聚焦超声诱导血脑屏障打开，用于靶向大脑结构和评估化学遗传神经调控

该协议描述了通过聚焦超声血脑屏障（BBB）开放进行基因传递所需的步骤，评估产生的基因表达以及通过组织学测试测量化学遗传受体的神经调控活性。

我们的协议能够对小鼠的聚焦超声进行亚毫米级精确靶向。它使我们能够使用廉价的 3D 打印部件来靶向超声，而无需使用手术或 MRI 兼容的超声设备。聚焦超声血脑屏障打开一开始可能非常棘手。

使用脱气凝胶或水将传感器正确耦合到动物上，并且在注射过程中微气泡不会破裂，这一点至关重要。演示该程序的是加州理工学院的研究生 Richard Li。在确认麻醉小鼠对踏板反射无反应后，使用每毫升 10 单位的肝素化盐水清洗干净的 25 至 35 号导管，并使用乙醇垫对动物的尾巴进行消毒。

将导管插入侧尾静脉，并使用组织胶将导管固定到位。如果针头放置正确，则会在导管中观察到血液回流。胶水干燥后，用脱毛膏去除动物头上的毛发，然后将鼠标放入 3D 打印的 MRI 托架中，将门牙安装在咬合杆上，头部位于鼻锥内。

以安全的压力将钝杆固定在颅骨上，并观察呼吸 30 秒，以确认动物以每秒一次呼吸的速度自由呼吸。将瞄准导轨连接到耳栏并再次检查呼吸。将 MRI 托架放入 MRI 支架中，并将支架放在磁铁的孔内。

然后获取 MRI 序列以在扫描仪中定位鼠标，使用 3D 快速低角度拍摄序列对整个大脑进行成像。要执行 MRI 引导的瞄准，请将托架放在立体定位器内，并使用带有双面胶带的金属块将块固定在立体定位器的两个支撑柱上。将 MRI 图像传输到运行聚焦超声引导软件程序的计算机，然后打开图像。

加载完所有图像后，右键单击并单击 reformat 将图像重新格式化为三个轴。右键单击以将传感器定位到圆形瞄准参考线。在矢状视图中，调整虚拟换能器的垂直位置，以考虑水浴和换能器外壳的厚度。

在轨迹规划器中指示要瞄准的区域，并在电子表格中记下坐标。拨入所需的目标深度并记下坐标，如前所述。然后单击 send trajectory and execute 以瞄准每个点。

要将 MRI 的坐标与立体定位框架相关联，请将定制安装的换能器放在瞄准导轨上并平移，直到三个瞄准螺栓中的每一个都可以穿过换能器支架和瞄准导轨。确认螺栓没有处于张力或倾斜状态，并将换能器向前前后平移 10.56 毫米，直到换能器位于 MRI 上出现瞄准导引中心的点。然后确定从虚拟换能器中心到目标区域的距离，并使用框架将换能器移动到这些坐标。

为了制备注射液，将 800 微升生理盐水和 100 微升 MRI 造影剂混合到 1.5 毫升的试管中。接下来，将未活化的微泡溶液加热至室温，然后在微泡活化装置中激活微泡 45 秒。活化后，将 100 微升微气泡从溶液中间缓慢加载到配备 21 号针头的 1 毫升结核菌素注射器中，并将 80 微升微气泡加入造影剂溶液中。

将 1.5 mL 试管轻轻倒置 15 秒，以避免浮选，从而混合制备好的溶液。混合结束时，将 200 微升微泡溶液装入无针头注射器中，然后倒置注射器。按下并缩回柱塞以混合并在注射器仍处于倒置状态时将 30 号针头连接到注射器上。

然后慢慢推出微泡溶液，直到针头末端出现液滴。一旦微气泡准备好，将谐振的脉冲持续时间设置为 10 毫秒，每秒重复 120 次，颅骨处的压力为 0.3 至 0.45 兆帕斯卡。取下瞄准导轨，将脱气的超声凝胶涂抹在鼠标头部，注意避免气泡。

降低换能器，直到它直接放在耳杆支架的平坦部分，然后将坐标拨入立体定位器。将感兴趣的腺相关病毒稀释至每克体重浓度的 0.5 至 2 乘以 10 至第 10 个病毒颗粒，并将病毒颗粒装入配备 30 号针头的 1 毫升注射器中。将溶液注入尾静脉导管中，并将 80 微升微泡溶液注入小鼠体内。

为了通过 MRI 评估血脑屏障的开放情况，请记录一个快速的低角度射击序列，如图所示。对于 DREADD 刺激，将氯氮平 N-氧化物以 1 毫克/毫升的浓度溶解在无菌盐水中，然后腹膜内注射。分娩后 15 到 45 分钟，开始记录动物的行为活动。

对于神经元激活分析，使用脑组织。按照所演示的协议，可以在海马区域和大脑的其他部分实现 T1 信号增强。据观察，针对 mCherry 的免疫染色可更可靠地检测 DREADD 表达在此过程中，请记住轻柔地处理微气泡，并确保动物在 MRI 成像和超声检查期间保持稳定。