Name: 将伽马改性肽核酸自组装成有机溶剂混合物中复杂的纳米结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学习伽马改性肽核酸在有机溶剂混合物中自组装成复杂纳米结构的方法。本研究提供适用于非水环境的核酸纳米技术新方案，帮助研究人员克服PNA聚集挑战并拓展纳米技术应用。

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本工作部分得到了美国国家科学基金会资助项目1739308、NSF CAREER资助项目1944130以及美国空军科学研究办公室资助项目FA9550-18-1-0199的支持。γPNA序列由Trucode Gene Repair, Inc.的Tumul Srivastava博士慷慨惠赠。我们感谢Erik Winfree博士和Rizal Hariadi博士在DNA设计工具箱MATLAB代码方面提供的有益讨论。我们还要感谢Joseph Suhan、Mara Sullivan以及生物成像中心在TEM数据采集方面提供的协助。

1. γPNA 序列设计
<ol>
	<li>从加州理工学院 Winfree 实验室开发的 DNA 设计工具箱22 下载至用于设计序列的编程脚本所在文件夹中23。</li>
	<li>在该序列设计文件夹中，打开一个支持扩展名为“ .m”的第四代编程语言环境，然后使用以下命令将先前下载的“DNAdesign”文件夹添加到路径中： 
	>> addpath DNAdesign</li>
	<li>随后使用以下命令运行名为“PNA3nanofiber.m”的脚本（见补充图1）： 
	>> PNA3nanofiber</li>
	<li>运行此脚本以生成名为“thisSeqs”和“thisScore”的变量。“thisSeqs”变量包含所设计的寡核苷酸序列，“thisScore”为惩罚评分。</li>
	<li>多次运行该脚本以获得最低评分。20次此类运行的示例见表1。</li>
	<li>手动确认所生成序列各结构域与指定的 SST 结构基序之间的 Watson-Crick 互补性。3-螺旋纳米纤维结构的序列设计规范见表2。</li>
	<li>对生成的序列进行以下验证：
	<ol>
		<li>避免使用四个连续的 C 和 G 碱基。</li>
		<li>手动选择特定序列，用于在 N 端功能化修饰荧光染料和生物素分子，以便开展荧光显微镜研究。</li>
		<li>在骨架上至少引入3个 mini-PEG γ 修饰，以实现单链寡核苷酸的预组织螺旋构象，如 Sahu et al.21 所述。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. γPNA 储备链的制备
<ol>
	<li>从商业供应商处获取指定序列的γPNA组分链，合成规模为50 nmol，并经过高效液相色谱（HPLC）纯化。</li>
	<li>将每条链用去离子水重悬至300 µM的浓度。将重悬后的链保存于-20 °C冰箱中，可保存数月，直至实验需要时使用。</li>
</ol>
3. γPNA 寡聚体亚群的熔解曲线研究
<ol>
	<li>通过在水性缓冲液（如1×磷酸盐缓冲液（PBS））或优选的极性有机溶剂（如二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO））中进行熔解曲线研究，获得不同互补2-寡聚体和3-寡聚体组合的熔解温度范围（见图2）。 
	注意：在DMF含量&#62;50%的条件下，热熔解曲线开始失去上基线，并表现出严重干扰，部分原因是DMF在实验所需波长下具有高吸光度。这一现象在文献中已有报道24。然而，在这些溶剂条件下，仍可在每条链浓度为5 µM时获得熔解曲线。
	<ol>
		<li>从每种寡聚体的300 µM储备液中取16.7 µL，用1× PBS、100%（v/v）DMSO或100%（v/v）DMF定容至1000 µL，最终获得每种寡聚体5 µM的终浓度。将该寡聚体子集混合物转移至光程为1 cm的石英比色皿中。</li>
		<li>在配备可编程温控模块的紫外-可见分光光度计中进行变温UV-Vis实验。</li>
		<li>在15‒90 °C的温度范围内，以0.5‒1 °C/min的速率采集冷却（退火）和加热（熔解）循环过程中的熔解曲线数据点。在开始冷却前，将样品在90 °C保持10分钟；在开始加热前，在15 °C保持10分钟。通过加热曲线一阶导数的峰值确定熔解温度（Tm）。</li>
		<li>验证在所有溶剂条件下，2-寡聚体子集的熔解温度范围均高于35 °C。此外，验证包含额外一条链的相应3-寡聚体子集相较于对应的2-寡聚体子集，Tm显著升高，这是由于协同性增强所致。 
		注意：这可验证多种寡聚体在单一体系中的自组装能够协同折叠形成具有合理热稳定性的目标纳米结构。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 多种不同γPNA寡聚体的自组装方案
注意：为了设计γPNA纳米结构的自组装热变协议，宜采用慢速升温退火程序。
<ol>
	<li>对于生成的寡聚序列，将样品在热循环仪中从90 °C降温至20 °C，退火22.5小时。通常，在不同溶剂条件下，2-寡聚体和3-寡聚体γPNA子集的熔解温度范围为40‒70 °C。</li>
	<li>热循环仪程序设置如下：90 °C保持5分钟，以0.1 °C/分钟的恒定速率从90 °C降至70 °C，再以0.1 °C/3分钟的速率从70 °C降至40 °C，然后以0.1 °C/分钟的速率从40 °C降至20 °C，最后在4 °C保持（见表3）。样品可在4 °C保存12‒24小时后再进行表征。 
	注意：虽然本研究的纳米纤维系统中的2-和3-寡聚体子集可在1×PBS中形成，但完整的微米级纳米纤维在1×PBS中会发生聚集。因此，应根据所形成结构的尺度与尺寸，以及γ修饰的类型和密度，优化溶剂条件。</li>
	<li>对于微米级长度的3螺旋纳米纤维，根据溶剂优化研究15，在75% DMSO:H2O（v/v）、75% DMF:H2O（v/v）或40% 1,4-二氧六环:H2O（v/v）中制备退火批次样品。</li>
	<li>按以下步骤制备退火批次（见表4）。首先，从每种寡聚体的300 µM主储备液中取0.67 µL，用去离子水定容至10 µL，配制成20 µM浓度的10 µL子储备液。</li>
	<li>从每种寡聚体的20 µM子储备液中各取1 µL，加入200 µL PCR管中。9种寡聚体共占体积9 µL。</li>
	<li>对于75% DMSO和75% DMF条件，加入30 µL无水DMSO或DMF，并额外加入1 µL去离子水，使终体积为40 µL，每种寡聚体的终浓度为500 nM。对于40%二氧六环溶剂条件，加入16 µL 1,4-二氧六环，并用去离子水定容至40 µL。</li>
	<li>将退火批次样品放入热循环仪，按照步骤4.2中所述程序进行退火。</li>
</ol>
5. 全内反射荧光（TIRF）显微成像
<ol>
	<li>使用一个空的移液枪头盒制备一个湿度培养箱。向盒内加入约 5 mL 水，以防止后续所述的样品流通道干燥（见图 3）。</li>
	<li>使用显微镜载玻片、2 条双面胶带和一片涂有硝酸纤维素的盖玻片制备流体腔室。要将盖玻片涂覆硝酸纤维素，可将盖玻片浸入盛有含 0.1% 醋酸戊酯火棉胶的烧杯中，然后空气干燥。
	<ol>
		<li>通过将市售的 2% 醋酸戊酯火棉胶用异戊酸酯溶剂稀释 20 倍，制备硝酸纤维素溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称取 1 mg 生物素化牛血清白蛋白（Biotin-BSA），溶于 1 mL 1× PBS 中，配制生物素化牛血清白蛋白（Biotin-BSA）溶液。将流通道倾斜放置，注入 15 μL 浓度为 1 mg/mL 的 Biotin-BSA 1× PBS 缓冲液。在湿润培养箱中室温孵育流通道 2–4 分钟。</li>
	<li>将 1 mg BSA 溶于 1 mL 1× PBS 中，制备洗涤缓冲液。用 15 μL 洗涤缓冲液冲洗未结合的 Biotin-BSA。为封闭表面，将流通道在湿润培养箱中室温孵育 2–4 分钟。</li>
	<li>称取 0.5 mg 链霉亲和素和 1 mg BSA，用 1 mL 1× PBS 溶解，制备链霉亲和素溶液。注入 15 μL 含 1 mg/mL BSA 的 0.5 mg/mL 链霉亲和素 1× PBS 溶液至流通道中。在湿润培养箱中室温孵育流通道 2–4 分钟。用 15 μL 洗涤缓冲液冲洗未结合的链霉亲和素。</li>
	<li>注入 15 μL 预先退火的 γPNA 寡核苷酸混合物，每条链浓度为 500 nM，溶剂条件为 75% DMSO、75% DMF 或 40% 1,4-二氧六环。</li>
	<li>通过将 DMSO 中 10 mM 的 Trolox 储液稀释 10 倍，配制 1 mM Trolox 溶液（称取 2.5 mg Trolox 溶于 1 mL DMSO 中）。使用与纳米结构相同溶剂组成的 1 mM Trolox 溶液 15 µL，洗涤流通道中未结合的纳米结构。 
	注意：流通道中 &#62;50% 的 DMSO 含量会在 TIRF 成像过程中因溶剂折射率不同而引起轻微信号干扰，而 TIRF 通常针对盖玻片-水界面的临界角进行校准。可通过使用去离子水将 10 mM Trolox 溶液稀释 10 倍制备的 1 mM Trolox 溶液进行洗涤来消除该干扰。该方法可获得更清晰的图像，但仅适用于判断结构是否形成，因为其会在流通道中产生两相微气泡。因此，纳米结构可能出现在两相界面处，如图 4D所示。</li>
	<li>将流通道转移至载物台支架上，使用配备 TIRF 成像功能、60 倍油镜和 1.5 倍放大镜的荧光显微镜进行成像。通过监测 Cy3 通道，在 60 倍或 90 倍放大下扫描流通道（见图 4）。</li>
</ol>
6. 透射电子显微镜（TEM）成像
<ol>
	<li>称取0.5 g醋酸铀酰溶于50 mL蒸馏水中，配制1%醋酸铀酰水溶液染色液。使用连接在注射器上的0.2 μm滤膜过滤1%醋酸铀酰水溶液染色液。 
	注意：也可直接从商业供应商购买2%醋酸铀酰水溶液。</li>
	<li>购买市售的300目铜网，其表面预先镀有formvar支持膜。 
	注意：需注意formvar支持膜在DMSO等溶剂中超过2分钟即可能被溶解。对于较长时间的样品孵育，可选用市售的在铜网上以一氧化硅稳定处理的formvar膜，此类网格比碳涂层网格更具亲水性，并能耐受更剧烈的样品处理条件和电子束照射，如图5C所示。</li>
	<li>将4 μL样品溶液滴加至网格上，孵育15秒。用一片滤纸从侧面接触网格，吸除多余样品。</li>
	<li>立即在网格上滴加4 μL染色液，染色5秒。</li>
	<li>同前法吸除染色液，并将滤纸紧贴网格保持1‒2分钟，确保网格完全干燥。染色后样品通常应在1‒2小时内进行成像。或者，若确认网格已完全干燥，可将网格置于透射电镜网格储存盒中，最多保存3天后再进行成像。</li>
	<li>将网格转移至透射电镜样品 holder 中，使用80 kV加速电压的透射电镜进行成像，放大倍数范围为10 K至150 K（见图5）。</li>
</ol>
7. 基于DNA选择性替换的γPNA-DNA杂交体的不同形态
<ol>
	<li>从商业寡核苷酸供应商处获取指定序列的DNA寡聚体（见表5），要求以25 nmol规模合成，并采用标准脱盐法纯化。使用无RNase的去离子水将这些DNA序列重悬，配制成20 µM的储存液。</li>
	<li>对于连续型γPNA链的DNA替换，序列D3、D5和D9可分别替换链p3、p5和p9；类似地，对于交叉型γPNA链的DNA替换，序列D1、D4和D7可分别替换链p1、p4和p7。</li>
	<li>从每种γPNA或DNA寡聚体的20 µM子储存液中取1 µL，加入200 µL PCR管中，操作同步骤2.7。加入30 µL无水DMSO和1 µL无RNase的去离子水，使终体积为40 µL（见表6）。</li>
	<li>将退火样品批次放入热循环仪中，按照步骤4.2中所述程序进行退火。</li>
	<li>采用第5节所述的TIRF方法或第6节所述的透射电子显微镜（TEM）成像方法对γPNA-DNA杂合纳米结构进行表征（见图6）。</li>
</ol>
8. 不同浓度SDS条件下γPNA纳米纤维的多种形貌
<ol>
	<li>通过称取20 mg SDS并将其溶解于100 µL去离子水中，配制20% (wt/v) SDS主储备液。</li>
	<li>从20% SDS储备液中取3 µL，用去离子水定容至10 µL，配制6% (wt/v) SDS次级储备液。</li>
	<li>按照以下步骤，将γPNA寡核苷酸在含5.25 mM和17.5 mM SDS的终浓度条件下进行退火。从每种γPNA寡核苷酸的20 µM次级储备液中取1 µL，加入200 µL PCR管中（如步骤2.7所述）。加入30 µL无水DMSO以及1 µL的6%和20% SDS溶液，使终体积达到40 µL，从而分别获得5.25 mM和17.5 mM的SDS终浓度（见表7）。</li>
	<li>将含有不同SDS浓度的退火反应体系加入热循环仪中，并按照步骤4.2所述程序进行退火。</li>
	<li>使用第5节所述的TIRF方法或第6节所述的TEM成像方法，对在SDS存在条件下形成的γPNA纳米结构进行表征（见图7）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文重点介绍将现有的核酸纳米技术方案改进并适配于有机溶剂混合体系的方法。文中所述方法主要针对特定极性非质子有机溶剂实验条件下的方案修改与问题排查。该领域尚存大量未开发的潜力，其他已建立的核酸纳米技术方案亦有望在此类溶剂环境中实现适配。这将有助于推动其在聚合物合成和多肽合成等领域的应用整合，而这些领域通常使用类似的有机溶剂25,26。此外，本文还着重强调在实施上述方案时需特别注意的关键步骤。
在制备自组装样品时，需注意将DMSO和DMF条件下的水体积百分比保持在25%（v/v）。因此，用于自组装的有机溶剂也应使用无水溶剂。纳米纤维结构具有疏水性，在水含量增加时会发生聚集。
与能够形成特定长度结构的支架式DNA折纸方法不同，当前用于γPNA纳米纤维及其他已建立的DNA SST纳米管的SST基序设计无法产生具有特定长度的结构。这些纳米管可发生聚合，形成长度范围达数微米（最长可达11 µm）的结构。由于同样的原因，无法...

先前的研究已表明，使用天然存在的核酸（如DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10和RNA11,12）在水相或高度水合介质中成功构建了多种复杂的纳米结构1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。然而，天然存在的核酸在有机溶剂混合物中会发生双螺旋构象变化，或热稳定性降低13,14。
此前，本实验室已报道了一种利用在γ位点修饰的合成核酸类似物——γ肽核酸（gamma-peptide nucleic acids, γPNA）构建三螺旋纳米纤维的方法15（图1A）。合成核酸类似物PNA的开发需求及其潜在应用已在领域内得到讨论16,17。我们通过借鉴用于DNA纳米结构的单链瓦片（single-stranded tile, SST）策略18,19,20，证明了9条序列不同的γPNA寡聚体可在特定极性非质子有机溶剂混合物（如DMSO和DMF）中自组装形成三螺旋纳米纤维。这些γPNA寡聚体由商业合成，每条12个碱基的序列在第1、4和8位碱基的γ位点均引入了(R)-二甘醇（mini-PEG）修饰，修饰方法依据Sahu et al.21发表的方案。这些γ位点的修饰可诱导螺旋结构的预组织，从而赋予γPNA相较于未修饰PNA更高的结合亲和力和热稳定性。
本文改编自我们已发表的研究工作，该研究探讨了溶剂溶液及DNA取代对基于γPNA的纳米结构形成的影响15。本文旨在详细介绍纳米结构的设计原理，并提供为γPNA纳米纤维的自组装和表征所开发的溶剂适配方法的详细实验方案。因此，我们首先介绍模块化SST策略，这是一种利用合成核酸类似物PNA进行纳米结构设计的通用平台。
据报道，PNA 双链的螺旋螺距为每圈18个碱基，而 DNA 双链每10.5个碱基完成一圈（图1B）。因此，所展示的γPNA SST结构域长度设定为6个碱基，以容纳完整一圈的三分之一，即120°旋转，从而实现三个呈三角形排列的螺旋之间的相互作用。此外，与以往的SST结构基元不同，每个SST仅包含2个结构域，从而有效形成一种一维带状结构，该结构缠绕形成三螺旋束（图1C）。每条12碱基的γPNA寡核苷酸在第1、4和8位点进行γ修饰，以确保在整个SST结构基元中迷你PEG基团的均匀分布。此外，在该结构基元中存在两种类型的寡核苷酸：存在于单个螺旋上的“连续”链和跨越螺旋的“交叉”链（图1D）。另外，寡核苷酸P8和P6分别标记了荧光染料Cy3（绿色星形）和生物素（黄色椭圆）（图1D），以便通过荧光显微镜检测结构的形成。总体而言，该SST结构基元由共9条寡核苷酸组成，通过各结构域与相邻寡核苷酸上对应结构域之间的程序化互补配对，实现三螺旋纳米纤维的形成（图1E）。

<table><tbody><tr><td>&amp;gamma;PNA 链/寡聚物</td><td>Trucode Gene Repair Inc.</td><td></td><td>第 2.1 节</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Agilent</td><td>Varian Cary 300</td><td>第 3.1.2 节</td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Starna</td><td>29-Q-10</td><td>第 3.1.1 节</td></tr><tr><td>PCR 仪（热循环仪）</td><td>Bio Rad</td><td>C1000 touch</td><td>第 4.1 节</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR 管</td><td>VWR</td><td>53509-304</td><td>第 4.5 节</td></tr><tr><td>无水 DMF</td><td>VWR</td><td>EM-DX1727-6</td><td>第 4.6 节</td></tr><tr><td>无水 DMSO</td><td>VWR</td><td>EM-MX1457-6</td><td>第 4.6 节</td></tr><tr><td>无水 1,4-二氧六环</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC615121000</td><td>第 4.6 节</td></tr><tr><td>10× 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>VWR</td><td>75800-994</td><td>第 3.1.1 节</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>89085-399</td><td>第 5.2 节</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>48382-126</td><td>第 5.2 节</td></tr><tr><td>2% 火棉胶乙酸戊酯溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9817</td><td>第 5.2 节</td></tr><tr><td>乙酸异戊酯</td><td>VWR</td><td>200001-180</td><td>第 5.2 节</td></tr><tr><td>生物素化牛血清白蛋白（Biotin-BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td>第 5.3 节</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>第 5.4 节</td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189730</td><td>第 5.5 节</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>第 5.7 节</td></tr><tr><td>全内反射荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Nikon Ti2-E</td><td>第 5.8 节</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Joel</td><td>JEM 1011</td><td>第 6.6 节</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td>0203-N5AC-PO</td><td>第 6.3 节</td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td>第 6.1 节</td></tr><tr><td>Formvar 包被铜网（300 目）</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1701-F</td><td>第 6.2 节</td></tr><tr><td>Formvar-一氧化硅 A 型铜网（300 目）</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1829</td><td>第 6.2 节</td></tr><tr><td>DNA 寡聚物/链</td><td>IDT</td><td></td><td>第 7.1 节</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>VWR</td><td>97064-860</td><td>第 8.1 节</td></tr></tbody></table>

伽马修饰肽核酸在有机溶剂混合物中的自组装形成复杂纳米结构

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

目前，DNA 和 RNA 纳米技术的策略能够在水相或高度水合介质中实现多种核酸纳米结构的自组装。本文中，我们描述了详细的实验方案，可通过具有独特可寻址性的单链γ修饰肽核酸（γPNA）瓦片在有机溶剂混合物中实现纳米纤维结构的自组装。每个单链瓦片（SST）是由两个串联的6碱基模块化结构域组成的12碱基γPNA寡聚体。每个结构域可通过程序化互补性与相邻链上的互补结构域结合，从而形成可生长至微米长度的纳米纤维。SST结构单元由总共9种寡聚体组成，以实现三螺旋纳米纤维的形成。与形成直径均一的类似DNA纳米结构不同，这些γPNA体系在有机溶剂混合物中自组装时，会在宽度方向上发生纳米纤维的束化。因此，本文所述的自组装方案还包括使用常规表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS），以减少束化效应。

上述章节中讨论的方案描述了如何从DNA纳米纤维设计一种改良的SST基序，以利用多种不同的γPNA寡聚体稳健地生成自组装纳米纤维结构。本节描述了对成功重复上述方案所获得数据的解读。
按照第5节所述方案，在75% DMSO:H2O（v/v）中退火的γPNA寡聚体样品，经显微观察可最清晰地显示结构有序的组装形态，如图4A所示。在75% DMF:H2O（v/v）溶剂条件下，形成针状或棘状纳米结构（图4B）；根据我们的经验，40% 1,4-二氧六环:H2O（v/v）条件下，使用TIRF显微镜观察时仅可见稀疏分布的丝状纳米结构（图4C）。此外，在75% DMSO:H2O（v/v）中形成的γPNA纳米管样品，经第6节所述步骤处理后，在透射电子显微镜（TEM）的高倍率或纳米级分辨率下观察，可发现纳米纤维存在束状聚集现象（<strong...

本文提供了在有机溶剂混合物中利用γ修饰的肽核酸寡聚体设计和自组装纳米结构的实验方案。

当前DNA与RNA纳米技术的策略能够实现多种核酸纳米结构在水相或充分水合条件下的自组装...

本创新性实验方案描述了利用合成核酸类似物γ-PNA的多种不同序列，在特定有机溶剂混合物中形成纳米结构的方法。本文所述实验表明，有必要将现有的核酸纳米技术方案拓展至有机溶剂体系，而目前在此类体系中报道的方案极少。由于纳米材料PNA易于发生聚集，刚接触该技术的研究人员可能会发现，难以将为高水相环境开发的现有方案直接应用于富含有机溶剂的环境。首先制备γ-PNA储备液。从商业供应商获得高效液相色谱（HPLC）纯化的γ-PNA单链后，将每条单链用去离子水重悬至300微摩尔浓度。γ-PNA可在-20摄氏度下保存数月。准备进行自组装时，需在75% DMSO、75% DMF和40% 1,4-二氧六环中制备退火批次样品。首先，通过从主溶液中取0.67微升分装，并加入去离子水至终体积为10微升，配制每种寡核苷酸的20微摩尔子储备液。从20微摩尔子储备液中各取1微升，加入至一个200微升PCR管中，九种寡核苷酸总体积共计9微升。加入30微升无水DMSO或DMF，并额外加入1微升去离子水，最终体积为40微升。制备40% 1,4-二氧六环批次时，加入16微升1,4-二氧六环，并用去离子水定容至40微升。将样品在热循环仪中退火22.5小时，温度从90摄氏度降至20摄氏度。通常，在不同溶剂条件下，二聚体和三聚体γ型PNA亚群的熔解温度范围为40至70摄氏度。根据手稿说明设置热循环仪程序。退火完成后，样品可在4摄氏度下保存12至24小时，随后进行表征。用一个空的移液枪头盒制作一个湿度盒，向盒内加入约五毫升水。将市售的2%醋酸戊酯火棉胶溶液用异戊酸异戊酯溶剂稀释20倍，配制成硝酸纤维素溶液。用镊子将盖玻片浸入硝酸纤维素溶液中，取出后使其自然风干，然后使用载玻片、两条双面胶带和涂有硝酸纤维素的盖玻片组装成一个流动池室。称取1毫克生物素化BSA，溶于1毫升PBS中，配制生物素化BSA溶液。以倾斜角度将15微升生物素化BSA溶液加入流动通道中，在湿化室中室温孵育2至4分钟。用15微升洗涤缓冲液（含1毫克BSA的1毫升PBS溶液）吹洗通道，去除未结合的生物素化BSA，随后将流动通道在湿化室中继续孵育2至4分钟，以封闭表面。取0.5毫克链霉亲和素和1毫克BSA，溶于1毫升PBS中。用移液器将15微升链霉亲和素溶液加入流动通道，置于湿化室中孵育2至4分钟，然后用15微升洗涤缓冲液冲洗通道。接着，将15微升在湿化室中退火的γ-PNA寡核苷酸溶液流经通道，再用与纳米结构相同溶剂组成的含1毫摩尔Trolox的15微升溶液冲洗未结合的纳米结构。将流动通道转移至载物片支架中，并使用配备TIRF成像功能、60倍油浸物镜和1.5倍放大镜的荧光显微镜进行成像。在监测Cy3通道的同时，以60倍或90倍放大倍数扫描流动通道。根据论文中的说明配制20%和6% SDS储备液，然后通过将每种20微摩尔的寡核苷酸各取一微升加入200微升PCR管中，退火gamma PNA寡核苷酸。向 PCR 管中加入 30 微升无水 DMSO 和 1 微升 6% 或 20% SDS，终体积为 40 微升，对应的终浓度 SDS 分别为 5.25 或 17.5 毫摩尔。按照先前所述方法在热循环仪中退火 gamma PNA。使用 TIRF 或 TEM 方案表征在 SDS 存在下的 gamma PNA 纳米结构。在75%DMSO中退火的γ-PNA寡聚体的TIRF成像显示出高度有序的结构，而在75%DMF中退火则形成棘状或针状纳米结构。40%1,4-二氧六环条件则产生稀疏分布的纤维状纳米结构。此外，在75%DMSO中形成的γ-PNA纳米管样品，经TEM成像在高倍率或纳米级分辨率下观察到纳米纤维的束状聚集。对纳米结构宽度的定量分析显示，中位宽度为16.3纳米，最大值超过80纳米。替换连续γ型PNA的同序列DNA寡聚体形成了直的丝状结构，而替换交叉型γ型PNA则形成星状结构。使用连续DNA寡聚体替换的纳米结构，其中位宽度约为19纳米。在高浓度SDS条件下，通过TIRF成像观察，γ型PNA纳米纤维相较于其临界胶束浓度时也呈现出高度网络化的形态。透射电镜（TEM）成像表明，在5.25毫摩尔SDS中，γ型PNA组装体的结构束集程度降低最为显著。在实施本实验方案时，必须注意保持所述的溶剂组成，因为纳米结构具有聚集倾向。这些方法鼓励研究人员探索不同溶剂组成、表面活性剂以及其他PNA-DNA纳米结构的其他未开发途径。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

将伽马改性肽核酸自组装成有机溶剂混合物中复杂的纳米结构

本文概述了一种简单且通用的手动肽拟态物合成方法，该方法仅需基本设备和市售试剂，可在大多数实验室中轻松实现肽拟态物的合成。文中详细描述了由36个单体组成的两亲性肽拟态物的合成、纯化与表征过程，并阐述了其自组装形成高度有序纳米片的特性。...

固相亚单体合成肽模拟物聚合物及其自组装形成高度有序纳米片

本文描述了通过自组装这一自发过程形成高度有序的肽基结构的方法。该方法利用 commercially available peptides...

短肽自组装形成有序生物分子结构

介绍了一种从单一或多种细胞外基质蛋白中获取纳米纤维及复杂纳米结构的方法。该方法利用蛋白质-表面相互作用，制备具有可调组成和结构的自支撑蛋白材料，可用于多种组织工程和生物技术应用。...

利用表面引发组装技术构建的细胞外基质蛋白纳米纤维与纳米结构

本实验方案描述了一种简单、稳定且可扩展的技术，用于将宏观的纳米颗粒-配体单层膜在无模板基底上进行功能化和自组装。...

一种在无模板基底上功能化并自组装宏观纳米粒子-配体单层膜的技术

由于多胺类化合物含有多个氨基氮原子，因此基于多胺的肽两亲分子（PPAs）的合成具有较大挑战性，需要审慎使用保护基团来屏蔽这些活性官能团。本文中，我们描述了一种制备这类新型自组装分子的简便方法。...

基于多胺的自组装肽两亲分子（PPAs）及相关生物材料的简便合成方案

一种1,2-二硫杂环戊烷修饰肽的合成方案及其自组装形成的超分子结构的表征。...

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本方案描述了一种高效合成油酸-铂(II)配合物纳米乳液的方法，该纳米乳液由赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸（KYF）三肽稳定。在温和的合成条件下，KYF与该配合物通过自组装形成纳米乳液。...

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信息承载型肽模拟物的合成及其序列导向的动态共价自组装

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机械稳定性自组装肽水凝胶的制备

学习伽马改性肽核酸在有机溶剂混合物中自组装成复杂纳米结构的方法。本研究提供适用于非水环境的核酸纳米技术新方案，帮助研究人员克服PNA聚集挑战并拓展纳米技术应用。

伽马修饰肽核酸在有机溶剂混合物中的自组装形成复杂纳米结构

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