肺环境中免疫细胞和促炎介质的表征

该方案可用于研究缺血性中风后肺环境的改变。该方法允许通过流式细胞术分析鉴定同一只小鼠中的 13 种肺免疫细胞类型和 13 种不同的细胞因子和趋化因子。该方法已用于评估缺血性中风后肺部环境的改变。

然而，它也可以用于调查过敏反应或感染期间的变化。要进行全身经心灌注，请确认麻醉鼠标对踏板反射无反应，并将鼠标固定在手术平台上。用 70% 乙醇润湿皮毛，以减少毛皮分布到体腔中，并做一个垂直的中线皮肤切口，露出完整的腹膜，一旦到达胸腔，就停止切口。

使用细解剖剪刀在胸腔处做一个腹膜中线切口，然后用镊子抓住胸骨的远端。用剪刀剪开横膈膜，而不会损坏心脏、肺或脉管系统。当可以看到下面的组织时，在肋骨上切开一个切口并固定肋骨的侧面，使心脏和肺完全暴露。

小心地在靠近主动脉弓的右心房做一个小切口，作为灌注的流出，然后快速但轻轻地将 25 号针头插入左心室的远端上表面。针头就位后，将 10 毫升冷 PBS 轻轻冲洗到心脏中。组织应开始清除血液。

当整个体积输送完毕后，灌注第二个 10 毫升等分试样的冷 PBS，直到肝脏呈现浅棕色外观，肺部从红粉色转变为大部分白色。使用镊子和细解剖剪刀，小心地去除所有周围组织，然后分离肺叶并将它们放入含有 1 至 2 毫升冷肺细胞的培养皿中，培养基在冰上。为了制备用于多重微珠阵列的肺组织，将 200 μL 冷均质缓冲液添加到包含三个无菌 2.3 mL氧化锆/二氧化硅微珠的 2 mL试管中，并称量感兴趣的肺叶。

将 50 至 100 毫克肺组织转移到预冷的微珠管和均质缓冲液中，并使用基于微珠的均质器以每分钟 4， 000 转的速度匀浆肺叶，持续至少两分钟。当组织完全匀浆后，离心管以沉淀组织，并将超级清液转移到冰上预冷的 1.5 毫升微管中。对于肺组织解离，小心地从剩余的肺叶中倒出肺细胞培养基，并将 25 号针头插入组织。

将 200 至 250 微升体积的解离缓冲液注射到每个肺叶中，使肺膨胀，直到每个肺叶注射 2 至 3 次。在室温下孵育 2 分钟后，使用细解剖剪刀将肺切成小块，然后将组织溶液转移到 15 毫升的 Chronicle 管中。向样品中加入 6 mL 额外的解离缓冲液，并剧烈涡旋 1 分钟。

接下来，将组织块在 37 摄氏度下孵育 45 分钟，每 7 到 8 分钟涡旋一次。孵育结束时，将样品剧烈涡旋 1 分钟，然后让样品通过 100 微米的细胞过滤器，以去除任何残留的不需要的结缔组织和间质组织。通过离心收集组织，并用 5 毫升冷肺培养基重悬至沉淀物中。

再次离心样品，将沉淀重悬于 1 mL 冷肺培养基中，轻轻涡旋。然后，在计数前通过 100 微米过滤器过滤细胞。为了评估分离的肺组织内的免疫细胞群，用 96 孔圆底板将 1 到 2 倍 10 到 6 个 power cells 抗体接种到适当数量的孔中，并通过离心将细胞丢弃到板底部。

向每个孔中加入 25 μL 适当的抗体混合物，溶于冷的 FACS 缓冲液中，并轻轻地用管道抚摸混合。20 分钟后，将细胞重悬于每孔 100 微升冷 FACS 缓冲液中，并将样品转移到单独的 5 毫升聚苯乙烯圆底管中，每管含有 150 微升额外的 FACS 缓冲液。然后，立即根据标准流式细胞术分析方案在流式细胞仪上分析样品。

在这项具有代表性的分析中，使用三组 5 至 7 种抗体组合在肺部鉴定了 13 种不同的免疫细胞群。使用活死细胞染色剂排除死细胞，并使用表中所列的抗体和标志物区分不同的免疫细胞类型。在第一组中鉴定出肺泡和间质巨噬细胞、CD103 阳性和 CD11B 阳性树突状细胞和嗜酸性粒细胞。

在第 2 组中鉴定出促炎单核细胞和中性粒细胞，在第 3 组中鉴定出 CD4 阳性和 CD8 阳性 T 细胞、B 细胞、浆细胞样树突状细胞、NK 细胞和 NKT 细胞。如图所示，分离的细胞群与使用市售组织解离剂分离的细胞群之间的活细胞总数、CD45 阳性细胞的百分比和 CD45 阳性细胞的总数相似。此外，两种方案的 CD45 阳性细胞中的细胞死亡百分比均小于 10%，这表明所证明的方案有助于在没有自动组织解离器帮助的情况下实现高产量、高细胞质量的回收。

此外，使用市售的多重分析与流式细胞术分析相结合，可以确定每毫克组织中每个样品中的趋化因子浓度。单细胞分离过程中使用的胶原酶 D 浓度、孵育时间和温度对免疫细胞的恢复率有严重影响。