Name: 磁性纳米材料的生物功能化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习利用抗体对磁性纳米材料进行生物功能化的完整实验方案，通过APTES涂层和EDC/Sulfo-NHS活化实现铁纳米线与抗体的共价结合，从而特异性靶向癌细胞并验证其生物相容性。

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本研究工作得到了沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科技大学（KAUST）的资助。

警告：使用前请务必查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。采用所有适当的安全操作规范并佩戴个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、不露脚趾的鞋）。所有生物反应均须在生物安全柜中进行。
注意：本方案旨在制备相当于每毫升含 2 × 1010 根经生物功能化的纳米线（NWs）、铁含量为 0.36 mg/mL 且包被有抗 CD44 抗体（抗体密度为每根纳米线 3 × 104 个抗体）的溶液。该铁-氧化铁（核-壳结构）纳米线长度为 2.5 µm，直径为 41.5 nm。
1. 释放铁纳米线
注意：铁/氧化铁纳米线的制备过程已在先前发表的文章中进行了详细说明59。
<ol>
	<li>在切割垫上，使用单刃刀片和小锤子将铝（Al）圆片（图2A）切割成小块（图2B），以便装入2 mL离心管中。用镊子将小块铝转移至离心管中。</li>
	<li>向含有铝小块的2 mL离心管中加入1 mL 1 M氢氧化钠（NaOH）溶液，确保所有铝块均被NaOH溶液覆盖。</li>
	<li>将溶液置于化学通风橱内，室温下反应30分钟。</li>
	<li>仅用镊子取出铝块，将释放出的纳米线（NWs，黑色团簇，图3A）保留在NaOH溶液中继续反应30分钟。不要更换NaOH溶液。</li>
	<li>将含有纳米线的2 mL离心管置于磁力架上，静置2分钟后移除旧的1 M NaOH溶液，并更换为新鲜的NaOH溶液。</li>
	<li>对含有纳米线的2 mL离心管进行30秒超声处理，随后在化学通风橱中静置1小时。</li>
	<li>重复步骤1.5–1.6至少四次。</li>
	<li>将2 mL离心管置于磁力架上，静置2分钟，以洗涤纳米线。</li>
	<li>弃去NaOH溶液，加入1 mL无水乙醇。</li>
	<li>对离心管进行30秒超声处理。</li>
	<li>将2 mL离心管再次置于磁力架上，静置2分钟。</li>
	<li>弃去旧的无水乙醇溶液，加入1 mL新鲜无水乙醇，并进行30秒超声处理。</li>
	<li>重复步骤1.11和1.12至少四次。</li>
	<li>将纳米线保存在1 mL无水乙醇中，室温存放，直至后续使用。</li>
	<li>采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定铁的浓度，从而确定纳米线的浓度。 
	注意：本实验流程可在此处暂停。然而，若需长期保存，请勿提前将纳米线从铝模板中释放。若将已释放的纳米线长时间沉淀于乙醇中且不频繁超声，会导致聚集，后续需更长时间超声才能重新分散。</li>
</ol>
2. 使用 APTES 包覆纳米线
注意：在本方案中，100 µL APTES 溶液（密度为 0.946 g/mL61）足以包覆 1.6 × 107 m2/g 的纳米线。如果纳米材料的比例或质量发生变化，应相应调整 APTES 的体积。
<ol>
	<li>使用1 mL移液器将步骤1.14中的纳米线（NWs）转移至一个5 mL玻璃试管中。</li>
	<li>为收集残留在2 mL试管中的纳米线，用1 mL无水乙醇冲洗空的2 mL试管两次，并使用1 mL移液器将冲洗液转移至5 mL玻璃试管中。</li>
	<li>使用移液器取100 µL APTES，直接加入纳米线溶液中。</li>
	<li>将5 mL玻璃试管涡旋振荡10秒。</li>
	<li>将5 mL玻璃试管固定在实验室铁架台的夹子上。</li>
	<li>将5 mL玻璃试管的一半浸入超声波清洗仪的水中，超声处理1小时。</li>
	<li>从超声波清洗仪中取出5 mL玻璃试管，先加入400 µL去离子水（DI水），然后加入20 µL 1 M NaOH（碱性催化）。 
	注意：必须先加入去离子水。</li>
	<li>按照步骤2.5–2.6的方法固定5 mL玻璃试管，再进行1小时超声处理。</li>
	<li>从超声波清洗仪中取出5 mL玻璃试管。</li>
	<li>将磁铁置于玻璃试管旁5分钟，以收集纳米线。</li>
	<li>用1 mL新鲜无水乙醇替换上清液，并超声处理10秒。</li>
	<li>重复步骤2.10–2.11共四次。</li>
	<li>使用1 mL移液器将所有悬浮在乙醇中的纳米线转移至一个新的5 mL玻璃试管中。 
	备注：经APTES包覆的纳米线可在乙醇中保存于玻璃试管内，直至需要使用。本方案可在此处暂停。</li>
</ol>
3. 纳米线的生物功能化
<ol>
	<li>抗体活化 
	注意：为达到约 3 × 104 个抗体/纳米线（NW），每 0.1 mg 铁使用 30 µL 抗体（1 mg/mL）。
	<ol>
		<li>在 2 mL 离心管中，将 0.4 mg 的 3-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺（EDC）和 1.1 mg 的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）溶于 1 mL 的 2-吗啉乙磺酸一水合物（MES）（pH 4.7）中。 
		注意：EDC/磺基-NHS 混合液应现配现用。</li>
		<li>在另一个新的 2 mL 离心管中，依次加入 30 µL 抗 CD44 抗体（1 mg/mL）、960 µL 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7）和 10 µL EDC/磺基-NHS 混合液（步骤 3.1.1 中配制）。</li>
		<li>将 2 mL 离心管置于摇床中，在室温下以 10 × g 振荡 15 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>APTES 包被纳米线的制备
	<ol>
		<li>在步骤 3.1.3 的 15 分钟孵育期间，将磁铁置于 APTES 包被的纳米线管（来自步骤 2.13）旁 2 分钟，以收集纳米线。</li>
		<li>弃去乙醇，加入 1 mL 0.1 M PBS（pH 7），然后超声处理 10 秒。</li>
		<li>重复步骤 3.2.1–3.2.2 四次。</li>
		<li>按照步骤 3.2.1 的方法收集纳米线，并弃去 0.1 M PBS。将纳米线保留在管中，不加任何溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体的连接
	<ol>
		<li>将所有活化的抗体溶液（步骤 3.1.3 中制备）转移至纳米线管（步骤 3.2.4 中制备）中，并超声处理 10 秒。</li>
		<li>将玻璃管置于旋转仪中，在 4 °C 下过夜孵育。</li>
		<li>使用磁铁收集纳米线（如步骤 3.2.1 所述），弃去上清液。</li>
		<li>加入 1 mL 2% 牛血清白蛋白（BSA）溶液，在 4 °C 下孵育 1 小时以封闭反应。</li>
		<li>检测抗体功能化纳米线的抗原性，例如通过免疫沉淀（IP）和蛋白质印迹（WB）实验。 
		注意：为获得更佳结果，建议在封闭步骤完成后立即用于 IP、WB 或生物相容性实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 生物相容性检测
注意：为了研究纳米线（NWs）的生物相容性，可采用多种细胞活力检测方法和不同的细胞系。此处使用的纳米线浓度基于先前发表的研究16。细胞接种应在纳米线生物功能化前一天进行。
注意：以下所有步骤均应在生物安全柜内进行。
<ol>
	<li>在96孔板中，每孔接种4 × 104个悬浮于McCoy’s细胞培养基（100 µL/孔）中的结肠癌细胞（HCT116细胞系），置于37 °C、5%二氧化碳（CO2）的培养箱中过夜培养。</li>
	<li>使用磁铁（参照步骤3.2.1）收集纳米线（NWs，来自步骤3.3.4），用PBS洗涤，并将旧溶液替换为1 mL 0.01 M PBS（pH 7）。重复此步骤三次。</li>
	<li>使用磁铁（参照步骤3.2.1）收集纳米线（NWs，来自步骤4.2），用预热的McCoy’s培养基洗涤，并将旧的PBS替换为1 mL预热的McCoy’s培养基。重复此步骤三次。</li>
	<li>使用磁铁（参照步骤3.2.1）收集纳米线（NWs，来自步骤4.3），并将1 mL预热的McCoy’s培养基替换为900 µL预热的McCoy’s培养基。纳米线的浓度应为每毫升含0.02 mg纳米线。</li>
	<li>将96孔板（来自步骤4.1）从培养箱中取出，转移至生物安全柜中。</li>
	<li>在生物安全柜内，吸除细胞中的旧培养基，并向每孔加入100 µL悬浮的纳米线（按步骤4.4制备）。</li>
	<li>手动轻轻摇晃该96孔板（按步骤4.6制备），然后在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>次日，将96孔板（按步骤4.7制备）从培养箱中取出。在生物安全柜内，使用多通道移液器向每孔加入11 µL细胞活力检测试剂（材料表）。</li>
	<li>将该96孔板在板式振荡器上以10 × g 的速度振荡10秒。</li>
	<li>将96孔板在培养箱中孵育1小时。</li>
	<li>将96孔板（按步骤4.10制备）从培养箱中取出，在酶标仪（材料表）中读取数据，检测细胞活力检测试剂的吸光度（激发波长540 nm，发射波长590 nm）。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与任何纳米材料的制备和涂层方法一样，所用溶液的质量必须较高。释放溶液（1 M NaOH）和功能化溶液（MES）可重复使用多次，但在开始新实验前检查其pH值至关重要。在释放步骤中，应用NaOH对纳米线至少清洗四次。清洗越充分，纳米线的稳定性越好，聚集程度越低。氧化层可增强纳米线在乙醇或水中的稳定性63。
在用 APTES 和抗体包被后，纳米线（NWs）的直径和长度均受到影响。此处，直径从 41.5 nm 增加到 70 nm，而长度由于超声处理导致纳米线断裂，从 2.5 µm 减小到 1.6 µm。因此，在生物功能化步骤之后，表征纳米线的形貌至关重要。
抗体与纳米线（NWs）的结合依赖于APTES上的氨基与抗体上的羧基之间的共价相互作用。因此，确认APTES涂层的存在是一个关键步骤，我们采用电子能量损失谱（EELS）成像来完成这一验证。该涂层方法安全且简便，无需高温或长时间孵育。此外，APTES涂层可作为连接子，实现其他含有羧基的抗体或蛋白质的共价固定。
在使用抗体对纳米线（NWs）进行生物功能化时，生物功能化过程可能会影响抗体结合位点的抗原性。可通过免疫沉淀（IP）和蛋白质印迹（WB）方法来研究这一问题。采用本方案中所述的生物功能化方法，可使抗体以高抗原性结合到纳米线上，特异性识别特定的细胞受体。此外，用抗体对纳米线进行生物功能化，赋予了其靶向表达目标受体（此处为CD44）细胞的能力。这一点已通过共聚焦显微镜得到证实。尽管未包被纳米线的生物相容性已很高（&#62;95%），但在纳米线上添加APTES包被层或抗体后，其生物相容性进一步提升至100%。
此外，该包覆和生物功能化方案高效、经济且可重复。该方法应适用于任何其他铁-氧化铁纳米材料，其中包覆物和偶联抗体的浓度应根据纳米材料的表面积和质量进行优化。本方案可在普通实验室环境条件下安全操作。生物功能化显著提高了纳米材料的生物相容性及其靶向能力。总体而言，纳米线（NWs）是纳米医学应用中极具前景的材料（包括多模式或联合治疗、细胞检测或导向以及生物传感）。结合本文所述的生物功能化方法，可实现对特定细胞的靶向，从而提高治疗的精确性和有效性。

磁性纳米材料的一个独特性质是其能够响应磁场1，这一特性可被有效利用以多种方式驱动这些材料，同时还可以通过磁共振成像（MRI）等手段对其进行监测。当施加高频交变磁场时，它们能够产生热量，从而引发热疗，提供一种治疗选择1。另一种方法是光热治疗，可通过近红外（NIR）激光实现2,3。
在众多磁性纳米材料中，氧化铁在生物领域的应用受到最广泛的关注，例如磁性分离、磁热疗2,4、细胞导向5、药物递送6,7,8，以及作为磁共振成像（MRI）的对比剂9,10。这主要归因于其良好的生物相容性11,12、高磁化强度11,12、可被包覆的特性9,13,14,15、可负载药物的能力2,16、可与药物2,16和/或靶向分子功能化结合的能力12,13,17,18，以及将光能转化为热能的能力2。最近，MagForce公司已启动使用氧化铁纳米颗粒进行磁热疗治疗癌症患者的临床试验19。
近年来，磁性纳米线（NWs）在生物医学领域的应用日益广泛3,11,16,20,21,22。它们具有与磁性纳米微球相似的性质，但因其各向异性的形状和极大的磁矩，可通过外加磁场实现高效的远程操控23,24，包括利用低频激励产生磁机械效应25,26,27,28,29。因此，纳米线已被应用于多种生物医学场景，如外泌体分离30、细胞示踪21、癌症治疗3,11,16、药物递送16,31,32，以及作为磁共振成像（MRI）的对比剂33。
具有特异性细胞靶向能力的生物功能化磁性纳米材料在生物医学应用和精准医疗中具有巨大潜力34,35。为了连接这些靶向剂，需要对纳米材料进行表面修饰。通常，纳米材料需要包覆一层能够提供功能基团的涂层，以促进治疗剂的连接。在文献中，磁性纳米材料的有机和无机涂层种类繁多。根据可固定在纳米材料上的功能基团，这些涂层可分为四大类：基于羧酸基团的分子、聚合物、组氨酸以及基于硅烷基团的分子。
分子&#160;基于羧基&#160;一种表面改性方法&#160;方法。它利用高亲和力 
负性羧酸之间&#160;涂层上的基团和阳性&#160;磁性电荷&#160;纳米材料36,37,38羧酸与金属表面的结合过程可能涉及生成金属-羧酸盐，或羧基基团吸附于金属表面。然而，对于多段纳米线（如铁/金或镍/金纳米线），其在生物应用方面具有优异的性能39,40，这种涂层难以直接应用，因为它需要同时使用两种不同的涂层：巯基用于修饰金段，羧基用于磁性段（铁或镍）。38基于羧基的分子示例包括血卟啉、庚二酸、棕榈酸和3-[(2-氨基乙基)二硫基]丙酸（AEDP）。38利用聚合物对磁性纳米材料进行表面修饰具有一些显著优势。由于聚合物具有较高的分子量，可增强磁性纳米材料在溶液中的稳定性。38然而，这将显著增加纳米材料的尺寸38聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯亚胺（PEI）、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）和聚乙二醇（PEG）是一些最常用于表面修饰的聚合物示例。每种聚合物都有其独特的特性和用途38第三种表面修饰方法是使用组氨酸涂层。组氨酸是一种含有组氨酸氨基酸侧链的蛋白质，对少数磁性纳米材料（如镍）具有高亲和力。38可用于蛋白质纯化过程38,41,42组氨酸涂层也可应用于多段纳米线，例如镍/金纳米线。38纳米材料表面的硅烷化是一种成熟的技术过程38,43,44基于一个硅原子，该硅原子通过三个单键与任意金属氧化物表面相连，同时通过烷基链与末端的功能基团相连38,43,44该涂层的优点在于可提供游离的氨基，并且能够对磁性和非磁性材料进行包被。38,45，例如镍和金。因此，使用基于硅烷基团的分子是生物功能化多段纳米线的实用途径。一些基于硅烷基团的分子实例包括(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）和(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷（APTMS）。38,45.
在涂层中添加靶向剂可对病变细胞的诊断和治疗发挥重要作用，同时最大限度地减少对健康组织的副作用46,47。在纳米材料表面添加靶向剂可通过内吞作用受体增强细胞的选择性结合和内化效率7。若无此类靶向配体，纳米材料会与细胞膜发生非特异性相互作用，其结合速率低于带有配体的纳米材料48。靶向肿瘤组织的挑战之一在于肿瘤组织与正常组织具有高度相似性。因此，靶向成功的关键主要取决于选择合适的生物靶标配体49,50。已有多种靶向剂被用于引导纳米材料定向作用于癌细胞48,51（例如CD44，因其在癌细胞中的表达水平显著高于正常细胞52,53,54,55）。
根据其组成成分和复杂程度，靶向剂可分为三大类：基于适配体的靶向、基于配体的靶向和基于抗体的靶向。适配体是一类短的化学合成的DNA或RNA寡核苷酸链，可折叠成二维和三维结构，从而能够特异性识别特定抗原，通常为蛋白质56。基于配体的靶向包括肽类和短氨基酸链57。基于抗体的靶向则利用完整的抗体或抗体片段，例如单链可变区片段或抗原结合片段51。该方法的优势在于具有两个结合位点，对特定靶抗原具有高亲和力，因而表现出极高的选择性58。其结合位点与抗原的关系类似于锁与钥匙的关系58。
本研究中使用的纳米线（NWs）是通过在氧化铝膜上进行电沉积制备的，该方法已在先前的文献中详细描述59。本文的重点在于将这些铁-氧化铁（核-壳结构）纳米线从膜上释放出来，并用特异性抗体对其进行生物功能化，从而赋予其靶向能力。抗体无法直接与铁-氧化铁纳米线结合，因此需要使用连接分子。用APTES对纳米线进行包覆可提供游离的氨基，从而通过抗体上的羧基实现共价连接（图1）。APTES包覆的优势在于其适用于磁性21和非磁性60材料，例如铁/金或镍/金纳米线45。总体而言，本方案中所述的所有包覆和生物功能化步骤均可应用于任何铁/氧化铁纳米材料。本文以铁/氧化铁纳米线为例进行说明。结果表明，经抗体功能化的纳米线对特定细胞表面受体具有高抗原结合能力，可用于多种应用，例如细胞分离、药物递送，以及利用光热和/或磁力-机械效应对特定癌细胞进行治疗。

<table><tbody><tr><td>2 mL 离心管（带 snap-cap 的微量离心管）</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-402-7</td><td></td></tr><tr><td>2-吗啉乙磺酸一水合物 99%（MES）</td><td>Thermscientific</td><td>AC172590250</td><td>浓度 0.1 M，pH 4.7</td></tr><tr><td>3-二甲基氨基丙基碳二亚胺（EDC）</td><td>Thermofisher</td><td>PG82079</td><td></td></tr><tr><td>3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>919302</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 玻璃管</td><td>Fisherscientific</td><td>03-339-22C</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板（平底）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD44 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>550990</td><td>克隆号 515，浓度 1 mg/mL</td></tr><tr><td>APTES（(3-氨丙基)三乙氧基硅烷），99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>919-30-2</td><td>浓度 99%</td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量分析（Pierce BCA 蛋白检测试剂盒）</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>浓度 35%</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Thermofisher</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>细胞活力检测试剂</td><td>AlamarBlue, Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>结肠癌细胞 — HCT116 细胞系</td><td>ATCC</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>硬木锤</td><td></td><td></td><td>可使用任意锤子工具，无特定品牌要求</td></tr><tr><td>电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）</td><td>Perkin Elmer</td><td>ELAN 9000 ICP-MS</td><td>所用软件为 &quot;Elan instrument control session&quot;</td></tr><tr><td>带夹具的实验室铁架台</td><td>RVFM</td><td>13-0140</td><td>用于在超声波清洗槽中固定 5 mL 玻璃管</td></tr><tr><td>磁力架（DynaMag-2 磁铁）</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>McCoy&amp;rsquo;s 5A 培养基 1x</td><td>Gibco</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪（Bio-Rad xMark 吸光度分光光度计）</td><td>Bio-Rad</td><td>1681150</td><td>Microplate Manager 6 软件（#168-9520）</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）10x</td><td>Gibco</td><td>14200067</td><td>浓度 0.1 M（不含钙，不含镁）</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）1x</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td>浓度 0.01 M（不含钙，不含镁）</td></tr><tr><td>板式振荡器（Microplate Genie）</td><td>Scientific Industries (Genie)</td><td>SI-0400</td><td></td></tr><tr><td>单刃剃须刀片</td><td>Polysciences</td><td>08410-1</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td>浓度 1 M，pH 13</td></tr><tr><td>磺基-N-羟基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）</td><td>Thermofisher</td><td>106627-54-7</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>管式旋转仪</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>管式振荡器（Eppendorf Thermomixer R 混合仪，2.0 mL）</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-400-204</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗槽（2510）</td><td>Branson</td><td>2489502</td><td></td></tr></tbody></table>

磁性纳米材料的生物功能化

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

磁性纳米材料在多种生物医学应用中受到广泛关注。利用特定靶向剂对这些纳米材料进行生物功能化，是提高其在诊断和治疗中功效并最大限度减少副作用的关键环节。与非磁性材料相比，磁性纳米材料的优势在于能够以非接触方式并在远距离上响应磁场，从而实现对其引导或富集，同时还可以进行监测。近年来，具有独特特性的磁性纳米线（NWs）已被开发用于生物医学应用。这些纳米线具有较大的磁矩，使得外加磁场能够更高效地远程控制其运动。该特性已在癌症治疗、药物递送、细胞示踪、干细胞分化以及磁共振成像中得到成功应用。此外，通过模板辅助电化学沉积法制造纳米线，是一种可对纳米线特性实现精确调控的多功能方法。特别是铁纳米线及铁-氧化铁（核-壳结构）纳米线，因其高磁化强度和低毒性，适用于生物医学应用。
在本研究中，我们提供了一种方法，利用特异性抗体对铁/氧化铁纳米线（NWs）进行生物功能化修饰，这些抗体靶向多种癌细胞中高表达的特定细胞表面标志物。由于该方法利用了氧化铁表面的特性，因此也可适用于超顺磁性氧化铁纳米颗粒。首先，采用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）对纳米线进行包覆，作为连接分子，使抗体能够共价结合。通过电子能量损失谱（EELS）和Zeta电位测量验证了APTES包覆及抗体的生物功能化效果。此外，采用免疫沉淀和蛋白质印迹法检测了纳米线上抗体的抗原结合活性。通过共聚焦显微镜和细胞活力检测，研究了经生物功能化修饰的纳米线的特异性靶向能力及其生物相容性。

将铝（Al）圆片（图2A）切割成小块（图2B）以便放入所用的离心管中。向铝片中加入1 M NaOH后，应立即开始反应，可通过产生气泡的现象进行观察。如果在1分钟内未发生反应，或反应过于剧烈导致溶液迅速变得完全浑浊并出现白色云状物，应立即移除旧的NaOH溶液，并更换为新鲜溶液。检查NaOH溶液的pH值，应确保pH&gt;12。在使用NaOH处理的最初30分钟内，纳米线（NWs）会从铝片上释放出来，此时纳米线（黑色团块，图3A）将悬浮于NaOH溶液中。在纳米线释放的最后阶段，溶液应呈均一状态，不应再有纳米线团块存在（图3B）。若使用磁铁收集纳米线3分钟后，溶液应变得澄清，且纳米线沉淀应呈黑色（图3C）。如果沉淀呈灰色，则弃去该样品管，并重新使用新的铝样品开始实验。
在释放过程中，纳米线表面会形成一层约5 nm厚的天然氧化铁层，这与以往的报道相似11,16,20。该氧化层对纳米线的生物相容性16、功能化修饰16,18以及磁学性质20具有重要作用。然而，将纳米线保留在模板中（即暂不释放），直至使用时再取出，可避免其受到环境因素的影响。释放后的纳米线平均直径和长度分别为2.5 µm和41.5 nm。单根纳米线的质量可按照表1所述方法进行计算，并通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）加以验证。此处，每片氧化铝圆盘中含有约0.3 mg的铁。
为了减少纳米线（NWs）释放后的聚集并实现进一步的功能化，使用 APTES 对纳米线进行包覆。该涂层可提供游离的氨基，且能够包覆磁性与非磁性材料。39,45，使其适用于多段纳米线（如铁/金纳米线）的涂层。在纳米线涂覆过程中，需重点关注两个方面。首先，计算所需 APTES 分子的体积62 基于纳米线的表面积和质量。这些计算在下文中给出。 Table 2其次，保持纳米线持续运动，以防止其发生团聚以及部分纳米线表面因APTES包覆而被堵塞。例如，在本实验方案中，纳米线在APTES包覆过程中置于超声水浴中孵育，在抗体功能化过程中则置于旋转仪上孵育。每个APTES分子包含一个硅原子和一个末端功能胺基团21因此，可通过电子能量损失谱（EELS）成像图显示纳米线表面（粉红色）的硅原子，以确认APTES涂层的存在图 4A）。相比之下，未涂层的纳米线显示铁原子为树皮蓝色（图4B）以及浅蓝色的铁/氧混合原子（图 4B）。未包覆纳米线的相应EELS映射（图4C,4D) 显示中心区域铁相对于氧的强度更高（图4C）而表面的（图 4D)，表明具有铁-氧化铁（核-壳）结构。EELS 映射（图 4C,4D) 确定纳米线表面的氧化铁层为 Fe3O4 多于 Fe2O3，这与之前的一项发表结果相似20.
可通过免疫沉淀（IP）和蛋白质印迹（WB）实验验证偶联抗体的抗原性，在阳性样本中可观察到条带，而在阴性对照中则无条带（图5）。注意，为观察到清晰的条带，每 10 × 106 个细胞所用的纳米线（NWs）量不应少于 0.1 mg。采用BCA法（材料表）并结合表3中所示的部分计算方法，用于定量纳米线上抗体的数量。
此外，通过测量Zeta电位来阐明表面功能化情况。APTES上的末端氨基减少了未包覆纳米线（NWs）的负电荷，如图6所示。与APTES包覆的纳米线相比，抗体功能化的纳米线也改变了电荷（图6）。所有Zeta电位测量均在pH 7条件下进行。
可通过共聚焦显微镜确认抗体功能化纳米线（NWs）对特定细胞的靶向性（图7）。在开展任何应用之前，应测试新型纳米材料的生物相容性。因此，我们进行了细胞活力检测，结果证实即使在高浓度下，未包被、APTES包被以及抗体包被的纳米线均具有良好的生物相容性（图8）。
<img alt="抗体功能化过程示意图；Fe-NW 转化为 APTES-NW、抗体活化、纳米线结合。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：纳米线包覆与生物功能化方法的示意图。（A）用 APTES 包覆铁纳米线。（B）使用 EDC + Sulfo-NHS 活化抗体，最终实现（C）抗体功能化的纳米线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="纳米线铝对准，示意图；显微镜，纳米材料结构，比例尺1 cm，工艺研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：沉积铁的铝盘。（A）切割前的铝盘。（B）红线标示出铝盘的切割位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="纳米线簇；A) 溶液中的簇，B) 悬浮液，C) 磁场诱导分离过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：纳米线释放步骤。（A）纳米线簇悬浮于NaOH溶液中。图像拍摄于加入NaOH并去除Al膜后10分钟。（B）纳米线在乙醇中呈悬浮状态。照片拍摄于释放过程的最后一步，即超声处理后立即拍摄。（C）通过磁铁收集的黑色纳米线沉淀物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光谱数据分析；纳米材料；氧/铁元素分布图；显微镜，光谱图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：电子能量损失谱（EELS）分布图。（A）APTES 包覆的纳米线（APTES-NW）。蓝色和粉红色分别代表铁原子和硅原子。（B）未包覆的纳米线（NW）。深蓝色和浅蓝色分别代表铁元素以及铁/氧混合元素分布。未包覆纳米线的相应 EELS 分布图：（C）核部和（D）壳部。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞裂解液分析；CD44纳米线，同型对照纳米线，视觉比较；实验结果图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：抗体偶联纳米线的功能化及活性验证。通过免疫沉淀（IP）和蛋白质印迹（WB）验证了CD44-NWs的抗原性。+Ve：阳性对照（全细胞裂解液）；-Ve：阴性对照（仅非包被纳米线）；– CD44细胞：不表达CD44抗原的细胞；+ CD44细胞：表达CD44抗原的结肠癌细胞。本图为代表性结果，来自n = 3次独立实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="表面电荷分析中NWs、APTES-NWs和抗体-NWs的Zeta电位柱状图比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：NWs、APTES-NWs和抗体的Zeta电位值。柱状图表示均值 ± 标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞中CD44和同型对照纳米线的荧光显微镜图像，比例尺为10 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：共聚焦显微镜图像显示特异性靶向效果。CD44-NWs显示出结合现象（A 和 C），而同型对照-NWs（阴性对照）未发生结合（B 和 D）。红色、蓝色和绿色分别代表细胞膜、细胞核以及CD44-NWs的聚集。A和B分别为C和D的明场图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示抗体纳米线（Antibody-NWs）、APTES纳米线（APTES-NWs）、纳米线（NWs）和无纳米线（No NWs）组细胞存活率百分比的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig08.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：结肠癌细胞（HCT116）与不同配方纳米线共孵育后的细胞存活率研究。细胞在孵育24小时后用纳米线处理，随后再与纳米线共同孵育24小时。所有实验均在37 °C的培养箱中进行。柱状图表示均值±标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>数值</td>
			<td>单位</td>
			<td rowspan="6"></td>
			<td rowspan="6"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe 纳米线长度 (h)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>半径 (直径/2) (r)</td>
			<td>0.01679231</td>
			<td>µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe 密度 (D)</td>
			<td>7.87</td>
			<td>g/cm3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单根 Fe 纳米线体积 (V) = π r^2h</td>
			<td>2.30E-15</td>
			<td>cm3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单根 Fe 纳米线质量 = V × D</td>
			<td>1.80E-08</td>
			<td>µg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单根 Fe 纳米线表面积 = 2π r^2 + 2πrh</td>
			<td>2.76E-01</td>
			<td>µm2</td>
			<td>2.8E+05</td>
			<td>nm2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：铁纳米线质量的计算。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>数值</td>
			<td>单位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES/100 µL 的密度*</td>
			<td>9.50E-01</td>
			<td>g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES 的分子量 (MW)</td>
			<td>2.21E+02</td>
			<td>g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES 的摩尔数 = 质量/MW</td>
			<td>4.29E-03</td>
			<td>mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每 100 µL 中 APTES 分子的数量**</td>
			<td>2.57E+21</td>
			<td>分子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES 尺寸 ***</td>
			<td>5.00E-01</td>
			<td>nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES 表面积</td>
			<td>2.00E-01</td>
			<td>nm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NW 的表面积****</td>
			<td>2.76E+05</td>
			<td>nm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 mg NW 中的 NW 数量 ****</td>
			<td>1.70E+10</td>
			<td>NWs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>在 NW 周围形成单层所需的 APTES 分子数量</td>
			<td>1.38E+06</td>
			<td>APTES 分子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 mg NW 所需的 APTES 分子数量</td>
			<td>2.35E+16</td>
			<td>APTES 分子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*参考文献编号 61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">** 分子数 = 摩尔数 × 阿伏伽德罗常数 (6E+23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">***参考文献编号 62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">****来自表 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：计算纳米线涂层所需APTES分子数量。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>Y形IgG抗体</td>
			<td>纳米线（NW）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单个抗体的质量</td>
			<td>2.3E-13 µg</td>
			<td>1.8E-08 µg*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单个抗体的表面积</td>
			<td>23 nm2</td>
			<td>2.6E+05 nm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基于BCA测定法</td>
			<td colspan="2">每1 mg纳米线含0.3 mg抗体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每毫克纳米线所对应的0.3 mg抗体中的抗体分子数与纳米线数量</td>
			<td colspan="2">约1E+15个抗体** 对应约5.6E+10根纳米线</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每根纳米线所结合的抗体分子数</td>
			<td colspan="2">约2E+04个抗体/每根纳米线***</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*根据表1计算得出</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">**0.3 mg抗体中的分子数量是通过将BCA法测得的抗体质量（0.3 mg）除以Y形IgG抗体的平均分子量（180 kDa = 3E-16 mg）计算得出。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">***根据单个Y形IgG抗体分子的表面积（约23 nm²）和单根纳米线的表面积（约2.6E+05 nm²），约1E+04个抗体即可在纳米线表面形成单层覆盖。在本实验中，抗体密度为理论值的两倍，这可能与APTES涂层提供了更多可结合位点、从而促进抗体高密度附着有关。该条件可确保纳米线表面被抗体充分覆盖，无论纳米线取向如何，抗体与细胞表面抗原结合的机会均较高。然而，若抗体密度低于理论值（1E+04个抗体分子），则细胞与纳米线之间的结合概率将降低。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：纳米线上的抗体数量计算。

在本研究中，我们提供了一种利用抗体对磁性纳米材料进行生物功能化的方案，以实现对特定细胞的靶向。作为示例，我们使用铁纳米线来靶向癌细胞。

磁性纳米材料在多种生物医学应用中受到广泛关注。通过使用特异性靶向分子对这些纳米材料进行生物功能化……

本方案的关键特征在于，其可应用于多种铁-氧化铁纳米材料，也可用于多段纳米材料（如铁-金纳米线）。该方案可在任何标准生物实验室中安全地进行。该生物功能化技术的主要优势在于能够基于纳米线与抗体之间形成的牢固共价键，制备出具有特异性靶向性的纳米材料。首先使用单刃刀片和小锤将铝片切割成小块。将切割后的铝片放入一个2毫升的离心管中，并加入1毫升1摩尔的氢氧化钠溶液，确保所有铝片均被浸没。将离心管置于通风橱中室温下静置30分钟。孵育结束后，用镊子取出铝片，并将释放出的纳米线在氢氧化钠溶液中继续保留30分钟。将离心管放入磁力干燥架上，静置2分钟，然后更换为新鲜的氢氧化钠溶液。将含有纳米线的2毫升离心管超声处理30秒，然后置于化学通风橱中静置1小时。重复此步骤至少四次。完成后，将2毫升离心管置于磁力架上，弃去氢氧化钠溶液，并加入1毫升无水乙醇替代。将纳米线超声处理30秒，将离心管置于磁力架上，更换乙醇。至少重复乙醇洗涤四次。洗涤纳米线后，用1毫升移液器将其转移至一个5毫升玻璃管中。向纳米线溶液中加入100 µL APTES，涡旋振荡玻璃管20秒。将试管置于超声波清洗仪中，超声处理1小时。然后将试管从超声波清洗仪中取出，加入400 µL去离子水和20 µL 1 M氢氧化钠溶液。重复进行一小时的超声处理。将玻璃管从超声波清洗槽中取出后，置于磁铁旁以收集纳米线。弃去上清液，加入一毫升新鲜无水乙醇，再将试管超声处理10秒。重复乙醇洗涤和超声处理两次。在2毫升离心管中溶解0.4毫克EDC、1.1毫克Sulfo-NHS和1毫升MES。在另一个2毫升离心管中，加入960微升0.1摩尔PBS，并加入30微升抗CD44抗体。接下来，向该离心管中加入10 µL先前配制的EDC/Sulfo-NHS混合液。将抗体管放入摇床中，在室温下以10 ×g振荡15分钟。同时，将磁铁置于含有APTES修饰纳米线的离心管旁静置2分钟，弃去乙醇，并用PBS缓冲液替代。将纳米线超声处理10秒。用PBS最后一次洗涤后，收集纳米线，并将活化的抗体溶液转移至纳米线管中。然后再次超声处理10秒。将离心管置于4 °C旋转器中过夜。次日，用磁铁收集纳米线并弃去上清液。加入1 mL的2% BSA，在4 °C孵育1小时以阻断反应。电子能量损失谱（EELS）成像可用于观察纳米线表面的硅原子，并确认APTES涂层的存在。在未涂层的纳米线上，铁原子呈深蓝色，而铁和氧的混合原子呈浅蓝色。相应的未涂层纳米线EELS元素分布图显示，中心区域的铁信号强度高于表面，表明其具有铁-氧化铁结构。 mapping结果表明，氧化铁层中铁(II, III)氧化物的含量高于铁(III)氧化物。通过免疫沉淀和蛋白质印迹实验验证了所连接抗体的抗原性。采用BCA法对纳米线上的抗体数量进行定量。通过测量Zeta电位来阐明表面功能化情况。与未包被的纳米线相比，APTES上的末端氨基减少了负电荷。抗体功能化进一步降低了电荷。通过共聚焦显微镜确认了抗体功能化纳米线对特定细胞的靶向性。图A和图B分别为样品C和D的明场显微镜图像。红色表示细胞膜，蓝色表示细胞核，绿色簇状结构表示附着的靶向CD44纳米线的存在。此外，通过细胞活力检测验证了未包被、APTES包被和抗体包被的纳米线具有生物相容性。在APTES包被过程中，必须先加入去离子水，再加入氢氧化钠溶液，以增强APTES分子与纳米线之间的结合。同时，在生物功能化过程中，需要用PBS缓冲液对纳米线进行数次洗涤，以增强抗体与纳米线之间的共价键结合。

biofunctionalization-of-magnetic-nanomaterials

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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