小鼠全眼球消化用于单核吞噬细胞的多参数流式细胞术分析

本方案旨在将完整的小鼠眼球消化为单细胞悬液，用于对包括巨噬细胞、单核细胞、小胶质细胞和树突状细胞在内的单核吞噬细胞进行多参数流式细胞术分析。该技术的主要优势在于能够利用荧光强度的定量分析，通过细胞表面标志物的表达来区分亲缘关系密切的不同细胞类型。我们的方案已针对激光诱导脉络膜新生血管模型中常驻和浸润性巨噬细胞群体的异质性分析进行了优化。

然而，这些概念和技术同样可应用于其他模型，如糖尿病性视网膜病变、实验性自身免疫性葡萄膜炎以及系统性红斑狼疮的表现。在实施本方案时，了解流式细胞仪的配置是至关重要的起点，因为并非所有流式细胞仪的配置都完全相同。因此，可能需要对荧光标记抗体的用量进行滴定，和/或根据您所用流式细胞仪的配置调整荧光染料，以优化实验方案。

根据手稿说明配制消化缓冲液。在解剖显微镜下以10倍总放大倍数操作，去除眼球上残留的结膜和视神经。将清洁的眼球转移至干燥的解剖皿或小型称量舟中，然后沿视轴方向制作两个相互成90度角的穿通伤口。

使用带有30号针头的注射器，向每只眼睛的玻璃体腔内注射0.15至0.2毫升消化缓冲液。用弹簧剪刀和精细镊子将眼球组织剪碎，然后通过钝性机械分离法解离晶状体组织，以防止后续步骤中堵塞移液器吸头。每次处理不同样本时，用0.75毫升消化缓冲液冲洗镊子和剪刀，并更换培养皿。

使用 P1000 移液器将培养皿中的内容物转移至冰上的解离管中，注意避免损失任何材料。用额外的 1.5 毫升消化缓冲液冲洗培养皿，并将其加入解离管中，使总体积达到 3.25 至 3.5 毫升。按照文稿中所述，在电子解离仪上进行组织解离，确保所有组织均位于倒置的解离管底部并与消化缓冲液充分接触。

然后将解离管在 37 摄氏度、200 转/分钟的条件下孵育 30 分钟。重复组织解离过程两次，每次解离之间将样品在 37 摄氏度、200 转/分钟的条件下孵育 30 分钟。为终止反应，加入 10 毫升预冷的流式缓冲液，并将样品管置于冰上。

为了制备单细胞悬液，将终止消化的眼组织反应液通过置于50毫升锥形离心管顶部的40微米滤膜过滤。使用2.5毫升注射器的推杆将未完全消化的眼组织残余物压过滤膜。用10毫升流式缓冲液洗涤解离管，并冲洗滤膜。

然后使用同一支推杆再次将未消化的眼组织碎片通过滤膜。用5毫升流式缓冲液重复此步骤。最后用10毫升流式缓冲液冲洗消化管和滤膜。

将锥形管在4°C条件下以400 × g离心10分钟，倾去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。通过轻轻敲击试管与其他试管碰撞使沉淀松散。然后加入1毫升裂解液，在室温下轻轻旋转试管30秒，以裂解红细胞。

用20毫升洗脱缓冲液终止反应，将锥形管在4 °C条件下以400 × g离心10分钟。倾去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。轻轻敲击试管管壁，使其与另一试管碰撞振荡。

然后加入 5 mL 冷的 HBSS。重复离心并弃去上清液。使用 P1000 移液器向每个样品中加入 0.5 mL 活死染料，确保充分解离沉淀物。

将样品转移至1.2毫升微量离心管中，在避光条件下孵育15分钟。同时，取10微升样品与台盼蓝混合，使用血细胞计数板进行细胞计数。孵育结束后，向每份样品中加入400微升预冷的流式缓冲液，洗涤细胞。

将微孔板架中的离心管在4°C条件下以400 × g离心10分钟，然后吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用500 µL冷流式缓冲液将细胞完全重悬。随后重复离心步骤，并移除上清液。

在50微升FC封闭液中封闭最多五百万个活细胞。充分重悬细胞沉淀，并在4摄氏度下孵育20分钟。然后向每个样本中加入50微升抗体染色溶液。

充分混匀，并在4°C下再孵育30分钟。此处显示的是来自单只小鼠两只眼睛所有分析事件的前向散射面积与侧向散射面积特性。通过绘制PE相对于APC-Cy7的信号，验证微球计数，形成一个紧密的PE阳性、APC-Cy7阴性事件簇。

接下来，从所有事件中鉴定出活细胞中的单细胞。单细胞的前向散射光高度与前向散射光面积呈正相关，而双细胞和三细胞聚集体的前向散射光面积大于前向散射光高度。活细胞为前向散射光面积阳性，且活/死染料染色阴性。

此处展示了从活单核细胞中圈定单核吞噬细胞的初始设门策略。使用CD45与CD11b图显示活单细胞群。CD45 FMO中缺乏CD45阳性细胞，证实了设门选择的准确性。

接下来，通过绘制CD45阳性活单细胞在谱系门控与CD11b之间的分布图，排除中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞、K细胞和T细胞。CD45弱表达细胞与CD45高表达细胞区分开来。同时鉴定了巨噬细胞亚群。

小胶质细胞通过CD45低表达细胞中CD64阳性且MHC2低表达的染色来界定。MHC2阴性巨噬细胞被鉴定为CD64阳性且MHC2阴性。CD11c阴性和CD11c阳性巨噬细胞分别表现为CD64阳性CD11c阴性。

以及在MHC2阳性细胞中CD64阳性且CD11c阳性的细胞。研究发现，激光处理增加了MHC2阴性、CD11c阴性以及CD11c阳性巨噬细胞的数量。树突状细胞的数量也因激光处理而上调，而小胶质细胞和单核细胞的数量未受到影响。

全身灌注对巨噬细胞数量无影响。通过该操作，相较于仅进行分析，荧光激活细胞分选可进一步通过转录组学或蛋白质组学研究来表征巨噬细胞的异质性及其对功能的影响。