磁性纳米材料的生物功能化

本方案的关键特征在于，其可应用于多种铁-氧化铁纳米材料，也可用于多段纳米材料（如铁-金纳米线）。该方案可在任何标准生物实验室中安全地进行。

该生物功能化技术的主要优势在于能够基于纳米线与抗体之间形成的牢固共价键，制备出具有特异性靶向性的纳米材料。首先使用单刃刀片和小锤将铝片切割成小块。将切割后的铝片放入一个2毫升的离心管中，并加入1毫升1摩尔的氢氧化钠溶液，确保所有铝片均被浸没。

将离心管置于通风橱中室温下静置30分钟。孵育结束后，用镊子取出铝片，并将释放出的纳米线在氢氧化钠溶液中继续保留30分钟。将离心管放入磁力干燥架上，静置2分钟，然后更换为新鲜的氢氧化钠溶液。

将含有纳米线的2毫升离心管超声处理30秒，然后置于化学通风橱中静置1小时。重复此步骤至少四次。完成后，将2毫升离心管置于磁力架上，弃去氢氧化钠溶液，并加入1毫升无水乙醇替代。

将纳米线超声处理30秒，将离心管置于磁力架上，更换乙醇。至少重复乙醇洗涤四次。洗涤纳米线后，用1毫升移液器将其转移至一个5毫升玻璃管中。

向纳米线溶液中加入100 µL APTES，涡旋振荡玻璃管20秒。将试管置于超声波清洗仪中，超声处理1小时。然后将试管从超声波清洗仪中取出，加入400 µL去离子水和20 µL 1 M氢氧化钠溶液。

重复进行一小时的超声处理。将玻璃管从超声波清洗槽中取出后，置于磁铁旁以收集纳米线。弃去上清液，加入一毫升新鲜无水乙醇，再将试管超声处理10秒。

重复乙醇洗涤和超声处理两次。在2毫升离心管中溶解0.4毫克EDC、1.1毫克Sulfo-NHS和1毫升MES。在另一个2毫升离心管中，加入960微升0.1摩尔PBS，并加入30微升抗CD44抗体。

接下来，向该离心管中加入10 µL先前配制的EDC/Sulfo-NHS混合液。将抗体管放入摇床中，在室温下以10 ×g振荡15分钟。同时，将磁铁置于含有APTES修饰纳米线的离心管旁静置2分钟，弃去乙醇，并用PBS缓冲液替代。

将纳米线超声处理10秒。用PBS最后一次洗涤后，收集纳米线，并将活化的抗体溶液转移至纳米线管中。然后再次超声处理10秒。

将离心管置于4 °C旋转器中过夜。次日，用磁铁收集纳米线并弃去上清液。加入1 mL的2% BSA，在4 °C孵育1小时以阻断反应。

电子能量损失谱（EELS）成像可用于观察纳米线表面的硅原子，并确认APTES涂层的存在。在未涂层的纳米线上，铁原子呈深蓝色，而铁和氧的混合原子呈浅蓝色。相应的未涂层纳米线EELS元素分布图显示，中心区域的铁信号强度高于表面，表明其具有铁-氧化铁结构。

mapping结果表明，氧化铁层中铁(II, III)氧化物的含量高于铁(III)氧化物。通过免疫沉淀和蛋白质印迹实验验证了所连接抗体的抗原性。采用BCA法对纳米线上的抗体数量进行定量。

通过测量Zeta电位来阐明表面功能化情况。与未包被的纳米线相比，APTES上的末端氨基减少了负电荷。抗体功能化进一步降低了电荷。

通过共聚焦显微镜确认了抗体功能化纳米线对特定细胞的靶向性。图A和图B分别为样品C和D的明场显微镜图像。红色表示细胞膜，蓝色表示细胞核，绿色簇状结构表示附着的靶向CD44纳米线的存在。

此外，通过细胞活力检测验证了未包被、APTES包被和抗体包被的纳米线具有生物相容性。在APTES包被过程中，必须先加入去离子水，再加入氢氧化钠溶液，以增强APTES分子与纳米线之间的结合。同时，在生物功能化过程中，需要用PBS缓冲液对纳米线进行数次洗涤，以增强抗体与纳米线之间的共价键结合。