利用双侧子宫内电穿孔技术研究基因对啮齿类动物行为影响的实验流程

使用该方法有助于揭示特定基因表达变化如何导致与神经系统疾病相关的病理过程。该技术的优势在于无需创建或购买遗传动物品系，从而避免了耗时数年进行构建和验证的过程。该技术可用于研究与神经系统疾病相关的基因。

确定特定基因如何参与疾病发生是开发新型疗法的重要步骤。本方案的优势在于学习如何操作胚胎，使实验者能够在不降低胚胎存活率的情况下完成基因转移步骤。该方法的可视化演示非常重要，因为胚胎非常脆弱，观察经验丰富的实验者在操作过程中如何处理胚胎将大有帮助。

在手术前至少30分钟将怀孕的母鼠带至手术区域。使用灭菌杀菌湿巾对整个手术区域进行消毒，然后用70%乙醇擦拭。随后，将高压灭菌的器械在玻璃珠灭菌器中进行灭菌。

将无菌 PBS 转移至 50 毫升锥形管中，并将管子置于 38 至 40 摄氏度的水浴中。使用温度计检测无菌生理盐水的温度。打开水浴循环加热泵，使其升温至 37 摄氏度。

然后打开压力注射仪和电穿孔仪，并确保其正常工作。将质粒DNA溶液在台式离心机上短暂离心，随后置于冰上。使用拉针仪拉制玻璃移液管，使拉制后的玻璃移液管尖端直径约为50微米。

然后用20至40微升的DNA溶液填充移液管。准备好手术所需的所有物品，包括脱毛剂、碘液、70%乙醇、棉签、眼药水、缝合线和纱布。准备手术单并填写必要的信息。

手术前称量小鼠体重并记录。麻醉小鼠后，给予术前镇痛药，并使用脱毛膏或剃刀去除腹部毛发。用聚维酮碘和70%乙醇擦拭腹部三次，对腹部进行消毒。

用无菌纱布和铺巾在腹部周围创建一个无菌区域。用镊子提起腹壁皮肤，避免损伤下方肌肉，沿腹中线切开皮肤。随后提起肌肉并切开，注意避免损伤重要器官。

使用有齿镊子小心地将子宫角从母鼠体内拉出，并轻柔地放置于无菌区域，确保用垫料支撑好子宫角，避免过度牵拉远离母体。在整个手术剩余过程中，始终用预热的无菌 PBS 保持子宫角湿润。用镊子或手指固定好胚胎位置，然后小心地将拉制的玻璃移液管插入侧脑室，将移液管先后插入两个侧脑室，每次注入两到三微升液体。

如果注射后出现新月形，则表明已成功靶向脑室。为了在额叶皮层双侧转染细胞，将两个负极电极置于胚胎头部两侧，位于侧脑室外侧稍偏尾侧的位置，正极电极置于两眼之间，位于正在发育的吻部前方。确保胚胎充分湿润，并施加四个方波脉冲。

逐个注射并电穿孔所有胚胎，确保每个胚胎在注射DNA溶液后立即进行电穿孔。所有胚胎电穿孔完成后，小心地将子宫角重新放回腹腔内。用无菌PBS润湿腹腔，以帮助子宫角的复位。

用无菌 PBS 填充腹腔，确保缝合完成后无残留气泡。使用可吸收缝线缝合肌肉，用丝线不可吸收缝线缝合皮肤。将母鼠置于加热舱内，使其完全恢复至少一小时。

在接下来的48小时内定期检查母鼠。随着母鼠从麻醉中恢复并恢复意识，它将开始活动和甩动胡须。该方法用于将约5,000个第2/3层锥体神经元转染pCAG-GFP质粒。

这些细胞大多定位于额叶皮层区域。一个代表性示例显示了成年对照小鼠中转染神经元的头尾分布情况，证实了双侧子宫内电转（IUE）能够靶向并遗传标记额叶皮层中大量锥体神经元的能力。母体互动任务的第一部分用于测试对照组 P18 转染小鼠寻找巢穴垫料的能力。

对照小鼠探索其巢材的时间长于探索新鲜垫料的时间，表明它们具有完整的感官运动能力和探索行为。该实验的第二部分利用了小鼠倾向于与母鼠互动的特性。在此任务中，幼鼠大部分时间停留在母鼠附近，而探索空杯或巢材的时间显著减少。

成年对照小鼠探索新物体的时间约占35%。当同时呈现新物体和熟悉物体时，成年小鼠探索新物体的时间更长。在社交性任务中，对照组成年小鼠探索新小鼠和空杯所花费的时间相似。

通过标记小鼠的多个部位（包括四肢、质心、头部和耳朵），使用 DeepLabCut 软件自动追踪该行为。该软件还通过检测小鼠身体长度的变化来判断其是否处于直立状态，因为当小鼠直立时，其身体长度会变短。完成此操作后，可通过检测组织并分析树突棘密度或多种蛋白质的表达水平等指标，回答许多细胞与分子层面的问题。