Name: 全鼠眼的消化，用于单核噬细胞的多参数流细胞学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习全鼠眼消化制备单细胞悬液的方法，用于多参数流式细胞术分析单核吞噬细胞群，包括巨噬细胞、小胶质细胞和树突状细胞。该技术可定量分析荧光强度以区分细胞表面标志物表达相近的细胞类型，适用于糖尿病视网膜病变和自身免疫性葡萄膜炎等模型研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JAL 获得美国国立卫生研究院（NIH）K08EY030923 项目资助；CMC 获得美国国立卫生研究院国家关节炎与肌肉骨骼疾病研究所 K01 项目（5K01AR060169）以及狼疮研究联盟新研究项目（637405）的资助。

所有实验程序均经西北大学机构动物护理与使用委员会批准。C57BL/6小鼠饲养于西北大学比较医学中心（伊利诺伊州芝加哥）的屏障设施内，采用群养方式。所有动物均保持12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环，并可自由获取食物和饮水。
1. 眼组织的采集
<ol>
	<li>使用受控的二氧化碳吸入法处死10至12周龄的C57BL/6J小鼠（性别不限），直至小鼠无反应且不再呼吸。实施颈椎脱位或其他经批准的辅助方法以确保安乐死完成。 
	注意：可进行经心脏灌注以清除未进入眼组织的循环白细胞。在本实验中，全身灌注不会减少在未经处理或经激光处理的完整眼球中检测到的小胶质细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的数量。因此，这些细胞类型的大多数位于眼组织内，此步骤为可选。</li>
	<li>为摘除眼球，将弯曲镊子轻轻置于突出于眼眶外的眼球下方，同时在眼眶附近向下施力。在眼球下方夹紧镊子，但避免挤压眼球本身。将眼球从周围结膜组织中分离（详见先前发表文献）23。</li>
	<li>将眼球向外侧牵拉，直至视神经成为唯一连接组织，继续牵拉以分离眼球。视神经通常在张力作用下自行断裂，但有时需使用小型剪刀切断视神经。将摘除的眼球置于含有钙离子和镁离子的冰冷1×Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中，并放入1.7 mL微量离心管。</li>
</ol>
2. 眼组织的消化
<ol>
	<li>准备消化缓冲液，其中包含 0.1 mg/mL 消化酶和 0.2 mg/mL DNase，溶于冷的 HBSS 中。首先将 5 mg 消化酶用 2 mL 无菌水重悬。用 HBSS 制备 10 mg/mL DNase 的初始稀释液。每配制 10 mL 消化缓冲液（足够处理 3 只动物），混合 9.4 mL 冷 HBSS、0.4 mL 重悬后的消化酶和 0.2 mL 稀释后的 DNase I。 
	注：这些浓度是通过多次实验经验性确定的，旨在提供单细胞抗体染色的最佳水平，同时减少细胞死亡。曾尝试使用胶原酶 D 替代消化酶，但导致细胞活力降低和 CD45+ 细胞减少。有关优化消化条件的迭代过程的更多细节，请参见讨论部分。</li>
	<li>在解剖显微镜下以 10 倍总放大倍数，使用精细镊子和弹簧剪刀在冷 HBSS 中去除残留的结膜和视神经。</li>
	<li>将清洁的眼球转移至干燥的解剖皿或小型称量舟中。在眼球上通过视轴处制造两个穿刺伤口，其中一个用于注入消化缓冲液，另一个位于距第一个伤口 90˚ 的位置作为液体流出通道，然后使用配备 30 G 针头的注射器向玻璃体腔内注入 0.15–0.20 mL/眼的消化缓冲液。</li>
	<li>使用弹簧剪刀和精细镊子将整个眼球剪碎，确保所有组织碎片小于 0.5 mm × 0.5 mm。通过镊子进行钝性机械破坏以解离晶状体组织，防止后续步骤中堵塞移液器吸头。对每个样本，分别用 0.75 mL 消化缓冲液冲洗镊子和剪刀至小皿中。每个样本使用新的培养皿。</li>
	<li>使用 P1000 移液器将培养皿中的内容物转移至冰上的解离管中，注意在移液过程中避免损失任何材料。再用额外的 1.5 mL 消化缓冲液冲洗培养皿，使解离管中的总体积达到 3.25–3.50 mL。</li>
	<li>将解离管倒置安装到电子解离仪上，运行预设程序“m_brain_03_01”，该程序包括在室温下以 200 rpm 转速进行 1 分钟单向旋转。确保所有组织均位于解离管底部，并与消化缓冲液及转子充分接触，此要求适用于本步骤及后续所有步骤。</li>
	<li>将解离管放入摇床培养箱中，在 37 ˚C、200 rpm 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>重复步骤 2.6 和 2.7 一次。第二次孵育 30 分钟后，按照步骤 2.6 的方法使用电子解离仪进行最后一次机械消化。</li>
	<li>加入 10 mL 冷的流式缓冲液以终止反应，并将试管置于冰上。</li>
</ol>
3. 细胞悬液的制备
<ol>
	<li>为制备单细胞悬液，将终止消化反应后的眼组织混合液经40 &#956;将5 μm滤膜置于50 mL锥形离心管上。使用2.5 mL注射器的推杆，将未完全消化的眼组织残余物压过滤膜。</li>
	<li>用10 mL流式缓冲液冲洗消化管，并在使用同一支推杆再次将未消化的眼组织碎片通过滤膜前，润洗滤膜。</li>
	<li>重复步骤 3.2，使用 5 mL 流式缓冲液。</li>
	<li>用最后 10 mL 流式缓冲液清洗解离管和滤器。 
	注：每份样本的消化液和流式缓冲液总体积约为 38–40 mL。</li>
	<li>将锥形管在400 × g下离心 x g 4 ℃下离心10分钟 &#730;C. 倾去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>通过将10倍浓缩的裂解液加入无菌水中，制备1倍工作浓度的裂解液。通过轻弹离心管撞击另一支试管使沉淀充分散开。为裂解红细胞，在室温（RT）下加入1 mL 1倍裂解液，轻轻旋转混匀，作用30秒。</li>
	<li>用 20 mL 流式缓冲液终止反应。</li>
	<li>将锥形管在400 × g下离心 x g 4℃下孵育10分钟 &#730;C. 倾去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>轻弹试管使其与另一试管碰撞，以重悬沉淀。每管加入 5 mL 冷的 1× HBSS。</li>
	<li>离心管于400 × g离心 x g 4℃下10分钟 &#730;C. 吸去上清液。</li>
</ol>
4. 单核吞噬细胞的细胞悬液染色
<ol>
	<li>每份样本用冷的 HBSS 将 Live/Dead 染料按 1:5,000 稀释，制备 0.5 mL 的 Live/Dead 染色液。</li>
	<li>使用 P1000 移液器将 Live/Dead 染料加入每个样本，确保完全重悬沉淀。将样本转移至 1.2 mL 微孔管中。</li>
	<li>取少量样品（10 &#956;L) 使用血细胞计数板或自动细胞计数器对细胞进行计数（参见4.4）。将样品在室温避光条件下与活/死细胞染料孵育15分钟。</li>
	<li>使用台盼蓝对细胞进行计数，以确定每份样本中的活细胞数量。 
	注意：通常情况下，2 只 10–12 周龄的 C57BL/6J 小鼠眼球所含细胞少于 2 × 10⁶ 个。6 活细胞</li>
	<li>加入 400 μL 洗涤液重悬样本 &#956;冷流式缓冲液 L。在400 × g下，使用微量离心管架离心管子 x g 4°C 下 10 分钟 &#730;C. 吸取上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞充分重悬于 500 &#956;冷流式缓冲液 L。在400 × g下，于微量离心管架中离心管子 x g 4℃下，10分钟 &#730;C. 吸取上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>最多阻断 5 x 106 50 个活细胞 &#181;L of Fc 封闭（使用纯化的抗小鼠CD16/CD32大鼠抗体，按1:50比例用冷流式缓冲液稀释）。若细胞数量超过5 x 106 活细胞，相应增加体积。</li>
	<li>加入 Fc 将裂解液加入沉淀中，确保充分裂解样本。4℃孵育20分钟 &#730;C.</li>
	<li>加入50 &#956;抗体染色液 L（参见 表1 每5 x 10⁶细胞所用每种抗体的选择与用量）6 活细胞直接与F中的细胞相连c 封闭并充分混匀，在 4 ℃ 下孵育 30 分钟 &#730;C. 
	注意：抗体用量取决于流式细胞仪的配置，应在每个实验室和仪器上单独进行滴定。参见 表2 用于仪器配置滤光片和反射镜。进行抗体滴定时，首先采用生产商推荐的浓度，计算染色指数。通过测试不同抗体浓度（包括高于和低于生产商推荐浓度的范围），选择染色指数保持稳定的最低抗体浓度。同时，确保阳性染色信号亮度不超过单色对照的亮度。使用未染色细胞样本，确保阴性染色细胞处于量程范围内，且峰值位于或低于 1 × 102使用荧光减一对照来界定阳性染色的细胞。</li>
	<li>加入 700 μL 缓冲液洗涤样本 &#956;L 的冷流式缓冲液。在400 × g下，将离心管置于微孔板离心管架中离心 x g 4℃下10分钟 &#730;C. 吸取上清液时避免扰动细胞沉淀。</li>
	<li>可选地，在抗体染色后，样品可用500 &#956;2%多聚甲醛溶于流式缓冲液中，室温固定样品15分钟。随后按4.10步骤进行一次洗涤。将固定后的样品于4℃保存 &#730;C. 应在流式细胞术数据采集当天加入计数微球。固定后的样本应在1-2天内上机进行流式细胞术检测。 
	警告：多聚甲醛具有腐蚀性，且对健康有害。</li>
	<li>再次使用 500 &#956;L 冷流式缓冲液。在400 × g下，于微量离心管架中离心 x g 4℃下，10分钟 &#730;C. 吸取上清液的一半，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>将沉淀重悬，并转移至96孔U型底检测板中。以400 × g离心板 x g 4℃下，5分钟 &#730;C. 倒出上清液时，将培养板翻转，用力快速振荡一次，使液体流入水槽，注意勿扰动沉淀。</li>
	<li>在新的1.2 mL微量滴定管中，加入50 &#956;充分涡旋混匀的计数微球的升数。</li>
	<li>在96孔板中将沉淀重悬于200 &#956;250微升冷流式缓冲液。将上一步的细胞混合物加在磁珠上层，总体积为250微升，上机进行流式细胞仪检测。 &#956;L / 微量滴定管</li>
</ol>
5. 流式细胞术数据的采集
<ol>
	<li>开启并准备流式细胞仪。此处列出的说明适用于改装的四激光细胞仪（表2）。</li>
	<li>运行测试样本，其中包含来自每个样本的小量等分试样，以确保所有细胞在每个检测器上均处于量程范围内。调整电压，使所有细胞均在量程内。</li>
	<li>对染色混合物中使用的每种荧光染料运行单色对照（SCC）（表3）。将微量滴定管放入较大的5 mL聚苯乙烯管中，以便放置到流式细胞仪的进样台上。 
	注意：BV421（太平洋蓝）、FITC、PE、Alexa647（APC）和Alexa700等母体荧光染料不需要与染色混合物中相同的抗体（例如，CD64 PE染色无需使用CD19 PE抗体）。然而，由于偶联荧光染料可能发生解离，PE-CF594、PE-Cy7或APC-Cy7等串联荧光染料需要使用与染色混合物相同的抗体进行SCC。
	<ol>
		<li>通过向1.2 mL滴定管中加入2滴补偿微珠以及1 μL仓鼠抗小鼠CD11c BV421来制备BV421的SCC。使用补偿微珠的原因是CD11c BV421为IgG lambda亚型，而非5.3.3节所述的kappa亚型。在4 ˚C孵育15分钟。加入0.2 mL流式缓冲液。</li>
		<li>通过向胺反应性微珠中的阳性染色微珠（绿色盖）加入一滴，再加入1 μL活/死染料来制备活/死染料的SCC。在室温避光条件下孵育15分钟。加入一滴胺反应性微珠中的阴性微珠（白色盖）。加入0.2 mL流式缓冲液。</li>
		<li>通过向1.2 mL滴定管中加入一滴抗大鼠和抗仓鼠Ig kappa微珠组中的阳性染色微珠（绿色盖），再加入所列抗体用量（表3），制备其余SCC。在4 ˚C孵育15分钟。加入一滴抗大鼠和抗仓鼠Ig kappa微珠组中的阴性微珠（白色盖）。加入0.2 mL流式缓冲液。</li>
		<li>充分涡旋混合所有微珠悬液。SCC可在4 ˚C保存最多3天。 
		注意：荧光报告小鼠的SCC为未染色细胞。</li>
		<li>运行SCC时，设置电压，使SCC样本在相同检测器通道中的荧光峰值高于任何细胞样本的荧光信号。此外，电压应设置为使任一SCC在目标通道与其在其他任何通道的直方图峰值之间至少有0.5对数单位的差异（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以“低速”运行样本，保持每秒事件数低于4000。若无法适当降低流速，可用额外的冷流式缓冲液稀释样本。记录所加体积，因后续计数计算需要此数据（见代表性结果）。</li>
	<li>每个样本至少采集3 × 106个事件。由于色素颗粒和碎片在细胞仪上也被计为事件，此数值可能高于实际细胞数量。</li>
	<li>除活/死染料外，对每种荧光染料记录一个荧光减一对照（FMO），以用于第6.4节中的正确设门策略。FMO是指除一种荧光染料外其余均染色的样本。</li>
	<li>根据制造商或设施的操作说明清洁并关闭流式细胞仪。</li>
</ol>
6. 流式细胞术数据的注释
<ol>
	<li>使用分析软件打开一个新的工作表。从细胞仪导入所有样本和单色对照的 FCS 文件。</li>
	<li>使用单色对照（SCCs）创建补偿矩阵。</li>
	<li>将补偿矩阵应用于染色样本和荧光减一对照（FMOs）。</li>
	<li>使用荧光减一对照（FMOs）确定阳性染色以绘制设门。</li>
</ol>

<ol><li>Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+physiology+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage physiology in the eye.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).</li>
<li>Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Macrophages+Are+Necessary+for+Beta-Adrenergic+Receptor-Driven+Choroidal+Neovascularization+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).</li>
<li>O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Function+Is+Distinct+in+Different+Anatomical+Locations+during+Retinal+Homeostasis+and+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration.</a> Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).</li>
<li>Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+Conversion+During+Inflammation+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monocyte Conversion During Inflammation and Injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).</li>
<li>Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+monocytes+and+macrophages+for+the+inflammatory+response+in+acute+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury.</a> Frontiers in Physiology. 3, 56(2012).</li>
<li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li>
<li>Sutti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+Mediates+the+Development+of+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+during+Hepatic+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation.</a> Cells. 8 (9), 1099(2019).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+Expressing+VEGF+and+Arginase-1+Following+Uptake+of+Damaged+Retinal+Pigment+Epithelium+Suggests+Potential+Mechanism+That+Drives+the+Onset+of+Choroidal+Angiogenesis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice.</a> PLoS One. 8 (8), 72935(2013).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zbtb46+expression+distinguishes+classical+dendritic+cells+and+their+committed+progenitors+from+other+immune+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).</li>
<li>Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-Production+by+CCR2-Dependent+Macrophages+Contributes+to+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization.</a> PLoS One. 9 (4), 94313(2014).</li>
<li>Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ocular+dendritic+cells+in+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">The role of ocular dendritic cells in uveitis.</a> Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Science Reports. 6, 20636(2016).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+microglia%2C+and+not+peripheral+macrophages%2C+are+the+main+source+of+brain+tumor+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells.</a> International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).</li>
<li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).</li>
<li>Nozaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drusen+complement+components+C3a+and+C5a+promote+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).</li>
<li>Tsutsumi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+role+of+ocular-infiltrating+macrophages+in+the+development+of+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization.</a> Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).</li>
<li>Subhi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+CD11b+%2BMonocytes+and+Anti%E2%80%93Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Injections+in+Treatment+of+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration+and+Polypoidal+Choroidal+Vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy.</a> JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Expression+of+CD46+and+CD59+on+Leukocytes+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22AJOPHT%22%5BJournal%5D)">Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).</li>
<li>Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+is+major+stimulator+in+model+of+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).</li>
<li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).</li>
<li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814(2011).</li>
<li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li>
<li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li>
<li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

多参数流式细胞术可对复杂组织中的多种细胞类型进行定量分析。本报告中，我们描述了在小鼠眼部激光损伤后，通过流式细胞术检测单核吞噬细胞群体（包括单核细胞、树突状细胞以及巨噬细胞亚群）的方法。Liyanage 等人近期报道了一种类似的设门策略，用于检测中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、树突状细胞（DC）、巨噬细胞、浸润性巨噬细胞和单核细胞27。我们的设门策略主要区别在于加入了CD64标记。Liyanage 等人将树突状细胞定义为CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+细胞，巨噬细胞定义为CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G-细胞。我们则将树突状细胞定义为CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF<...

先天免疫系统包含多种细胞类型，可刺激补体激活和炎症反应。先天免疫细胞包括自然杀伤（NK）细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞以及单核吞噬细胞。单核吞噬细胞由单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞组成，已被证实参与多种眼科疾病的病理生理过程，包括葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变以及年龄相关性黄斑变性（AMD）1。在本实验方案中，我们将重点介绍在新生血管性AMD小鼠模型中，利用多参数流式细胞术鉴定单核吞噬细胞的方法2。该方案也可适用于糖尿病视网膜病变和/或葡萄膜炎的小鼠模型，但由于这些疾病具有全身性特征，建议进行更广泛的ocular解剖。
单核吞噬细胞表达重叠的细胞表面标志物。长期存在的组织驻留型巨噬细胞和小胶质细胞起源于卵黄囊来源的红髓系祖细胞3，而循环巨噬细胞和树突状细胞则由骨髓来源的巨噬细胞-树突状细胞祖细胞分化而来4。在小鼠中，单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞共有的细胞表面标志物包括 CD45、CD11b5、F4/806、Cx3cr17，以及细胞内标志物 Iba18。为克服这一难题，通过对多个组织来源的巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞进行转录组分析，确定 CD64 为巨噬细胞特异性的细胞表面标志物6。在健康眼组织中，虹膜、脉络膜、睫状体和视神经中均已有巨噬细胞的描述3。相比之下，树突状细胞的鉴定更为困难；目前最特异的树突状细胞鉴定方法依赖于使用 Zbtb46-GFP 报告小鼠进行细胞命运图谱分析9。除该报告小鼠外，通过 CD11c 和 MHCII 的表达结合 CD64 的缺失，也可识别潜在的树突状细胞6,10。在正常眼组织中，角膜、结膜、虹膜和脉络膜中均已鉴定出树突状细胞11。小胶质细胞是位于视网膜内的特化巨噬细胞，受血-视网膜屏障保护，并起源于卵黄囊前体细胞12。因此，视网膜小胶质细胞可通过其 CD45 表达水平较低13以及 Tmem119 高表达（已有适用于流式细胞术的抗体）与单核细胞来源的巨噬细胞相区分14。然而，在小胶质细胞活化后，CD45 可能上调15，而 Tmem119 可能下调3，这体现了小胶质细胞生物学的复杂性，在年龄相关性黄斑变性（AMD）及其小鼠模型中可能具有重要意义。最后，单核细胞至少可分为两类亚型：经典型和非经典型。经典型单核细胞表达 CCR2+Ly6ChighCX3CR1low 表型，而非经典型单核细胞则表达 CCR2-Ly6ClowCX3CR1high 标志物5。
由于需要对标志物表达水平进行定量分析（即高水平与低/弱表达水平的区分），多参数流式细胞术是区分眼组织及其他组织中单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞和树突状细胞的理想方法。该方法的其他优势包括可鉴定亚群、能够利用荧光激活细胞分选（FACS）对细胞群体进行分选以用于转录组或蛋白质组学分析，以及命运图谱追踪。多参数流式细胞术的主要缺点在于无法保留组织结构信息。这一局限可通过将眼部解剖为不同的眼内亚区（如角膜、结膜、虹膜、晶状体、视网膜以及脉络膜-巩膜复合体）来克服。此外，可辅以免疫荧光成像进行验证，但该方法受限于可检测标志物的数量，且缺乏可靠的定量能力。
全基因组关联研究已将多种补体基因与年龄相关性黄斑变性（AMD）联系起来16。补体激活可导致过敏毒素的产生、白细胞募集以及继发性炎症反应。在补体受体缺陷型小鼠中，激光损伤导致的单核吞噬细胞募集减少，且激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）面积减小17。类似地，C-C基序趋化因子受体2（CCR2）基因敲除小鼠因组织中单核细胞募集功能缺陷，也表现出单核吞噬细胞募集减少以及激光诱导的CNV面积减小18。这些数据表明补体系统和单核吞噬细胞与实验性CNV以及可能的新生血管型AMD相关。支持这一关联的证据显示，新生血管型AMD患者外周血单核细胞上的补体受体表达失调19,20。这些结果表明AMD与单核吞噬细胞之间存在显著关联。
在本研究中，我们将采用实验性激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）模型，通过多参数流式细胞术对小鼠眼部的单核吞噬细胞群体进行表征。激光诱导的CNV是新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）的标准小鼠模型，已用于验证当前一线治疗方案的有效性21。本实验方案将描述小鼠眼球的摘除、眼部组织解剖、消化制备单细胞悬液、抗体染色、利用单色对照确定激光电压，以及使用荧光减一（FMO）对照进行设门策略分析。有关激光诱导CNV模型的详细描述，请参见先前发表的研究22。通过本方案，我们将鉴定小胶质细胞、单核细胞、树突状细胞及巨噬细胞群体。此外，我们将利用MHCII和CD11c进一步定义激光诱导CNV模型中的巨噬细胞亚群。

<table><tbody><tr><td>0.6 ml 微型离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml 微量离心管</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>431031</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1× HBSS，500 ml</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml 注射器</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>20% 甲醛溶液</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>30 G 针头</td><td>Exel</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 鲁尔锁型注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955457</td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8 mm 聚苯乙烯称量皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96孔U型底无盖检测板</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>胺反应性微珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>分析软件</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠和抗仓鼠Ig kappa微珠试剂盒</td><td>BD 生物科学</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>补偿微珠</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>计数微珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>消化酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>国家光学与科学仪器公司</td><td>DC3-420T</td><td></td></tr><tr><td>解离管</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>罗氏</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>电子解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva 软件</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc阻断剂，大鼠抗小鼠CD16/CD32</td><td>BD 生物科学</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Integra Miltex</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>流动缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式管</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>仓鼠抗小鼠 CD11c BV421</td><td>BD 生物科学</td><td>562782</td><td></td></tr><tr><td>冰桶</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>活/死染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>裂解液，10倍浓缩液</td><td>BD 生物科学</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管及管架</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗小鼠CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗小鼠 NK1.1 PECF594</td><td>BD 生物科学</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液器吸头</td><td>德文特科学</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>P2 移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2 移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>P20 移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>P200 移液器吸头</td><td>德文特科学</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>P200 移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 B220 PECF594</td><td>BD 生物科学</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD11b APC-Cy7</td><td>BD 生物科学</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD19 AlexaFluor 700</td><td>BD 生物科学</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD19 PE</td><td>BD 生物科学</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD4 PECF594</td><td>BD 生物科学</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD45 FITC</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD45 PE-Cy7</td><td>BD 生物科学</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD8 PECF594</td><td>BD 生物科学</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Ly6C</td><td>BD 生物科学</td><td>561085</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Ly6G PECF594</td><td>BD 生物科学</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Siglec F PECF594</td><td>BD 生物科学</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD 生物科学</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>无菌细胞筛，40 mm 尼龙网</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>无菌水，500 ml</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr><tr><td>水平转子离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠全眼球消化用于单核吞噬细胞的多参数流式细胞术分析

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

先天免疫系统在眼部病理生理过程中发挥着重要作用，包括葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变以及年龄相关性黄斑变性。先天免疫细胞，特别是单核吞噬细胞，表达重叠的细胞表面标志物，这使得鉴定这些细胞群体具有挑战性。多参数流式细胞术可同时对多种细胞表面标志物进行定量分析，从而区分小鼠眼内的单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞和树突状细胞。本方案描述了完整小鼠眼球的摘除、眼部解剖、消化为单细胞悬液，以及对单细胞悬液进行髓系细胞标志物染色的步骤。此外，我们还解释了如何使用单色对照确定合适的电压，以及如何利用荧光减一对照（fluorescence minus one controls）划定阳性门控范围。多参数流式细胞术的主要局限性在于无法保留组织结构信息。这一局限可通过分别对眼内不同解剖区域进行多参数流式分析，或结合免疫荧光染色加以弥补。然而，免疫荧光技术受限于缺乏定量分析能力，且大多数显微镜可检测的荧光染料数量有限。我们介绍了利用多参数流式细胞术对激光诱导的脉络膜新生血管中单核吞噬细胞进行高通量定量分析的方法。此外，多参数流式细胞术还可用于巨噬细胞亚群的鉴定、细胞命运示踪，以及为转录组学或蛋白质组学研究进行细胞分选。

图1 显示了SCC和细胞在红色激光下的非补偿频率直方图：Alexa647、Alexa700和APC-Cy7。在 图1A，品红色线条表示 Alexa647 的 SCC 峰值，而青色线条表示预期的 0.5 Log 差异。注意 Alexa700 和 APC-Cy7 的峰值位于青色线条左侧（亮度较低）。还需注意，所有细胞均位于品红色线条左侧。任何位于 SCC 峰值右侧的细胞均未被补偿。根据荧光染料的化学特性，某些特定通道已知会渗漏至其他通道（例如，紫激光：BV421 -&gt; V500，黄绿激光：PE -&gt; PE-CF594，红色激光：Alexa647&gt; Alexa700，Alexa700 -&gt; APC-Cy7，交叉激光：PE-Cy7 -&gt; APC-Cy7）。如果上述任一条件未满足，则可向上调整一个通道的电压，同时将任何溢出通道向下调整。参见 图1B 和 图1C 有关红激光的更多示例...

本方案提供了一种将完整眼球消化为单细胞悬液的方法，用于多参数流式细胞术分析，以鉴定特定的眼部单核吞噬细胞群体，包括单核细胞、小胶质细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

先天免疫系统在眼部病理生理过程中发挥重要作用，包括葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性。

本方案旨在将完整的小鼠眼球消化为单细胞悬液，用于对包括巨噬细胞、单核细胞、小胶质细胞和树突状细胞在内的单核吞噬细胞进行多参数流式细胞术分析。该技术的主要优势在于能够利用荧光强度的定量分析，通过细胞表面标志物的表达来区分亲缘关系密切的不同细胞类型。我们的方案已针对激光诱导脉络膜新生血管模型中常驻和浸润性巨噬细胞群体的异质性分析进行了优化。然而，这些概念和技术同样可应用于其他模型，如糖尿病性视网膜病变、实验性自身免疫性葡萄膜炎以及系统性红斑狼疮的表现。在实施本方案时，了解您所用流式细胞仪的配置是至关重要的起点，因为并非所有流式细胞仪的配置完全相同。因此，可能需要对荧光标记抗体的用量进行滴定，和/或根据您仪器的配置调整荧光染料，以优化实验方案。根据手稿说明配制消化缓冲液。在解剖显微镜下以10倍总放大倍数操作，去除眼球上残留的结膜和视神经。将处理干净的眼球转移至干燥的解剖皿或小型称量舟中，然后沿视轴方向制作两个相互呈90度角的穿透性切口。使用带有30号针头的注射器，向每只眼睛的玻璃体腔内注射0.15至0.2毫升消化缓冲液。用弹簧剪刀和精细镊子将眼球组织剪碎，然后通过钝性机械分离法解离晶状体组织，以防止后续步骤中堵塞移液器吸头。每次处理不同样本时，用0.75毫升消化缓冲液冲洗镊子和剪刀，并更换培养皿。使用 P1000 移液器将培养皿中的内容物转移至冰上的解离管中，注意避免损失任何材料。用额外的 1.5 毫升消化缓冲液冲洗培养皿，并将冲洗液加入解离管中，使总体积达到 3.25 至 3.5 毫升。按照文本稿件中的描述，在电子解离仪上进行组织解离，确保所有组织均位于倒置的解离管底部，并与消化缓冲液充分接触。然后将解离管在37摄氏度、200转/分钟的条件下孵育30分钟。再重复组织解离过程两次，每次解离之间将样品在37摄氏度、200转/分钟的条件下孵育30分钟。为终止反应，加入10毫升预冷的流式缓冲液，并将样品管置于冰上。为了制备单细胞悬液，将终止后的眼球消化反应液通过置于50毫升锥形离心管顶部的40微米滤膜过滤。使用2.5毫升注射器的推杆将未完全消化的眼球组织残余物压过滤膜。用10毫升流式缓冲液冲洗消化管，并淋洗滤膜。然后使用同一支推杆将未消化的眼组织碎片再次通过滤膜。用5毫升流式缓冲液重复此过程。最后用10毫升流式缓冲液冲洗消化管和滤膜。将锥形管在4 °C条件下以400 × g离心10分钟，倾去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。通过轻轻敲击试管与其他试管碰撞使沉淀松散。然后加入1 mL裂解液，在室温下轻轻旋转试管30秒，以裂解红细胞。用20毫升流式缓冲液终止反应，将锥形管在4 °C条件下以400 × g离心10分钟。倾去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。轻轻敲击试管管壁以重悬细胞沉淀。然后加入 5 毫升冷的 HBSS。重复离心并弃去上清液。使用 P1000 移液器向每个样品中加入 0.5 毫升活死染料，确保充分解离沉淀。 将样品转移至1.2毫升微量离心管中，在避光条件下孵育15分钟。同时，取10微升样品与台盼蓝混合，使用血细胞计数板进行细胞计数。孵育结束后，向每份样品中加入400微升预冷的流式缓冲液，洗涤细胞。将试管置于微量离心管架中，在4°C条件下以400 × g离心10分钟，随后吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用500 µL预冷的流式缓冲液完全重悬细胞。然后重复离心步骤，并移除上清液。在50微升FC阻断液中封闭最多五百万个活细胞。充分重悬细胞沉淀，并在4摄氏度下孵育20分钟。然后向每个样本中加入50微升抗体染色溶液。充分混匀，并在4°C下再孵育30分钟。此处显示的是来自单只小鼠两只眼睛的所有分析事件的前向散射面积相对于侧向散射面积特性。通过绘制PE相对于APC-Cy7的图谱来清洗并确认微球计数，形成一个紧密的PE阳性、APC-Cy7阴性事件簇。接下来，从所有事件中鉴定出活细胞中的单细胞。单细胞的前向散射光高度与前向散射光面积呈正相关，而双细胞和三细胞聚集体的前向散射光面积大于前向散射光高度。活细胞为前向散射光面积阳性，且活死染色阴性。此处展示了从活单核细胞中圈定单核吞噬细胞的初始设门策略。使用CD45与CD11b图显示活单细胞群。CD45 FMO中缺乏CD45阳性细胞，证实了设门选择的准确性。接下来，通过绘制CD45阳性活单细胞在谱系门控与CD11b上的表达情况，排除中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞、K细胞和T细胞。CD45弱表达细胞与CD45高表达细胞被区分开来。同时鉴定了巨噬细胞亚群。小胶质细胞通过CD45低表达、CD64阳性且MHC2低表达的细胞群进行界定。MHC2阴性巨噬细胞被鉴定为CD64阳性且MHC2阴性。CD11c阴性和CD11c阳性巨噬细胞则表现为CD64阳性且CD11c阴性。以及在MHC2阳性细胞中CD64阳性且CD11c阳性的细胞。研究发现，激光处理增加了MHC2阴性、CD11c阴性以及CD11c阳性巨噬细胞的数量。树突状细胞的数量也因激光处理而上调，而小胶质细胞和单核细胞的数量未受到影响。全身灌注对巨噬细胞数量无影响。通过该操作，相较于仅进行分析，荧光激活细胞分选可进一步表征巨噬细胞的异质性，并通过转录组学或蛋白质组学研究揭示其对功能的影响。

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

全鼠眼的消化，用于单核噬细胞的多参数流细胞学分析

本视频演示了在小鼠眼内玻璃体腔注射后，通过流式细胞术检测小胶质细胞对荧光生物颗粒的摄取。流式细胞术可检测表达 CD11b 的活细胞，并能将表现出绿色荧光的吞噬性小胶质细胞与其他髓系细胞（包括表达 Ly6C 的单核细胞和表达 Ly6G...

使用流式细胞术检测小胶质细胞对玻璃体内递送的荧光颗粒的摄取

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，具有高度吞噬或摄取其细胞外环境中物质的能力。本文介绍了一种广泛适用、可靠且高度定量的检测方法，用于可视化并测量小胶质细胞介导的突触组分的吞噬作用。...

一种吞噬作用检测方法：评估中枢神经系统吞噬细胞与神经元相互作用的实验方案

小胶质细胞的吞噬作用对于维持组织稳态至关重要，而吞噬功能不足已被认为与多种病理过程相关。然而，评估小胶质细胞功能 体内...

评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能 体内 使用基于流式细胞术的检测方法

对眼循环中标记的血细胞进行活细胞成像，可提供有关糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中炎症与缺血的信息。本文描述了一种标记血细胞并在视网膜循环中对这些标记细胞进行成像的实验方案。...

荧光染料标记红细胞和白细胞以研究小鼠视网膜循环中的血流动力学

本方案通过流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞亚群，有助于研究这些细胞表达的多种标志物。...

通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

数百万人患有导致不可逆失明的视网膜退行性疾病。这些疾病的一个共同特征是视网膜神经节细胞（RGCs）的丧失。本详细实验方案描述了通过流式细胞术结合阳性与阴性筛选方法分离原代小鼠RGCs的技术。...

通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）

用于定量评估淋巴细胞趋化性和迁移性的实验方案是免疫学研究中的重要工具。此处，一个 体外 该方案可实现对细胞迁移进行实时、多重评估，以及一种互补的 体内...

量化人单核细胞趋化性 体外 和小鼠淋巴细胞迁移 体内

本文介绍了利用旋转盘共聚焦显微镜对小鼠腹腔常驻巨噬细胞的单个吞噬事件进行成像的方法。该方案可拓展应用于其他吞噬性细胞。...

小鼠巨噬细胞吞噬作用的延时三维成像

本实验方案的目的是利用已描述的标记物鉴定肝脏内的淋巴管内皮细胞群体。我们采用胶原酶IV和DNase对组织进行轻柔剪切，并结合流式细胞术，以鉴定出一群独特的淋巴管内皮细胞。...

小鼠肝脏消化用于淋巴管内皮细胞的流式细胞术分析

本方案最初由 Fernandez-Godino 等人于 2016 年报道1，描述了一种高效分离和培养小鼠 RPE 细胞的方法，这些细胞在 Transwell 培养板上一周内即可形成具有功能性和极性的 RPE 单层。该操作过程约需 3...

高效分离与原代培养小鼠视网膜色素上皮细胞

通过球后注射荧光番茄凝集素后，采用血小板源性生长因子受体β的免疫荧光染色检测视网膜血管中的周细胞。标记后的视网膜经组织透明化处理，并整体封片，以便在共聚焦显微镜下观察围绕视网膜血管的周细胞的三维结构。...

通过免疫染色法对小鼠视网膜血管周细胞进行三维可视化观察

学习全鼠眼消化制备单细胞悬液的方法，用于多参数流式细胞术分析单核吞噬细胞群，包括巨噬细胞、小胶质细胞和树突状细胞。该技术可定量分析荧光强度以区分细胞表面标志物表达相近的细胞类型，适用于糖尿病视网膜病变和自身免疫性葡萄膜炎等模型研究。

小鼠全眼球消化用于单核吞噬细胞的多参数流式细胞术分析

探索更多视频