	<li>确定反应的最大反应速率（Vmax）和米氏常数（Km）（即反应速率达到Vmax一半时的底物浓度）。 
	注：可使用GraphPad Prism等软件，通过非线性回归拟合酶动力学曲线，计算米氏动力学参数，如Vmax和Km。</li>
	<li>用95%（v/v）乙醇配制CDNB储备液，其浓度为所测得Km值的20倍。</li>
</ol>
3. 潜在GST抑制剂的吸光度
注意：此步骤旨在检测反应中使用的潜在 GST 抑制剂是否产生在测定波长下增加吸光度的代谢物。如果存在此类代谢物，则抑制剂的使用量将影响实验结果，因此应为每个浓度单独制备相应的空白对照。
<ol>
	<li>将抑制剂稀释至所需浓度。 
	注意：准备三种不同稀释度，优选在抑制实验中测试的最低、中等和最高浓度。孔中DMSO的最高浓度应等于或低于1%（v/v）。我们在实验室中测试了DMSO浓度对实验的影响，结果表明1%的DMSO不会显著改变GST活性。</li>
	<li>在96孔板中，加入2 µL潜在的GST抑制剂、20 µL 25 mM GSH和168 µL DPBS。使用适当的对照，即加入与抑制剂样品所用溶剂等体积的溶剂，但不加抑制剂。</li>
	<li>孵育反应10分钟，以启动酶促反应。 
	注意：可通过测试不同的孵育时间来优化此步骤，目标是在启动反应的同时避免底物完全耗尽。</li>
	<li>向每孔加入10 µL CDNB，使其终浓度达到步骤2中确定的Km值。</li>
	<li>将板轻轻振荡数秒。</li>
	<li>使用酶标仪每隔1分钟记录一次340 nm处的吸光度，持续10分钟。</li>
	<li>计算每分钟吸光度的变化值。</li>
	<li>将吸光度变化与空白反应以及不含抑制剂的阴性对照反应进行比较。
	<ol>
		<li>如果吸光度有显著变化，则应对每种抑制剂浓度设置单独的空白，以校正结果。 
		注意：该结果表明，在无GST酶的情况下，反应组分可自发反应并生成一种在340 nm处增加吸光度的代谢产物。为校正这一额外吸光度，应针对每种浓度测量特定的空白。</li>
		<li>如果吸光度无显著变化，则对所有浓度使用一个通用空白，其中仅包含用于GST抑制剂稀释的溶剂。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. GST 抑制实验与 IC50 评估
<ol>
	<li>配制九种不同浓度的潜在 GST 抑制剂。 
	注意：可根据实验结果调整浓度。目的是确定非线性回归曲线的底部和顶部平台。有关此步骤的更多细节，请参见讨论部分。</li>
	<li>通过将 20 µL 的 25 mM GSH 溶液与 148 µL 的 DPBS 混合稀释，制备检测溶液。根据检测中使用的孔数相应调整体积。</li>
	<li>在透明的 96 孔板中，将酶促反应体系的终体积配制为 190 µL。建议使用多通道移液器完成这些步骤。
	<ol>
		<li>对于检测孔，加入 20 µL 酶溶液、2 µL 潜在 GST 抑制剂溶液和 168 µL 检测溶液。</li>
		<li>对于对照孔，加入 20 µL 酶溶液、2 µL 用于 GST 抑制剂的稀释液以及 168 µL 检测溶液。</li>
		<li>对于空白孔，加入 20 µL 水、2 µL 潜在 GST 抑制剂和 168 µL 检测溶液。 
		注意：如果 GST 抑制剂在 340 nm 波长处有吸收，则应对每个测试浓度单独配制相应的空白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个孔（包括空白孔）加入 10 µL 浓度为 20 倍 Km 的 CDNB 溶液。建议使用多通道移液器完成此步骤。</li>
	<li>将酶标板轻轻振荡数秒。</li>
	<li>使用酶标仪每隔 1 分钟测量一次 340 nm 处的吸光度，持续 10 分钟。</li>
	<li>通过从检测孔的吸光度值中减去空白孔的吸光度值，对吸光度进行空白校正。</li>
	<li>将加入 GST 抑制剂后测得的每分钟吸光度值除以无抑制剂对照组的每分钟吸光度值，对结果进行归一化处理。</li>
	<li>绘制抑制剂的对数浓度（x 轴）与 GST 活性（y 轴）之间的非线性回归曲线图，从而确定 IC50 值。 
	注意：GraphPad Prism 通过预测显示对照组酶活性 50% 的抑制剂浓度来计算 IC50 值。该预测基于非线性回归曲线的底部和顶部平台，以及由 S 形曲线所形成的斜率。</li>
</ol>
5. 抑制常数Ki及抑制类型的评估
<ol>
	<li>配制四种不同浓度的CDNB：其中三种高于K，一种等于Km 先前已发现。</li>
	<li>配制三种不同浓度的GST抑制剂，浓度应等于或低于先前测得的IC50值。</li>
	<li>按照步骤 4.2 至 4.7 所述进行抑制实验。</li>
	<li>使用以下方法计算反应速率 公式 2.</li>
	<li>绘制每种抑制剂浓度下的米氏方程（Michaelis–Menten）曲线，并计算 V最大值 和 Km 每个反应的</li>
	<li>根据V的变化最大 和 Km 使用不同浓度时，评估谷胱甘肽S-转移酶（GST）抑制剂的抑制模式。 
	注意：此步骤在结果与讨论部分中有更详细的说明。</li>
	<li>根据抑制模式，计算 Ki. 
	注意：在 GraphPad Prism 中，将使用不同的方程来计算 Ki 根据抑制作用的性质。所使用的方程基于观察到的Km 和 V最大 加入抑制剂后与对照组的K值相比m 和 V最大.</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们提供了一种分光光度法GST酶活性检测的实验方案，用于筛选潜在的抑制剂（图1，表1）并定量评估其抑制效力。我们还强调了确保酶活性检测结果准确且可重复所需考虑的最关键因素。与其它比色法或质谱方法相比，本方案的主要优势在于操作快速简便，能够对GST酶活性以及被筛选分子的抑制效力进行定量测定。
我们介绍了计算酶抑制剂两个最重要的米氏-门廷（Michaelis–Menten）参数——IC50 和 Ki 的方法。一种高效的抑制剂具有尽可能低的 Ki 和 IC50 值，表明抑制剂与酶之间的亲和力较高30。由于 IC50 受酶浓度和实验条件的影响33，在不同实验之间或不同实验条件下获得的抑制剂比较时，使用该值可能较为困难34。相比之下，抑制常数 Ki 是衡量潜在化合物抑制效力的更佳指标。Ki 可用于比较具有不同抑制机制的两种抑制剂，因为它仅依赖于抑制剂与酶之间的亲和力。然而，要明确抑制作用的性质，必须同时测定抑制剂的这两个参数30。我们测得姜黄素的 IC50 和 Ki 分别为 31.6 ± 3.6 µM 和 23.2 ± 3.2 µM，表明该化合物是一种高效的 GST 抑制剂。这些结果验证了计算机模拟（in silico）预测，后者估计姜黄素与不同人源 GST 同工酶结合的 Ki 值在 27.4 至 78.1 µM 之间。
酶活性或反应速率与酶量&#160; 
如上所述，IC50 受酶浓度的影响，若实验中使用的酶活性水平未知，可能会导致错误的结论33。为了控制可能降低抑制活性的其他因素，应对每一批新制备的 GST 酶测定其酶活性。例如，酶批次因反复冻融而发生降解，可能导致酶活性下降，从而即使在相同实验条件下也会得到较低的 IC50 值。换句话说，使用 0.01 单位的酶与使用 1 单位的酶将不会得到相同的结果。使用过多的酶可能导致底物迅速耗尽，使反应失去线性关系。因此，该参数可能导致结果不准确，因为在长时间孵育后可能观察不到吸光度的变化。
Km 值 
为了确保评估抑制剂所表现出的抑制类型的最佳条件，底物浓度必须等于或低于米氏常数（Km）。Km 表示占据酶一半活性位点所需的底物浓度28。例如，较高的底物浓度可能抵消竞争性抑制剂的作用，从而在这种条件下难以评估此类抑制作用。因此，本方法中的一个关键步骤是确定酶对所选底物（此处为 CDNB）的 Km 值。在某些研究中，该值未被测定，这可能导致关于抑制剂引起抑制模式的错误结论；如果抑制模式判断错误，则 Ki 的计算也会出错，因为相关方程依赖于抑制模式26,28。若测试不同的 GST 同工酶，则必须重新测定 Km 值，因为该值对于特定的酶-配体组合具有唯一性。由于我们使用的 CDNB 浓度略低于我们确定的 Km 值（0.26 ± 0.08 mM），即 0.2 mM，因此准确地确定了姜黄素对 GST 预期的竞争性抑制模式。
IC50 
要准确估算IC50，需获得一条良好的S形曲线，并确定其底部和顶部平台。底部平台代表抑制剂达到最大抑制活性时的浓度。在某些情况下，由于溶解度等技术问题，即使在高浓度下，化合物也可能无法完全抑制酶活性。然而，GraphPad Prism等工具可较为精确地拟合底部平台。顶部平台由不足以抑制酶活性的抑制剂浓度构成，因此此时酶活性达到最大值。这两个平台对于确定IC50至关重要，同时还需要中间浓度的数据以确定曲线的斜率，进而从S形曲线的形状推导出IC50值35。姜黄素在水中溶解度较差，因此本实验中所用的最大浓度受到限制，以避免在反应体系中产生沉淀。因此，实验采用了较低浓度的溶液，但这些浓度无法完全抑制谷胱甘肽S-转移酶（GST）的活性，从而给底部平台的确定带来了困难。为解决这一问题，我们基于非线性回归曲线预测了底部值，由此得出姜黄素的IC50为31.6 ± 3.6 µM（图3A）。对于依托咪酸（ethacrynic acid），由于其在反应体系中具有良好的溶解性，无需预测底部平台值，测得其IC50为6.6 ± 1.1 µM。
该方法可应用于人类中表达量最高的谷胱甘肽S-转移酶（GST）亚型，即GSTA1、GSTM1或GSTP1。然而，本方案不适用于定量GSTT1亚型的活性，因为CDNB并非该亚型的底物36, 37。与此同时，可对本方案进行轻微修改以解决此问题。例如，使用1,2-环氧-3-(4’-硝基苯氧基)丙烷（ENPP）作为GSTT1的底物，并在360 nm而非340 nm处测定共轭产物的生成量37
该实验方案的步骤可进行调整并应用于细胞培养实验中GST活性及抑制剂的检测。通过测定经GST抑制剂处理与未处理细胞的GST活性，可判断该化合物是否适用于此类实验体系。当抑制剂具有脂溶性时，尤其值得关注。例如，我们已通过本方案证实姜黄素是一种高效的GST抑制剂。然而，其在细胞实验中的应用可能受限，因为该分子在水中溶解度低且在培养基中易快速降解。31 此外，本方案尚有改进空间，例如底物CDNB缺乏对同工酶亚型的特异性。在细胞研究中使用该方案仅能获得总体GST活性信息，而无法反映特定GST亚型的活性。若加入针对特定同工酶的底物和/或使用特异性的重组GST同工酶，则可实现对同工酶特异性GST抑制剂的检测。
综上所述，我们描述了一种完整的实验流程，用于检测可能与亲电性化疗药物联合使用的谷胱甘肽S-转移酶（GST）抑制剂。我们重点强调了GST酶活性及抑制实验中的关键步骤，以测试潜在的候选分子，并定量评估其作为抑制剂的效力，获得半数抑制浓度（IC50）和抑制常数（Ki）等定量参数。该方法可应用于任何假设化合物，并可用于最常表达的人源GST同工酶（GSTA1、GSTM1和GSTP1）的检测，也可稍作调整，用于GST抑制剂的细胞培养研究，或测定其他特定GST同工酶的活性。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" fo:text-align="center">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>名称</td>
			<td>测定溶液中的浓度</td>
			<td>其他</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>底物</td>
			<td>CDNB</td>
			<td>测得的Km（mM）</td>
			<td>用95%乙醇稀释。最终乙醇浓度应≤5%（v/v）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">偶联底物</td>
			<td rowspan="2">GSH</td>
			<td rowspan="2">2.5 mM</td>
			<td>用水稀释。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>浓度必须使溶液达到饱和。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>缓冲液</td>
			<td>PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>pH = 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酶</td>
			<td>多种GST同工酶混合物或纯化的同工酶</td>
			<td>0.01 单位/mL，由实验确定。</td>
			<td>用水稀释。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">GST抑制剂</td>
			<td rowspan="2">待选潜在化合物</td>
			<td>IC50：选择3个最大抑制浓度、3个最小抑制浓度以及3个中间浓度。</td>
			<td rowspan="2">先用DMSO稀释，再用水稀释，使DMSO最终浓度≤1%（v/v）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki：围绕IC50选择3个浓度。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" style="text-align:center;">参数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" style="text-align:center;">室温（25°C）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" style="text-align:center;">pH = 7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" style="text-align:center;">DMSO ≤ 1%（v/v）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" style="text-align:center;">乙醇 ≤ 5%（v/v）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：进行谷胱甘肽S-转移酶（GST）抑制实验时需考虑的试剂和参数汇总。

胞质谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GSTs，EC 2.5.1.18）可催化谷胱甘肽（GSH）与多种亲电化合物（如化疗药物）发生偶联反应，从而促进这些物质在体内的解毒并易于排出体外1。目前已鉴定出七种胞质GST同工酶，分别为α、μ、π、σ、ω、θ和ζ型。GSTs主要在肝脏、睾丸、肺和胃肠道中表达2。其中，GST alpha 1（GSTA1）亚型在肝细胞中高表达。其他亚型在体内呈异质性分布，例如GST pi 1（GSTP1）主要在脑、心脏和肺中表达，而GST mu 1（GSTM1）则主要存在于肝脏和睾丸3。尽管不同GST同工酶之间具有较高的序列同源性，但因其表达模式不同，每种同工酶均表现出特定的底物特异性，并在药物代谢和癌症发生中发挥不同的作用4,5。
亲电性化合物可通过外源性途径进入机体，或在体内内源性生成。农药、前列腺素、致癌物和化疗药物均为谷胱甘肽（glutathione, GSH）结合反应的潜在底物6。例如，细胞内形成的任何缺电子活性化合物都可能成为亲电性底物。氯ambucil或美法仑等烷化剂可通过谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）催化形成GSH结合物而被清除，这些酶的表达水平升高与对这些化合物的耐药性相关6,7。
细胞质 GST 的另一个重要作用是调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性，例如 MAPK8（也称为 c-Jun 氨基末端激酶，或 JNK1）和 MAP3K5（也称为凋亡信号调节激酶 1，或 ASK1）8。某些 GST 亚型在其单体构象下可与这些蛋白结合，从而阻断磷酸化级联反应。在正常条件下，GSTP1 亚型会隔离 MAPK8（即 c-Jun 蛋白的激活剂）。c-Jun 与 c-Fos 蛋白结合后形成激活蛋白 1（AP-1）转录因子，该因子负责转录促凋亡基因。在应激细胞中，GSTP1 与 MAPK8 形成的复合物解离，c-Jun 被激活，进而启动凋亡相关基因的表达9。因此，该 GST 亚型的高表达可能阻断这一通路，导致细胞活力增强、细胞增殖增多以及细胞对化疗的敏感性降低。类似的情况也可能发生在 GSTP1 的旁系同源物中，例如与 MAP3K5 相互作用的 GSTM110。
谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）在药物代谢以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的隔离过程中发挥的作用，促使人们提出一种假说：GSTs的高表达可能是肿瘤对化疗产生耐药性的一种机制标志6,11。例如，GSTP1在多种癌症中均呈现过表达，其存在与预后不良及复发率升高相关8。这些基因的多态性也显示出不同疾病患者在药物暴露水平和生存率方面的差异，进一步支持了这些酶在药物耐药机制中具有关键作用的观点。例如，携带GSTM1缺失基因型的个体表现出较低的药物清除率但生存期更长12,13。目前存在多种可能用于抑制这种过表达的策略，例如使用谷胱甘肽（GSH）类似物、可被GSTs通过共轭作用激活的前体药物，或直接的GST抑制剂14,15。
目前，这些方法均处于研究阶段，已有少数化合物开始进行临床试验，以评估其在患者中的潜在应用价值。然而，据我们所知，目前尚无任何化合物作为谷胱甘肽S-转移酶（GST）抑制剂应用于临床实践15。事实上，某些同工酶缺乏特异性，或在正常细胞中耗竭谷胱甘肽（GSH），可能导致活性氧（ROS）在器官系统中积累而引发毒性，这些仅仅是限制GST抑制剂应用前景的部分缺陷14,15。此外，这些化合物可能在体内产生其他药效动力学效应，也限制了其使用。例如，依托利酸是实验室环境中研究最广泛的GST抑制剂，但由于其主要用作强效利尿剂，这一特性限制了其在临床中与其他药物联合使用。姜黄素是另一种被成功筛选出的天然GST抑制剂。该分子是一种从姜黄（Curcuma longa）中提取的多酚醚类化合物。研究表明，姜黄素可通过诱导多种肿瘤细胞系发生凋亡，在抗癌治疗方面展现出良好的应用前景16,17。该化合物可调控多种细胞信号通路，如酪氨酸激酶通路18或GST通路。利用纯化蛋白进行的研究已证实其对GSTA1、GSTM1和GSTP1具有抑制活性19,20。然而，在癌细胞中观察到了相互矛盾的结果：当细胞经姜黄素处理后，细胞内GST活性反而升高21。因此，在开展进一步的细胞实验之前，采用明确描述的实验方案并设置适当对照，测定任何潜在GST抑制剂的半数最大抑制浓度（IC50）及其抑制常数（Ki）至关重要。
因此，筛选和测试潜在的新型GST抑制剂具有重要的临床意义，任何新发现的化合物都必须在与亲电子药物联合使用时安全且高效。将研究重点放在同工酶特异性抑制剂上，可能实现对表现出特定GST表达模式的肿瘤组织中的GST进行抑制，从而推动有效联合疗法的开发。发现具有不同抑制机制的抑制剂也可能具有研究价值。例如，以GSH为底物的竞争性抑制剂可导致GSH耗竭。细胞内GSH浓度的降低已被证明可诱导神经元产生氧化应激，进而导致细胞凋亡。另一种常见的抑制方式——非竞争性抑制——即使在底物浓度很高的情况下也无法被逆转。
酶活性速率由米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）表示，可通过绘制底物浓度对反应速度的米氏-门顿曲线图来确定23。Km 是指占据一半酶活性位点所需的底物浓度，因此较高的 Km 值表示酶与底物的亲和力较低。Vmax 表示反应的最大速度，即所有酶的活性位点均被底物占据时达到的速度。Km 对应于 Vmax 一半时的底物浓度。最常见的三种抑制模式为：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。在竞争性抑制中，抑制剂结合到酶的活性位点，并与底物竞争结合位点。因此，加入抑制剂后 Vmax 不变，但 Km 增大，因为需要更高浓度的底物来克服抑制作用。反竞争性抑制仅在底物与酶形成复合物后发生。在此情况下，由于抑制程度依赖于底物和酶的浓度，加入抑制剂后 Vmax 和 Km 均降低。最后一种抑制模式为非竞争性抑制，是上述两种抑制模式的混合类型。抑制剂可结合到酶的活性位点，无论该酶是否已结合底物。此时，加入抑制剂后 Vmax 降低，但 Km 保持不变24。
1974年，Habig等人首次建立了一种通过分光光度法测定谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性的实验方法，该方法以1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）作为反应底物22。谷胱甘肽（GSH）与CDNB发生偶联反应生成GS-DNB，该产物在340 nm波长处具有最大光吸收值，可通过分光光度计进行检测记录。下文所述的大部分技术细节均源自Habig等人的研究，包括抑制性实验中的最佳参数设置及关键优化要点。该技术可用于筛选潜在的GST抑制剂，无论这些抑制剂是通过基于计算预测的合理药物设计方法选定，还是通过文献调研获得。本文还讨论了如何将该实验方案适配于新合成的GST蛋白或特定同工酶。例如，检测具有临床相关多态性或单核苷酸多态性（SNPs）的GST同工酶的抑制效力，可能是本方案的潜在应用方向，可用于靶向患者特异性的GST蛋白研究。
本方案提供了一种快速、可行且有效的体外方法，用于在开展其他功能研究之前筛选潜在的谷胱甘肽S-转移酶（GST）抑制剂。文中描述了评估酶抑制剂最常见特征参数的步骤：半数抑制浓度（IC50），即抑制酶活性达50%所需的抑制剂浓度；以及抑制常数（Ki），代表抑制剂与酶之间解离的平衡常数，反映这两种分子之间的结合亲和力。这两个数值分别通过非线性回归分析，并结合针对不同抑制模式的特定方程进行测定。我们还展示了如何评估抑制模式，通过米氏-门顿（Michaelis-Menten）图示法确定加入抑制剂后Vmax和Km的变化23,25,26。

<table><tbody><tr><td>1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td>用于 GST 酶活性测定的底物</td></tr><tr><td>Corning 紫外透光微孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3635</td><td>用于进行酶活性测定的透明微孔板。&lt;br/&gt; 当使用 200 µL 时，该微孔板的光程为 0.552 cm。</td></tr><tr><td>姜黄素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8511</td><td>用于结果部分，以测试姜黄素的抑制效力</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>用于配制待测抑制剂的储备液</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>酶反应缓冲液</td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>10542382</td><td>用于稀释 CDNB</td></tr><tr><td>马肝来源的谷胱甘肽 S-转移酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6511</td><td>用于结果部分，以测试姜黄素的抑制效力</td></tr><tr><td>还原型 L-谷胱甘肽（GSH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td>GST 酶活性测定中的共底物</td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>23225</td><td>用于定量酶反应溶液中的蛋白含量</td></tr><tr><td>Spectramax iD3</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>用于进行分光光度测定</td></tr></tbody></table>

细胞质谷胱甘肽s-转移酶潜在抑制剂的分光光度法筛选

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是一类代谢酶，可通过与谷胱甘肽（GSH）结合，促进内源性或外源性亲电化合物的清除。此外，GSTs 还可调控参与凋亡通路的丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）。在使用亲电烷化剂进行化疗的患者中，GSTs 的过表达与治疗效果降低相关。使用 GST 抑制剂可能是逆转这一趋势并增强治疗效力的潜在策略。实现这一目标需要发现此类化合物，并建立一种准确、快速且简便的酶活性检测方法。目前文献中最常用的方法是采用1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）作为底物的分光光度法检测。然而，已有报道的 GST 抑制实验并未提供一个详尽描述最佳抑制实验各阶段操作的完整方案，例如未说明 CDNB 的米氏常数（Km）测定，或未明确所用酶浓度，而这些参数对于评估待测化合物的抑制效力至关重要。因此，本方案详细描述了优化后的分光光度法 GST 酶活性检测的每一步骤，可用于筛选潜在抑制剂文库。我们同时解释了半数抑制浓度（IC50）和抑制常数（Ki）的计算方法——这两个参数常用于衡量酶抑制剂的抑制效力。该方法可使用从细胞中提取的 GST 混合物，或纯化的重组人源 GST，包括 GST alpha 1（GSTA1）、GST mu 1（GSTM1）和 GST pi 1（GSTP1）。但本方案不适用于 GST theta 1（GSTT1），因为 CDNB 并非该同工酶的底物。本方法曾用于检测姜黄素对马肝来源 GST 的抑制效力。姜黄素是一种具有抗癌特性的分子，经in silico分子对接预测后显示其对 GST 同工酶具有结合亲和力。我们证实姜黄素是一种强效的竞争性 GST 抑制剂，其 IC50 为 31.6 ± 3.6 µM，Ki 为 23.2 ± 3.2 µM。姜黄素有望与亲电类化疗药物联用，以提高其治疗效果。

马肝GST与CDNB的米氏常数（Km） 
姜黄素是一种安全的天然化合物，即使在较高剂量摄入后仍具有安全性27，并表现出抗癌特性16。该分子对人重组谷胱甘肽S-转移酶（GST）的抑制活性已在研究中得到证实19,20。通过使用本方案所述的方法，我们评估了姜黄素对来源于马肝GST同工酶混合物活性的影响。根据供应商提供的信息，该蛋白混合物的比活性为25 U/mg。通过将冻干粉溶解于适量水中，配制得到0.1 U/mL的储存液。同时使用乙炔酸作为阳性对照，因为该化合物是目前GST抑制研究中最常用的抑制剂。GST活性测定及抑制剂检测的操作步骤详见图1。
必须针对每种酶-底物反应定义Km值，因为使用相当于Km的底物浓度可确保在确定抑制模式时无偏差28。为测定该参数，在固定浓度为2.5 mM GSH的条件下，测试了6种不同浓度的CDNB，范围从0.5 mM至5 mM。
反应终体积为 200 µL，使用 96 孔板进行。每次实验均设置特异性空白对照，其中二氯硝基苯（CDNB）的浓度与检测孔相同，因为 CDNB 与谷胱甘肽（GSH）可能发生自发性偶联反应，从而导致吸光度升高。所有反应中酶的终浓度均为 0.01 单位/mL，通过向反应体系中加入 20 µL 储存液实现。在 340 nm 处每分钟记录一次吸光度，持续 10 分钟。使用公式 2计算反应速率（单位为 mM/min）。以底物浓度（mM）为横坐标、反应速率（µM/min）为纵坐标绘制米氏（Michaelis–Menten）曲线（图 2），并据此计算反应的 Km 值。实验重复进行，直至至少获得三组结果相近的数据。测得马肝 GST 催化 CDNB 的 Km 值为 0.26 ± 0.08 mM。在使用该批 GST 进行的每个抑制性检测中，CDNB 的浓度均设定为 0.2 mM。
在使用姜黄素单独与谷胱甘肽（GSH）和CDNB孵育的实验中，未检测到在340 nm处有吸收的代谢物自发形成。每次实验中，每个抑制剂浓度均使用相同的空白对照。
姜黄素对谷胱甘肽S-转移酶的抑制活性 
姜黄素的抑制效力通过以下方法预测： in silico 使用软件进行分子对接模拟（例如 AutoDock Vina 版本 1.1.2）。29 不同GST亚型（即GSTA1、GSTM1和GSTP1）与姜黄素之间的游离结合能被预测（数据未显示）。随后，抑制常数Ki 使用……进行计算 公式 3.
公式 3： 
<img alt="用于酶动力学分析的抑制常数方程 Ki(μM)=exp(ΔG/RT)。" src="/files/ftp_upload/61347/61347equ03v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 3"> 
其中 ∆G 是通过 in silico 分析得到的自由结合能，R 是气体常数（1.987 cal·K-1·mol-1），T 是实验期间的温度，此处以开尔文为单位（298 K）。
根据 AutoDock Vina 返回的自由结合能结果，姜黄素对人源 GSTA1、GSTM1 和 GSTP1 均具有较强的谷胱甘肽 S-转移酶（GST）抑制活性，其 Ki 值分别为 78.1 µM、78.1 µM 和 27.4 µM。首次抑制实验基于这些计算得到的 Ki 估值进行，并根据实验结果在必要时对浓度进行了调整。
首先，估算IC50值。该参数是指抑制剂将酶反应速率降低50%时的浓度，因此其数值依赖于酶的浓度30。配制9种不同终浓度的抑制剂溶液，浓度范围为0.39 µM至100 µM，每种浓度均为前一浓度的两倍。检测溶液由以下组分组成：20 µL 2.5 mM GSH、20 µL 马肝GST（终浓度为0.01 U/mL）、2 µL 姜黄素溶液以及148 µL PBS。对照组溶液除以姜黄素溶剂替代姜黄素外，其余成分相同。将上述混合液孵育15分钟，以启动酶反应，并避免姜黄素在检测溶液中降解，因为该化合物在缓冲液中不稳定31。随后，向每孔中加入10 µL 4 mM CDNB溶液，使CDNB的终浓度为0.2 mM。在340 nm波长下每分钟记录一次吸光度，持续10分钟，以计算每分钟吸光度的变化值。为计算IC50，将各姜黄素处理样品的活性相对于对照组进行归一化处理，得到活性百分比。通过作图软件分析数据，拟合抑制剂对数浓度与抑制率之间的非线性回归曲线。测得姜黄素对马肝GST的IC50值为31.6 ± 3.6 µM（图3A）。
同时使用依他尼酸作为阳性对照进行相同的实验，浓度范围与姜黄素相同，为0.39至100 µM。测得的IC50为6.6 ± 1.1 µM（图3B）。
接下来的步骤是评估姜黄素对这些转移酶的抑制模式。测试了四种不同浓度的姜黄素：0、7.5、15 和 30 µM，以及四种不同浓度的 CDNB：0.2、0.4、1 和 1.5 mM。实验方案与之前实验相同。使用公式 2计算每种条件下的反应速率。针对每种抑制剂浓度绘制曲线，以反应速率（µM/min）为纵坐标，底物浓度（mM）为横坐标（图 3C）。根据每条曲线，利用 GraphPad Prism 确定 Vmax 和 Km 值。根据这两个参数的变化以及不同实验条件下的测定结果，判断潜在抑制剂的抑制模式。24 由于在不同条件下 Vmax 未发生显著变化，而 Km 随抑制剂浓度增加而升高，表明姜黄素对 GSTs 的抑制属于竞争性抑制。这种抑制模式发生在抑制剂与底物竞争酶的活性位点时。为了测定竞争性抑制剂的 Ki 值，GraphPad 采用 Copeland 等人描述的公式 4和公式 5。32 
公式 4： 
<img alt="含抑制因子的米氏方程；酶动力学；数学公式分析。" src="/files/ftp_upload/61347/61347equ04v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 4"> 
公式 5： 
<img alt="米氏方程，酶动力学公式，数学表达式。" src="/files/ftp_upload/61347/61347equ05v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 5"> 
其中 Km obs 为观测到的米氏常数，Km 为对照组的米氏常数，[I] 为抑制剂浓度，Ki 为抑制常数，Y 为反应速率，X 为底物浓度。
计算基于与抑制模式评估相同的实验。估算得到的姜黄素对马肝GST抑制的Ki值为23.2 ± 3.2 µM。
<img alt="GST 检测流程图；酶的制备、Km、吸光度、IC50、Ki 测定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61347/61347fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：GST 酶活性及抑制实验步骤流程图。 有关实验步骤的详细信息见方案部分。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61347/61347fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="米氏动力学图，酶促反应速度与CDNB浓度的关系，数据分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61347/61347fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：谷胱甘肽S-转移酶（GST）酶活性的米氏动力学曲线。在固定浓度的还原型谷胱甘肽（GSH，2.5 mM）存在下，使用不同浓度的底物CDNB测定马肝来源的GST混合酶活性。根据曲线拟合结果，CDNB的Km值为0.26 ± 0.08 mM。图中每个数据点代表四次独立实验的平均值，误差条表示标准差（SD）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61347/61347fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="姜黄素和乙酰水杨酸对GST活性的抑制作用；反应速率与CDNB浓度关系图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61347/61347fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：姜黄素和乙酰水杨酸对GST酶活性的影响。（A-B）在保持GST（0.01 U/mL）、GSH（2.5 mM）和CDNB（0.2 mM）终浓度不变的条件下，分别加入浓度递增的姜黄素（A）或阳性对照乙酰水杨酸（B），通过非线性回归分析计算两种化合物对马肝GST的IC50值。姜黄素的IC50为31.6 ± 3.6 µM，乙酰水杨酸的IC50为6.6 ± 1.1 µM。（C）在不同浓度姜黄素存在下，改变CDNB底物浓度所绘制的米氏-门顿（Michaelis–Menten）曲线，表明其抑制模式为竞争性抑制。无抑制剂时，Vmax和Km分别为132.7 ± 4.6 µM和0.5 ± 0.08 µM；加入30 µM姜黄素后，Vmax和Km分别为130.4 ± 13.1 µM和1.08 ± 0.39 µM。所有图表（A-C）中的数据点均代表三次独立实验的平均值±标准差（SD）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61347/61347fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是一类参与多种化疗药物代谢的解毒酶。GSTs的过表达与癌症化疗耐药性相关。克服这一表型的方法之一是使用抑制剂。本实验方案描述了一种利用分光光度法检测来筛选潜在GST抑制剂的方法。

细胞质谷胱甘肽S-转移酶潜在抑制剂的分光光度法筛选

谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是一类代谢酶，负责通过谷胱甘肽催化内源性或外源性亲电化合物的消除反应……

谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是一类代谢酶，能够降解细胞内亲电化合物，并与参与凋亡通路的MAP激酶相互作用。由于这两种功能，GST的表达水平与药物耐药性相关，而解决这一问题的策略之一是使用酶抑制剂。本实验方案提供了一种检测此类分子的方法。本方法面向所有初次接触谷胱甘肽-S-转移酶（GST）抑制剂领域的研究者，旨在提供一种快速简便的方法来检测酶与化合物之间的相互作用。我们还提供了测定抑制剂两个特征参数的步骤：半数抑制浓度（IC50）和抑制常数（Ki）。此外，我们描述了确定抑制模式的技术，该模式是一项具有不同生物学意义的重要特征。第一步是测定溶液中GST的单位酶活性。每毫单位是指每分钟合成一微摩尔产物所需的酶体积。测定酶溶液的蛋白质浓度。根据您的方便选择测定技术。将蛋白质溶液稀释至水中，终浓度为 0.02 毫克/毫升。将酶溶液置于冰上保存。在 96 孔板中配制反应体系。在空白孔中加入 20 微升水。在检测孔中加入 20 微升酶溶液。加入 20 微升 GSH。加入150 µL PBS。向每孔中加入10 µL浓度为50 mM的CDNB。将酶标板在摇床上混匀数秒。使用分光光度酶标仪，每分钟记录一次340纳米处的吸光度，持续10分钟。在电子表格中及使用专业软件分析结果。根据所获得的结果，用水配制浓度为0.1单位/毫升的GST储存液。用95%乙醇配制六种不同浓度的CDNB溶液，每种20份，终体积为200微升。向每个孔中加入20微升浓度为25毫摩尔/升的GSH。向检测孔中加入20微升浓度为0.1单位/毫升的GST。向空白孔中加入 20 µL 水。向每个孔中加入 150 µL PBS。向检测孔和空白孔中加入 10 µL 相应的 CDNB 溶液。每种浓度的CDNB都需要设置相应的空白对照。将反应液在振荡器上混匀数秒，随后每分钟记录一次340纳米处的吸光度，持续10分钟。使用专业软件分析结果。通过绘制米氏方程曲线（Michaelis-Menten 曲线）确定 Km 值。根据实验结果，用 95% 乙醇配制浓度为所得 Km 值 20 倍的 CDNB 溶液。将抑制剂溶液稀释至所需浓度。在96孔板中，加入2 µL的潜在GST抑制剂。在空白孔中，加入2 µL稀释液。每孔加入20 µL浓度为25 mmol/L的GSH以及168 µL PBS。加入10微升CDNB，其浓度为上一步骤中测得Km值的20倍。将酶标板在摇床上混匀数秒。每分钟记录一次340纳米处的吸光度，持续10分钟。使用专业软件分析结果。根据实验结果，可对每种GST抑制剂使用相同的空白对照，或进行相应调整。制备9个浓度梯度的待测GST抑制剂。配制一份反应所需的检测溶液，包含 148 微升 PBS 和 20 微升浓度为 25 纳摩尔的 GSH。充分混匀该溶液。对于检测孔，加入 2 微升 GST 抑制剂、20 微升 GST（0.1 单位/毫升）以及 168 微升检测溶液。对于对照孔，加入2 µL用于GST抑制剂的稀释液、20 µL浓度为0.1单位/毫升的GST酶溶液，以及168 µL的检测溶液。对于空白孔，加入2 µL用于GST抑制剂的稀释液、20 µL水和168 µL的检测溶液。向每个孔（包括空白孔）加入10 µL的CDNB溶液。在摇床上混合数秒钟。每分钟记录一次340纳米处的吸光度，持续10分钟。使用专用软件计算IC50。按照方案说明，配制四种不同浓度的CDNB溶液。同样按照方案说明，配制三种不同浓度的GST抑制剂溶液。配制酶反应溶液，每份反应液包含148微升PBS和20微升25毫摩尔的GSH。对于对照孔，加入2 µL用于GST抑制剂的稀释液；对于检测孔和空白孔，加入2 µL正确的GST抑制剂溶液。混匀数秒。向每个孔中加入168微升酶溶液。向每个相应孔中加入10微升相应的CDNB浓度溶液。混匀数秒，然后每隔1分钟记录一次340纳米处的吸光度，持续10分钟。采用相同的铺板模式重复实验，以测定四种不同浓度的CDNB与三种不同浓度的GST抑制剂联合作用下的结果。使用专业软件分析数据，确定抑制模式及Ki值。该方案已应用于姜黄素（curcumin）——一种具有抗癌特性的分子。该化合物是通过计算预测其对多种GST同工酶的结合亲和力而筛选得到的。同时，以乙酰唑胺酸作为阳性对照，在实验室环境中开展了相同的实验，乙酰唑胺酸是目前最常用的谷胱甘肽S-转移酶（GST）抑制剂。抑制效力在马肝来源的GST混合物上进行测试，也可应用于任意选择的GST同工酶。测定了其IC50值、抑制类型以及Ki值。为了提供最佳的测定条件，首先测定了底物CDNB与谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）混合物的米氏常数Km。Km值代表底物与酶之间的亲和力。确定该值对于在实验中使用非饱和浓度的底物至关重要。事实上，两种高浓度可能会对竞争性抑制剂产生不利影响，而浓度过低则无法检测到。有关此问题的更多细节，请参见正文。本实验采用六种不同浓度的CDNB，并保持GSH和GST酶的浓度恒定。通过将底物浓度（单位：毫摩尔）作为横轴，反应速率（单位：毫摩尔/分钟）作为纵轴，绘制米氏-门顿（Michaelis-Menten）曲线图。反应速率使用公式一计算得出。Km 值确定为 Vmax 的一半，该值是在溶液中底物浓度达到饱和、形成结合物的平台期后获得的。根据专用软件的计算结果，测试的GST酶溶液对CDNB的Km值为0.26毫摩尔。IC50定义为使酶活性抑制一半所需的抑制剂浓度。通过非线性回归曲线估算IC50值，其中GST抑制剂的对数浓度绘制在X轴上，GST活性百分比绘制在Y轴上。使用了九种不同浓度的抑制剂。通过应用公式一测定GST活性。使用无抑制剂的对照组对结果进行归一化处理。姜黄素在水中的溶解度较差，因此无法使用更高浓度，导致难以获得最大抑制效果。尽管如此，一种专业软件仍能够预测姜黄素对该组谷胱甘肽S-转移酶（GST）的IC50值为31.4 µmol/L。同时，以乙酰唑胺作为阳性对照进行了相同的实验。结果如预期，该分子被证实为谷胱甘肽S-转移酶（GST）抑制剂，其IC50为6.7 µM。这些结果证实姜黄素也是一种GST抑制剂，其IC50处于微摩尔浓度范围，与乙酰唑胺相似。为了更详细地研究姜黄素作为谷胱甘肽S-转移酶（GST）抑制剂的作用，确定了其抑制类型以及抑制常数Ki。首先，通过米氏方程（Michaelis-Menten）图评估抑制类型。在使用不同浓度的底物CDNB的同时，逐步增加GST抑制剂姜黄素的浓度，结果显示Km值随着姜黄素浓度的升高而显著增大，而Vmax在不同实验条件下保持不变。这种抑制方式是竞争性抑制的典型特征。有关其他类型抑制的更多细节，请参阅正文。根据抑制类型，使用相同的数据集计算了Ki值，得到姜黄素的Ki值为23.3微摩尔。所述方法为基本的酶学实验，需在特定步骤中谨慎操作，以获得正确且可重复的结果。测定描述底物与酶亲和力的米氏常数 Km 是其中的关键步骤之一。事实上，当底物浓度过高或过低时，将难以准确判断抑制作用的方式，导致抑制常数 Ki 无法被正确计算。该方法可应用于人源重组GST，例如GSTA1和P1，在细胞培养研究中用于评估其与亲电试剂联用以降低药物耐药性的潜力。

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