Name: 通过在系列中应用三种既定技术，调查大 肠杆菌 的弗拉盖拉驱动的动性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 了解利用软琼脂平板、群集实验和相差显微镜分析大肠杆菌鞭毛驱动运动性的三种既定技术。该方法有助于研究细菌个体与集体运动机制及其在病原行为中的作用。

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本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目 GM118085 以及罗伯特·韦尔奇基金会（资助号 F-1811，授予 R.M.H.）的部分支持。

1. 运动缺陷型菌株中抑制突变体的分离
注意：将此方法作为广泛的“通用检测”手段，用于确定运动缺陷的一般性质。
<ol>
	<li>软琼脂平板制备 
	注意：软琼脂（也称为运动性琼脂或泳动琼脂）是一种低浓度琼脂（约0.2–0.35% w/v），长期以来用于趋化性检测31,32。
	<ol>
		<li>在2 L的圆底烧瓶中加入3 g细菌琼脂（0.3% w/v）和20 g LB培养基。向烧瓶中加入1 L去离子水（ddH2O），使用搅拌棒和磁力搅拌器均匀混合悬浮液。</li>
		<li>在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
		<li>用上述搅拌棒和磁力搅拌板轻轻搅动使其冷却。当温度降至约50 °C时，将25 mL液体倒入无菌培养皿（100 mm × 15 mm）中，盖上皿盖静置至少1小时，使琼脂凝固，制备好的平板应在16小时内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>菌种培养、接种及抑制突变体的分离 
	注意：E. coli在以软琼脂固化的营养丰富培养基中心接种后，会在局部消耗营养物质，形成细菌可追随的营养梯度。随着细菌向外移动，会出现明确的“环状”区域（图1A），这些环与细菌响应的特定趋化物相关。趋化系统或鞭毛马达结构组分的缺陷均可能影响该实验中的运动表现。在筛选过程中，常会出现具有运动优势的突变体，这些突变体可从环边缘的一个或多个位点“喷射”状向外延伸（图1C）。可以观察到，泳动前沿的最外缘与未被菌落占据的原始软琼脂区域之间有明显对比。
	<ol>
		<li>将目标运动缺陷型菌株接种于5 mL Lennox肉汤（LB；含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L NaCl，材料表）中，在30 °C下以水平摇床（220 r.p.m.）过夜培养。次日，取培养物以1:100比例转接至新鲜LB培养基中，在相同条件下培养至对数生长期（OD600为0.6）。</li>
		<li>使用移液器吸取6 µL菌液，将无菌吸头插入软琼脂平板（1.1）中心，轻柔推出菌液完成接种。将平板转移至30 °C培养（图1B），直至观察到从接种点或运动环边缘明显向外延伸的“喷射”状菌群，通常需要24–36小时（图1C）。 
		注意：在运动性检测中，应同时接种野生型菌株作为突变株的对照。野生型菌株将表现出典型的同心趋化环（图1A），并在8–10小时内填满整个平板。</li>
		<li>用无菌接种环挑取“喷射”区域的菌体，在LB硬琼脂平板（LB按上述方法配制，添加15 g/L细菌琼脂固化）上划线以纯化单菌落。</li>
		<li>用无菌接种环挑取划线平板上的单菌落，再次划线分离单菌落，以确保获得“纯”菌落的分离株。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抑制突变体的验证与表征
	<ol>
		<li>确认所分离的抑制突变体是否恢复了运动能力。制备软琼脂平板（1.1），并准备待测菌株的培养物（同1.2.1），包括野生型菌株和原始“运动缺陷型”菌株作为对照。</li>
		<li>按步骤1.2.2接种平板，并在30 °C下培养8–10小时。</li>
		<li>测量最外层环（圆形边缘）的直径，并进行比较，以确定哪些分离株显著恢复了运动能力。 
		注意：建议在整个实验过程中定期拍摄平板照片。为获得最佳效果，可使用“光源桶”装置30，即将数码相机置于光源上方，以提供更佳照明，便于准确测量泳动菌落的直径，并将其与未被菌落占据的琼脂区域区分开。</li>
		<li>根据需要对已验证的分离株进行全基因组测序（WGS），确保有足够的“测序覆盖深度”，以准确鉴定出恢复野生型功能的突变位点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过细胞拴系定量分析鞭毛马达行为
注意：当正常的奔跑-翻滚行为（趋化性）似乎受损时，使用此方法。
<ol>
	<li>培养物制备与鞭毛剪切
	<ol>
		<li>按照步骤 1.2.1 所述方法，制备目标菌株的对数生长期培养物。</li>
		<li>取 10 mL 菌液，在 2,000 x g 条件下离心 3 分钟以收集菌体，随后用 10 mL 过滤除菌的运动缓冲液（MB；10 mM 磷酸钾缓冲液 [0.0935 M K2HPO4, 0.0065 M KH2PO4, pH 7.0]、0.1 mM EDTA [pH 7.0]、10 mM NaCl、75 mM KCl）重悬菌体。 
		注：MB 可支持细菌 运动性，但不支持细菌生长</li>
		<li>重复步骤 2.1.2 两次，最后将菌体沉淀重悬于 1 mL MB 中。</li>
		<li>将菌悬液转移至 1 mL 注射器中，并在末端连接一根 23G 针头。准备另一套相同的注射器/针头装置，并用一段长 6 英寸、内径为 0.58 mm 的聚乙烯管紧密套接在两个针头尖端，将两套装置连接起来。</li>
		<li>通过缓慢地将菌悬液在两个注射器之间来回推注 50 次，以剪切鞭毛（鞭毛脆弱，易断裂），每推注 10 次后暂停 1 分钟。</li>
		<li>将剪切后的菌体在 2,000 x g 条件下离心 3 分钟，最后重悬于 500 µL MB 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>载玻片制备与细胞固定
	<ol>
		<li>通过将一块 18 mm × 18 mm 的盖玻片叠放在一块 3 英寸 × 1 英寸 × 1 mm 的玻璃载玻片上，并用双面胶带隔开，构建一个细胞固定室（图 S1）。</li>
		<li>将 0.01% (w/v) 多聚赖氨酸溶液加至固定室顶部，使溶液流入室内；将底部边缘（盖玻片与载玻片齐平的一侧）倾斜接触实验用纸巾（卫生纸），以毛细作用帮助溶液流经整个固定室（图 S1）。随后在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>使用步骤 2.2.2 所述方法，用 40 µL MB 洗涤固定室三次。</li>
		<li>向固定室顶部加入 40 µL 上述制备的剪切后菌悬液，在室温下孵育 10 分钟，使细菌附着于盖玻片表面。</li>
		<li>按照步骤 2.2.3 的方式，用 40 µL MB 轻柔冲洗固定室，以去除未附着的细菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞旋转记录与定量分析
	<ol>
		<li>将载有固定细菌的载玻片转移至显微镜载物台上。</li>
		<li>使用相差显微镜和 100 倍物镜，扫描观察细菌群体，寻找位置固定且沿单一轴线旋转的细胞，即在固定点上平稳旋转、而非倾斜导致细胞在焦平面内外移动的个体（视频 1）。</li>
		<li>使用商用显微镜及其配套相机，打开相应软件，确保目标细胞处于清晰对焦状态，点击 视频采集 按钮，以每秒 10 帧或更高的帧率记录一分钟的细胞旋转过程。</li>
		<li>通过视频回放，定量统计每分钟完成的完整旋转圈数以及细胞改变旋转方向的次数（切换频率）。 
		注：旋转速度和方向切换频率可能过快而难以肉眼判断，建议使用支持慢速或逐帧播放的视频分析软件，或采用自动化软件系统来量化旋转模式33。另一种替代方法是使用甲基纤维素（或类似试剂）提高 MB 的黏度，以减缓快速运动细菌的旋转速度，便于观察解析，或在使用低帧率相机时进行补偿。</li>
		<li>对多个生物学重复样本重复步骤 2.3.2，以获得目标群体的代表性数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 边界穿越实验中群体的制备
注意：使用此方法评估突变或条件对群体运动性的影响。Swarm-agar（群游琼脂）指琼脂浓度通常高于软琼脂的培养基。在软琼脂（0.3%）中，细胞在琼脂内部单独游动；而在群游琼脂（0.5%及以上）中，细胞在琼脂表面以群体形式移动。虽然群游平板必须按此处详述的方式使用，但游动平板保存期限较长，可使用数天。我们通常倾向于在1至2天内使用。
<ol>
	<li>群集琼脂的制备
	<ol>
		<li>在2 L的圆底烧瓶中加入5 g Eiken琼脂（0.5% w/v）和20 g LB培养基。加入1 L去离子水（ddH2O），使用搅拌棒和磁力搅拌器将悬浮液充分混匀。</li>
		<li>在121 °C条件下高压灭菌20分钟。</li>
		<li>在轻微搅拌下冷却，避免产生气泡（方法同上）。当温度降至约50 °C时，加入滤膜除菌的葡萄糖，使其终浓度为0.5%。</li>
		<li>将25 mL琼脂倒入无菌培养皿（100 mm × 15 mm）中，在室温下静置至少14小时，但不超过20小时。请勿储存以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>群集平板的接种与培养
	<ol>
		<li>取6 µL处于对数中期的菌液（按步骤1.2制备），点样于琼脂表面进行接种。</li>
		<li>打开皿盖静置5–10分钟，待接种物完全渗入琼脂表面后盖上皿盖。</li>
		<li>在30 °C下培养8小时。避免频繁开盖观察群集进展，以免琼脂干燥，影响群集行为。 
		注意：培养时间可能因菌株表型不同而有所变化。某些突变可能削弱群集能力，需降低琼脂浓度或延长培养时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>跨边界迁移实验平板的制备 
	注意：本实验使用一种改良的培养皿，其中塑料隔板（边界）将培养皿分为两个独立腔室（图2A）。两个腔室可分别制备，以设置不同的群集条件，随后通过“连接”实现迁移。根据实验设计，左侧腔室可使用游动琼脂（0.3% w/v）或群集琼脂（0.5% w/v），使细菌从该侧迁移至右侧含有群集琼脂（可添加或不添加特定补充物或刺激物，如抗生素）的腔室。通常通过测量从原始接种点出发的细菌定植区域的最大直径（边缘到边缘）来评估并比较在不同琼脂上的迁移能力。
	<ol>
		<li>如需使用，按步骤1.1所述制备游动琼脂。</li>
		<li>按步骤3.1所述制备群集琼脂。</li>
		<li>向双腔培养皿（100 mm × 15 mm）的右侧腔室中倒入约30 mL群集琼脂（如需可添加特定补充物），使液面与腔室间的塑料隔板齐平，但不溢入左侧腔室（图2B）。</li>
		<li>待琼脂凝固后，向左侧腔室加入约30 mL游动琼脂或群集琼脂，同样加至与塑料隔板接触但不溢出（图2C）。在琼脂尚未凝固前，使用无菌移液器吸头轻轻将琼脂沿隔板拖拽，形成一个高度约1 mm、贯穿整个隔板长度的琼脂桥，以连接两侧（图2D）。</li>
		<li>将平板在室温下晾干（3.1）。 
		注意：另一种构建琼脂桥的方法是让左侧腔室的琼脂先干燥，然后缓慢沿塑料隔板加入约100 μL熔化的群集琼脂，以连接两个腔室（3.4）。随后按上述方法在左侧腔室接种（游动琼脂参照1.2.2，群集琼脂参照3.2），在30 °C培养12–16小时，或直至菌群在右侧腔室中迁移至足以比较目标菌株差异的程度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

分离和鉴定抑制性突变已成功帮助识别趋化系统中的关键组分35,36,37，以及运动装置本身38,39,40。在使用方案1时，应包含多个独立的重复实验，以确保能够分离出大量可能补偿运动缺陷的突变。通过将菌液划线接种而非点种，增加细菌数量，可提高获得抑制性突变体的概率41。同一突变（通过DNA测序确定）被多次独立分离，可增强其真实性的可信度。全基因组测序（WGS）不可避免地会揭示基因组中存在其他突变，因此，通过转导（如可行）将鉴定出的突变回置到原始的运动缺陷型背景中以验证结果至关重要。抑制性突变体方法依赖于通过二次突变恢复功能，因此该方法的一个局限性在于：如果某个关键的结构基因被完全删除（即该基因是整个通路或结构的基础），则可...

细菌利用多种附属结构在其生态位中进行运动和扩散1。其中，鞭毛驱动的运动速度最快，能够响应环境信号促进细菌向有利环境定植，并显著增强某些物种的致病能力2,3。具有鞭毛的细菌可在液体环境中独立游动，或在半固体表面以群体形式协同迁移4。细胞外的鞭毛通过嵌入膜内的旋转马达进行附着和驱动，该马达利用离子梯度产生的能量产生转矩，从而驱动鞭毛旋转1,2,4,5,6,7,8。在E. coli中，其马达以恒定转矩运行9，马达输出可通过旋转速度以及转子在逆时针（CCW）和顺时针（CW）方向之间的切换来表征。CCW旋转促进形成协调的鞭毛束，推动细胞向前运动（“run”），而短暂的方向切换（CW）则导致鞭毛束部分或完全解聚10，使细胞重新调整其游动方向（“tumble”）。E. coli通常向前游动约1秒，翻滚约0.1秒。转子的切换频率，即“翻滚偏向”（tumble bias），由趋化信号系统调控：跨膜化学感受器检测外部化学信号，并通过磷酸化级联反应将信号传递至鞭毛马达，从而在存在趋化物时延长游动时间，或在存在有毒化学物质时抑制游动11,12。游动能力通常在0.3%软琼脂中进行检测。
在群集运动过程中，细菌以密集的群体形式在半固体表面移动，成群的细菌持续进行旋转流动2,13,14,15。E. coli 的群集运动表现出改变的趋化生理特性（翻滚频率降低）、更高的运动速度，以及相较于在液体环境中游动的细胞更强的抗微生物能力16,17。群集细胞在促进运动的多种策略上存在差异，包括表面活性剂的产生、超量鞭毛以及细胞伸长2。群集行为在生态和临床环境中为细菌提供了竞争优势18,19,20。群集细菌可分为两类：温带群集菌仅能在含0.5–0.8%琼脂固化的培养基上群集，而强健群集菌则可在更高琼脂浓度下迁移21。
存在多种用于研究游动运动性及其调控机制的检测方法。当运动性因突变或环境条件受损时，其本身可作为强有力的筛选指标，用于鉴定获得功能的抑制性突变。这些抑制性突变可能是原始突变的真实回复突变体，也可能是假回复突变体，即通过第二个突变恢复功能。此类突变体可通过全基因组测序（WGS）进行鉴定。另一种替代非偏向性抑制子筛选的方法是采用有偏向的靶向诱变策略（例如PCR诱变）。这些方法通常有助于揭示运动装置的功能或环境调控机制。如果研究目标是分析马达功能，则在软琼脂中测得的野生型运动性的恢复并不一定意味着野生型马达输出功能的恢复。细胞拴系实验是一种评估马达行为的首选初步检测方法，该实验通过单根鞭毛将细胞固定在玻璃表面，随后监测细胞体的旋转情况。尽管目前已有更复杂的技术可用于监测马达特性，但其所需的高速摄像装置以及运动分析软件包的应用限制了这些方法的广泛使用22,23,24,25。细胞拴系实验仅需将鞭毛剪切，使短的鞭毛片段能够附着于载玻片表面，随后通过录像记录细胞体的旋转即可。尽管由于细胞体对鞭毛施加的负载较高，该实验中记录到的马达转速较低，但它仍为研究趋化反应提供了有价值的见解26,27,28,29，并且如后文所述，仍然是一个有效的研究工具。
群集运动能力对研究人员提出了不同的挑战。13 只有在能够大量产生表面活性剂并易于发生群集运动的菌株中，获得功能型抑制子的筛选方法才有效。像大肠杆菌（E. coli）这类不产生表面活性剂的菌株，则对琼脂种类、培养基成分以及环境湿度的要求极为严格2,13,14,21。一旦建立了群集条件，边界穿越实验17 就成为研究群集菌群适应新环境或恶劣条件能力的有效方法。尽管下文所述方案&#160;针对的是 E. coli，但这些方法可轻松调整并应用于其他物种。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto 脱水琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐，二水合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken 琼脂</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>大肠杆菌群集运动所必需</td></tr><tr><td>葡萄糖 D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB（Lennox）肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液（0.1%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH2PO4）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾（K2HPO4）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料与设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense 显微镜成像软件（V. 1.6）</td><td>Olympus</td><td></td><td>或所用显微镜的等效软件</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 双面胶带</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>磨砂载玻片（3×1×1 mm）</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>任何正置或倒置相差显微镜均可使用</td></tr><tr><td>培养皿（100 mm 直径）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>用于软琼脂实验</td></tr><tr><td>聚乙烯雾化毛细管（0.58 mm × 99 mm，3.0 m）</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>双区圆形培养皿</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>用于边界跨越实验</td></tr><tr><td>安全型皮下注射针头（23G）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器 - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue 擦拭纸</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>或等效的一次性擦拭纸</td></tr><tr><td>VWR 显微盖玻片（18×18 mm）</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 相机</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>或等效显微镜相机</td></tr></tbody></table>

研究鞭毛驱动的运动性 大肠杆菌 通过依次应用三种成熟技术

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

运动性对许多细菌物种的生存和成功至关重要。目前已有多种方法可利用细菌运动性来研究信号通路、阐明鞭毛组分的功能与组装机制，以及观察和理解其运动模式。本文展示了其中三种方法的结合应用。软琼脂中的运动性检测是最经典的方法，能够有效筛选出在运动缺陷菌株中恢复运动能力的获得功能型抑制突变，即通过第二次突变恢复运动性。细胞锚定技术最初用于证明鞭毛马达的旋转特性，现可用于评估信号效应分子对马达转速及其切换旋转方向能力的影响。“边界穿越”实验则是较新的方法，可使游动细菌被诱导转变为群体性迁移的群集运动状态。这三种方法联合使用，构成了一套系统而强大的策略，可用于鉴定运动装置的组成成分，并表征它们在游泳和群集运动不同层面中的作用。这些方法也可轻松地推广应用于其他细菌物种的运动性研究。

在假回复突变体的分离中 E. coli 在我们实验室近期的研究中，详细描述了一种由于信号分子 c-di-GMP 水平过高而导致运动能力受损的菌株34该菌株（JP1442）含有两个突变：ΔyhjH 和 ΔycgRYhjH 是降解 c-di-GMP 活性最强的磷酸二酯酶 E. coliYhjH缺失导致c-di-GMP水平升高并抑制运动性。YcgR是一种c-di-GMP效应蛋白。当与c-di-GMP结合时，YcgR可结合至鞭毛转子，首先诱导逆时针（CCW）电机旋转，随后降低电机转速。细胞拴系实验和微珠实验证实，在双突变体中电机行为恢复至正常水平，但在软琼脂中的运动性并未恢复。34因此，我们采用该方案的第1步，在双突变体中分离假回复子簇图1C）。通过全基因组测序（HiSeq 4000 平台，PE 2 x 150 配置）定位的大多数突变34) 到 rssB，...

许多细菌利用鞭毛驱动的运动能力来在环境中移动，并单独或集体定植于有利的环境。本文展示了三种成熟方法的应用，这些方法利用运动性作为筛选工具，以鉴定参与游泳和群集运动的组分或通路。

运动性对许多细菌物种的生存与成功至关重要。已有多种方法利用细菌运动性来研究信号转导通路，……

本视频中演示的实验方案可在全球任何实验室中重现。这些方法相结合，构成了一套系统且强大的细菌鞭毛运动性表征手段。运动性是细菌扩散与存活的关键因素，而上述三种方法为分析单个及群体运动性提供了有用且强大的工具。本文所述技术可轻松应用于研究多种细菌，包括被归类为天然致病性的细菌。首次尝试该实验流程时需注意，若泳动平板制备不当，可能会观察到不一致的行为或看似集体运动但并不真实反映集体运动的模式。将目标运动缺陷菌株在 30 摄氏度、5 毫升 LB 培养基中水平振荡培养过夜，随后在相同条件下于新鲜 LB 培养基中继代培养至对数生长期。取6 µL培养物，将加样枪头插入软琼脂平板中心，轻轻推出内容物。在30 °C条件下培养平板，直至从接种点或运动环边缘明显出现运动晕圈。用无菌接种环从晕圈区域挑取细胞，并在LB固体琼脂平板上划线，以纯化单菌落。为了确认分离得到的抑制突变体是否恢复了运动能力，将目标菌株接种于软琼脂平板上进行培养。同时应包括野生型菌株和起始的运动缺陷型菌株作为对照。将培养平板在30°C条件下孵育8至10小时后，测量最外圈菌落的直径，以确定哪些分离株已显著恢复运动能力。准备目标菌株的对数生长期培养物。然后取10毫升菌液，在2000 × g条件下离心3分钟收集菌体，并用10毫升滤膜除菌的运动缓冲液（MB）重悬。在MB中再洗涤菌体两次，最后一次离心后用1毫升MB重悬菌体。将菌悬液转移至1毫升注射器中，并在末端连接一支23号针头。组装一个相同的注射器和针头装置，通过六英寸长的聚乙烯管将两者连接，确保聚乙烯管紧密包裹住每个针头尖端。将细胞悬液在两个注射器之间轻轻来回推注50次，每推注10次后暂停一分钟，以剪切鞭毛。随后在2000 × g 条件下离心剪切后的细胞3分钟，并将其重悬于500 µL MB培养基中。为制备细胞固定腔室，使用双面胶带将一块18 mm × 18 mm的盖玻片粘附在载玻片上，盖玻片与载玻片之间保持分离。加入0.01%多聚赖氨酸溶液至小室顶部以冲洗小室。将小室底边倾斜接触实验用擦拭纸，使溶液流经小室，然后在室温下静置10分钟。用40微升MB溶液洗涤小室三次，并在小室顶部加入40微升剪切后的细胞悬液。让细胞在盖玻片上贴附10分钟，然后用40微升MB轻轻冲洗腔室，以去除未贴附的细胞。将载玻片转移至显微镜载物台上，使用相差显微镜和100倍物镜扫描细胞群体，寻找固定在位并沿单一轴向旋转的细胞。打开显微镜软件，确保细胞处于焦点位置，开始视频采集，记录细胞旋转过程持续一分钟。通过视频回放，量化每分钟完成的旋转次数以及细胞改变方向的次数。取6 µL对数中期培养物，滴加到琼脂表面进行接种。打开盖子放置5至10分钟，待接种物完全干燥并渗入琼脂表面后，重新盖上盖子。然后将培养板在30摄氏度下孵育8小时。将约30毫升的游走琼脂倒入双区培养皿的右侧区域，确保琼脂液面与区域间的塑料分隔条齐平，但不要溢入左侧区域。待琼脂凝固后，在左侧区域加入约30毫升的游动或游走琼脂。在凝固之前，使用无菌的移液器吸头轻轻将琼脂推过边界，形成一个高约一毫米、横跨整个分隔区域长度的琼脂桥，以连接两侧。将培养皿在室温下晾干。倾注琼脂时，请注意其厚度。如果液面过高，就会溢出；如果过低，则无法连接两个腔室。本实验方案用于分离运动能力受损的双突变大肠杆菌菌株中的假回复突变克隆。其中一个回复突变体表现出接近野生型的运动能力。以双突变亲本和同基因型野生型菌株作为对照。通过分析视频记录来计算每分钟旋转次数，以及马达顺时针旋转的时间比例，即翻滚偏倚。与野生型大肠杆菌相比，yhjH突变体每分钟仅有几次旋转，且翻滚偏向性较低，符合预期。双突变体及其抑制子均表现出与野生型相似的运动行为。通过边界穿越实验比较野生型和抑制子分离株在含有卡那霉素的琼脂培养基上发生群体运动、越过边界并继续进行群体运动的能力。两种菌株从相同的接种点出发表现出相似的群集运动速率，但野生型菌株迁移至抗生素培养室的群集数量始终高于抑制子菌株。在较高浓度的卡那霉素条件下，两种菌株之间的差异更为显著。群集运动实验的设置可能较为困难。您可能需要花费一些时间优化绘图条件，以适应您所研究的细菌以及实验室在培养基制备过程中的具体条件。本方案中的技术已应用于多种具有鞭毛的细菌，并且很可能适用于大量尚未测试的物种。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过在系列中应用三种既定技术，调查大 肠杆菌 的弗拉盖拉驱动的动性

本方案描述了一种用于在化学效应物的稳定浓度梯度中研究细菌趋化性的微流控装置的开发。...

一种用于在稳定浓度梯度下定量细菌趋化性的微流控装置

来源：Morales-Soto, N. 等，细菌表面运动性实验的制备、成像与定量。J. Vis. Exp.

可视化细菌表面运动性的群集迁移实验

来源：Pioli, R., et al., 通过连续毛细辅助组装实现微生物与微粒的图案化。 J. Vis. Exp. (2021)本视频演示了使用无碳悬浮液和可控流体，通过微流控捕获装置捕获单个荧光标记的大肠杆菌（Escherichia...

基于微流控图案化与荧光标记的单细胞细菌生长追踪

来源：Scheidweiler, D., et al. 结合微流控装置与显微镜和流式细胞术研究多孔介质中跨空间尺度的微生物迁移。 J. Vis. Exp.

利用微流控装置评估细菌运动性

群集运动受物理和环境因素的影响。我们描述了一种两阶段实验方案及相关指南，以克服群集实验制备和数据采集过程中常见的挑战。本方法采用宏观成像技术，获取当前分析技术无法提供的群集行为的详细信息。...

细菌表面运动性实验的制备、成像与定量分析

最近的研究表明，细菌鞭毛马达能够感知多种环境信号，并随之发生结构重塑。本文所讨论的微珠检测方法有望帮助阐明这种结构重塑在细胞适应环境应激中的作用。...

鞭毛马达功能的生物物理表征

细菌细胞成像是一种新兴的系统生物学方法，旨在解析调控大型大分子机器功能的静态与动态过程。本文通过整合定量活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术，用于研究Legionella pneumophila...

应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

本研究介绍了一种显微镜方法，可对大肠杆菌（Escherichia...

生物噪声的连续测量 大肠杆菌 使用延时显微镜

本文描述了构建Aeromonas中特定糖基转移酶或含糖基转移酶区域的空突变株，以及为确定其编码酶在糖链生物合成中的作用和功能、并阐明该糖链在细菌致病性中的作用而开展的运动性测定和鞭毛纯化实验。...

构建无功能突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动性中的作用

本文介绍一种基于显色反应检测细菌运动能力的实验方案。该方法的主要优势在于操作简便、结果更准确，且无需使用专业设备。...

基于显色反应观察细菌运动性

本方案介绍了一种快速高效的方法，用于鉴定铜绿假单胞菌中参与多种运动类型的遗传因子。...

高通量观察运动表型的方法 铜绿假单胞菌

了解利用软琼脂平板、群集实验和相差显微镜分析大肠杆菌鞭毛驱动运动性的三种既定技术。该方法有助于研究细菌个体与集体运动机制及其在病原行为中的作用。

研究鞭毛驱动的运动性大肠杆菌通过依次应用三种成熟技术

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