伽马修饰肽核酸在有机溶剂混合物中的自组装形成复杂纳米结构

本创新性实验方案描述了利用合成核酸类似物γ-PNA的多种不同序列，在特定有机溶剂混合物中形成纳米结构的方法。本文所述实验表明，有必要将现有的核酸纳米技术方案拓展至有机溶剂体系，而目前在此类体系中报道的方案极少。由于纳米材料PNA易于发生聚集，刚接触该技术的研究人员可能会发现，难以将为高水相环境开发的现有方案直接应用于富含有机溶剂的环境。

首先制备γ-PNA储备液。从商业供应商获得高效液相色谱（HPLC）纯化的γ-PNA单链后，将每条单链用去离子水重悬至300微摩尔浓度。γ-PNA可在-20摄氏度下保存数月。

准备进行自组装时，需在75% DMSO、75% DMF和40% 1,4-二氧六环中制备退火批次样品。首先，通过从主溶液中取0.67微升分装，并加入去离子水至终体积为10微升，配制每种寡核苷酸的20微摩尔子储备液。从20微摩尔子储备液中各取1微升，加入至一个200微升PCR管中，九种寡核苷酸总体积共计9微升。

加入30微升无水DMSO或DMF，并额外加入1微升去离子水，最终体积为40微升。制备40% 1,4-二氧六环批次时，加入16微升1,4-二氧六环，并用去离子水定容至40微升。将样品在热循环仪中退火22.5小时，温度从90摄氏度降至20摄氏度。

通常，在不同溶剂条件下，二聚体和三聚体γ型PNA亚群的熔解温度范围为40至70摄氏度。根据手稿说明设置热循环仪程序。退火完成后，样品可在4摄氏度下保存12至24小时，随后进行表征。

用一个空的移液枪头盒制作一个湿度盒，向盒内加入约五毫升水。将市售的2%醋酸戊酯火棉胶溶液用异戊酸异戊酯溶剂稀释20倍，配制成硝酸纤维素溶液。用镊子将盖玻片浸入硝酸纤维素溶液中，取出后使其自然风干，然后使用载玻片、两条双面胶带和涂有硝酸纤维素的盖玻片组装成一个流动池室。

称取1毫克生物素化BSA，溶于1毫升PBS中，配制生物素化BSA溶液。以倾斜角度将15微升生物素化BSA溶液加入流动通道中，在湿化室中室温孵育2至4分钟。用15微升洗涤缓冲液（含1毫克BSA的1毫升PBS溶液）吹洗通道，去除未结合的生物素化BSA，随后将流动通道在湿化室中继续孵育2至4分钟，以封闭表面。

取0.5毫克链霉亲和素和1毫克BSA，溶于1毫升PBS中。用移液器将15微升链霉亲和素溶液加入流动通道，置于湿化室中孵育2至4分钟，然后用15微升洗涤缓冲液冲洗通道。接着，将15微升在湿化室中退火的γ-PNA寡核苷酸溶液流经通道，再用与纳米结构相同溶剂组成的含1毫摩尔Trolox的15微升溶液冲洗未结合的纳米结构。

将流动通道转移至载物片支架中，并使用配备TIRF成像功能、60倍油浸物镜和1.5倍放大镜的荧光显微镜进行成像。在监测Cy3通道的同时，以60倍或90倍放大倍数扫描流动通道。根据论文中的说明配制20%和6% SDS储备液，然后通过将每种20微摩尔的寡核苷酸各取一微升加入200微升PCR管中，退火gamma PNA寡核苷酸。

向 PCR 管中加入 30 微升无水 DMSO 和 1 微升 6% 或 20% SDS，终体积为 40 微升，对应的终浓度 SDS 分别为 5.25 或 17.5 毫摩尔。按照先前所述方法在热循环仪中退火 gamma PNA。使用 TIRF 或 TEM 方案表征在 SDS 存在下的 gamma PNA 纳米结构。

在75%DMSO中退火的γ-PNA寡聚体的TIRF成像显示出高度有序的结构，而在75%DMF中退火则形成棘状或针状纳米结构。40%1,4-二氧六环条件则产生稀疏分布的纤维状纳米结构。此外，在75%DMSO中形成的γ-PNA纳米管样品，经TEM成像在高倍率或纳米级分辨率下观察到纳米纤维的束状聚集。

对纳米结构宽度的定量分析显示，中位宽度为16.3纳米，最大值超过80纳米。替换连续γ型PNA的同序列DNA寡聚体形成了直的丝状结构，而替换交叉型γ型PNA则形成星状结构。使用连续DNA寡聚体替换的纳米结构，其中位宽度约为19纳米。

在高浓度SDS条件下，通过TIRF成像观察，γ型PNA纳米纤维相较于其临界胶束浓度时也呈现出高度网络化的形态。透射电镜（TEM）成像表明，在5.25毫摩尔SDS中，γ型PNA组装体的结构束集程度降低最为显著。在实施本实验方案时，必须注意保持所述的溶剂组成，因为纳米结构具有聚集倾向。

这些方法鼓励研究人员探索不同溶剂组成、表面活性剂以及其他PNA-DNA纳米结构的其他未开发途径。