Name: 活细胞向前遗传方法，识别和分离衣 原体沙眼中的发育突变体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 了解活细胞正向遗传学方法，用于识别和分离沙眼衣原体发育突变体。该技术利用荧光启动子报告基因和活细胞显微镜实时追踪衣原体细胞类型发育，有助于鉴定调控发育周期的关键基因。

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我们感谢华盛顿州立大学的 Anders Omsland 博士提供 CIP-1 无菌培养基。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金 R01AI130072、R21AI135691 和 R21AI113617 的资助。此外，爱达荷大学以及通过 NIH 基金 P20GM104420 资助的“复杂相互作用建模中心”提供了启动资金支持。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前可用的遗传工具存在局限性，这阻碍了对控制衣原体发育周期机制的解析。通过将我们的启动子-报告基因系统应用于Chlamydia，并结合活细胞自动显微镜技术，构建了一套可在24小时时间内对单个包涵体内的细胞类型发育过程进行实时监测的系统。该系统结合化学诱变和包涵体直接分离技术，建立了一种能够快速、克隆性筛选出具有改变的发育特征的Chlamydia的方法（图5）。
当提供细胞内离子环境和能量来源时，衣原体的原体（EBs）在宿主外具有代谢活性5,12。本研究利用这种原体的无细胞代谢特性，在宿主细胞外对纯化的原体进行诱变。在本实验方案中，正在代谢的原体直接使用EMS进行诱变处理。结果发现，EMS处理显著降低了原体的活力，并如预期那样产生了发育动力学表现各异的突变原体。
据估计，所述的EMS诱变方案每EB可产生约5-20个DN...

Chlamydia trachomatis（沙眼衣原体，Ctr）是一种专性胞内病原体，其生存与增殖依赖于一个双相发育周期1。该周期包含两种发育形态：原始小体（elementary body, EB）和网状体（reticulate body, RB）。EB不具备复制能力，但可通过效应分子诱导的内吞作用介导细胞侵入2。进入宿主细胞后，EB成熟转化为具有复制能力的RB。RB在重新转化为EB之前进行多轮复制，从而启动新一轮的感染。
有限的遗传学工具使得大多数衣原体研究局限于生化实验或依赖替代系统。因此，解析基因调控机制以及发育周期的控制过程一直较为困难3,4。衣原体研究领域中一个尤为重要的挑战，是实现对衣原体发育周期高时间分辨率的动态追踪，并鉴定参与其调控的相关蛋白。传统上，衣原体发育周期中的基因表达研究依赖于破坏性的“终点”方法，包括RNA测序（RNAseq）、定量PCR（qPCR）以及固定细胞显微镜观察5,6。尽管这些方法提供了宝贵的信息，但所采用的技术操作繁琐，且时间分辨率较低5,6。
在过去的十年中，随着质粒转化和突变技术的引入，对沙眼衣原体（Ctr）的遗传操作取得了进展7,8,9。在本研究中，开发了一种基于质粒的系统，用于在感染过程中实时监测单个包涵体内的衣原体发育情况。构建了一种表达网状小体（RB）和原体（EB）细胞类型特异性启动子-报告基因的衣原体转化株。RB特异性报告基因通过将早期RB基因euo的启动子与荧光蛋白Clover的上游融合而构建。EUO是一种转录调控因子，可抑制部分晚期EB相关基因的表达10。编码组蛋白样蛋白并参与EB核质浓缩的hctB基因的启动子被克隆至mKate2（RFP）的直接上游，以构建EB特异性报告基因11。hctBprom-mKate2/euoprom-Clover的载体骨架为p2TK2SW27。hctB和euo启动子从Ctr-L2基因组DNA中扩增获得。每个启动子序列包含目标衣原体基因预测转录起始位点上游约100个碱基对，以及相应开放阅读框（ORF）的前30个核苷酸（10个氨基酸）。荧光蛋白（FP）变体以商业化形式获得，为经过Ctr密码子优化的基因片段，并与各衣原体基因及其启动子的前30个核苷酸进行同框克隆。在mKate2的直接下游克隆了incD终止子。第二个启动子-报告基因被插入incD终止子的下游。将p2TK2SW2中的氨苄青霉素抗性基因（bla）替换为来自pBam4的aadA基因（壮观霉素抗性）。最终构建得到质粒p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover（图1A），并将其转化至Ctr-L2中7。该RB/EB报告菌株使得利用活细胞显微镜观察单个包涵体内发育周期成为可能（图1B,C）。
利用我们的启动子-报告基因构建体并结合化学诱变，设计了一种方案，用于追踪和分离在经诱变处理的沙眼衣原体血清型L2群体中表现出发育异常的单个克隆。该方案可实现对单个衣原体包涵体的直接监测，实时追踪基因表达谱的变化，识别具有异常发育基因表达模式的衣原体克隆，并从单个包涵体中进行Chlamydia克隆的分离。
尽管本实验方案是为鉴定参与衣原体发育的基因而专门设计的，但也可轻松加以改造，用于研究任意数量的衣原体遗传通路。

<table><tbody><tr><td>24孔聚苯乙烯板</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>用于分离株再感染的细胞培养生长</td></tr><tr><td>6孔玻璃底板</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>用于成像的细胞培养生长</td></tr><tr><td>96孔玻璃底板</td><td>Nunc</td><td>165305</td><td>用于成像的细胞培养生长</td></tr><tr><td>Bold line CO2 控制单元</td><td>OKO Labs</td><td>CO2 UNIT BL</td><td>显微镜载物台培养箱的CO2控制</td></tr><tr><td>Bold line T 控制单元</td><td>OKO Labs</td><td>H301-T-UNIT-BL-PLUS</td><td>显微镜载物台培养箱的温度控制</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Sutter Instrument</td><td>B1005010</td><td>毛细管</td></tr><tr><td>BrightLine 带通发射滤光片（514/30nm）</td><td>Semrock</td><td>FF01-514/30-25</td><td>荧光滤光立方体</td></tr><tr><td>BrightLine 带通发射滤光片（641/75nm）</td><td>Semrock</td><td>FF02-641/75-25</td><td>荧光滤光立方体</td></tr><tr><td>CellTram Vario</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>显微注射仪</td></tr><tr><td>Chlamydia trachmatis 血清型 L2</td><td>ATCC</td><td>VR-577</td><td>沙眼衣原体</td></tr><tr><td>CIP-1 培养基</td><td>自制</td><td>NA</td><td>无细胞培养基。IPB 添加 1% 胎牛血清、25 &amp;mu;M 氨基酸、0.5&lt;br/&gt; mM G6P、1.0 mM ATP、0.5 mM DTT 以及 50 &amp;mu;M GTP、UTP 和&lt;br/&gt; CTP。（Omsland, A. 2012）自制。</td></tr><tr><td>Cos-7 细胞（ATCC）</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>非洲绿猴肾细胞（宿主细胞）</td></tr><tr><td>放线菌酮</td><td>MP Biomedicals</td><td>194527</td><td>宿主细胞生长抑制剂</td></tr><tr><td>甲基磺酸乙酯，99%</td><td>Acros Organics</td><td>AC205260100</td><td>诱变剂</td></tr><tr><td>Fetal Plex</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-602</td><td>基础培养基补充剂</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>&lt;u&gt;https://imagej.net/Fiji&lt;/u&gt;</td><td>NA</td><td>开源图像分析软件。https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>Galaxy 170 S CO2 培养箱</td><td>Eppendorf</td><td>CO1700100X</td><td>细胞培养孵育</td></tr><tr><td>gblocks（荧光蛋白变体：Clover 和 mKate2）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>用于克隆至 p2TK2SW2 的 Ctr 优化荧光蛋白变体的 gblock ORF</td></tr><tr><td>庆大霉素 10mg/ml</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td>生长培养基用抗生素</td></tr><tr><td>HBSS（Hank's 平衡盐溶液）</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>宿主细胞清洗</td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Amersham Life Science</td><td>16920</td><td>抑制并逆转宿主细胞与EB之间的早期静电相互作用</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30237.01</td><td>生长培养基的pH缓冲液</td></tr><tr><td>InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5179 000.018</td><td>显微操作器</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>&lt;u&gt;https://jupyter.org/&lt;/u&gt;</td><td>NA</td><td>包涵体轨迹可视化。https://jupyter.org/</td></tr><tr><td>Lambda 10-3</td><td>Sutter Instrument</td><td>LB10-3</td><td>滤光轮控制器</td></tr><tr><td>Oko Touch</td><td>OKO Labs</td><td>Oko Touch</td><td>用于控制 Bold line T 和 CO2 单元的界面</td></tr><tr><td>Prior XY 载物台</td><td>Prior</td><td>H107</td><td>电动XY显微镜载物台</td></tr><tr><td>PrismR 离心机</td><td>Labnet</td><td>C2500-R</td><td>温控微量离心机</td></tr><tr><td>Problot 杂交炉</td><td>Labnet</td><td>H1200A</td><td>用于沙眼衣原体感染的摇动孵育器</td></tr><tr><td>Proscan II</td><td>Prior</td><td>H30V4</td><td>XYZ显微镜载物台控制器</td></tr><tr><td>Purifier Class 2 生物安全柜</td><td>Labconco</td><td>362804</td><td>细胞培养操作</td></tr><tr><td>RPMI-1640（无酚红）</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>成像用基础生长培养基</td></tr><tr><td>RPMI-1640（含酚红）</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td>基础生长培养基</td></tr><tr><td>scopeLED 激发光源 LED（470nm, 595nm）</td><td>scopeLED</td><td>F140</td><td>激发光源</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator Model 500</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-338-550</td><td>超声破碎仪，用于重悬沙眼衣原体沉淀</td></tr><tr><td>显微镜载物台培养箱</td><td>OKO Labs</td><td>H301-K-FRAME</td><td>多孔板孵育室</td></tr><tr><td>蔗糖-磷酸盐-谷氨酸缓冲液 1X（SPG）</td><td>自制</td><td>NA</td><td>沙眼衣原体储存缓冲液。（10 mM 磷酸钠 [8 mM K2HPO4, 2 mM KH2PO4]，220 mM 蔗糖，0.50 mM L-谷氨酸；pH 7.4）</td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td>细胞培养生长</td></tr><tr><td>TE 300 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>16724</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>THOR LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDD1B</td><td>白光光源</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>将宿主细胞从培养瓶中解离以接种至培养板</td></tr><tr><td>Zyla sCMOS</td><td>Andor</td><td>ZYLA-5.5-USB3</td><td>成像相机</td></tr><tr><td>&amp;micro;Manager 2.0gamma</td><td>&lt;u&gt;https://github.com/micro-manager/micro-manager&lt;/u&gt;</td><td>NA</td><td>开源自动化显微镜控制软件包</td></tr></tbody></table>

活细胞正向遗传学方法用于鉴定和分离chlamydia trachomatis中的发育突变体

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

胞内细菌病原体Chlamydia trachomatis经历一个包含两种形态上 distinct 的发育形态的发育周期。无复制能力的原体（EB）启动对宿主的感染。一旦进入宿主细胞，EB即分化为网状体（RB）。随后，RB进行多轮复制，再重新分化为具有感染性的EB形态。该周期对衣原体的存活至关重要，因为若无法在细胞类型之间转换，将导致无法入侵宿主或无法复制。
由于Chlamydia为专性细胞内寄生，遗传学技术的应用受到限制，这阻碍了对细胞类型发育相关分子机制的鉴定。我们设计了一种新型的双启动子-报告基因质粒系统，结合活细胞显微镜技术，可实现对细胞类型转换过程的实时可视化。为了鉴定参与调控细胞类型发育的基因，我们利用该活细胞启动子-报告基因系统建立了一种正向遗传学方法：首先对双报告基因菌株进行化学诱变，随后对发育动力学发生改变的Chlamydia进行成像与追踪，最后分离突变体克隆。该正向遗传学工作流程是一种灵活的工具，可针对多种遗传通路进行定向研究。

直接对我们的启动子-报告基因衣原体菌株进行EMS诱变，导致其感染力下降约75%。利用所述的活细胞成像方案，在24小时期间内对约600个包涵体进行了成像和追踪。通过定制的Python笔记本脚本，可视化了每个包涵体中两个报告基因的荧光表达动力学。采用两种可视化方法以鉴定候选的诱变株 沙眼衣原体 用于分离。第一种方法（步骤 3.3.8）可视化半最大表达量所需时间 euo 和 hctB 来自单个沙眼衣原体分离株的启动子在交互式散点图中图2）。如果包涵体位于模拟处理组的散点云之外，则将其选为分离对象。候选克隆根据其在视觉上是否明显偏离对照组散点云进行挑选。随后对每个克隆进行验证。克隆A3-6-67和B3-8-58被选中用于分离，因其表现出更短的半最大表达时间 euo 启动子以及更长的时间 hctB (图2).
用于识别具有改变动力学特征包涵体的第二种可视化方法（步骤 3.3.9-10）...

本方案采用荧光启动子报告系统、活细胞显微镜观察以及单个包涵体提取技术，通过定向正向遗传学方法，鉴定并分离沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）的发育突变株。

活细胞正向遗传学方法用于鉴定和分离Chlamydia trachomatis中的发育突变体

胞内细菌病原体沙眼衣原体经历一个包含两种形态上 distinct 发育形态的发育周期。...

本方案提供了一种独特的工具，用于生成并分离具有改变发育特征的沙眼衣原体，最终实现调控其发育周期相关基因的鉴定。该方法的主要优势在于能够实时追踪衣原体细胞类型的发育过程，并能够分离出具有改变发育程序的衣原体。为对沙眼衣原体报告菌株进行诱变，需准备一管衣原体储备液，其中含有约3×10⁷个原体。将含有目标报告质粒的样品离心形成沉淀后，通过离心收集转化后的细胞。加入100微升的随机代谢缓冲液，以10%功率超声处理10秒，重悬初体（elementary bodies），并将所得的初体悬液等分为两份，分别加入两个1.5毫升微量离心管中。向用于诱变的衣原体等分样品中加入50微升 freshly prepared EMS代谢溶液，仅用于保存的衣原体等分样品中则加入50微升vaccinic代谢缓冲液，随后将两份样品于室温孵育20分钟。EMS 是一种已知的致癌物，操作时应佩戴手套，并将所有被 EMS 污染的器械和培养基在 1 摩尔的氢氧化钠溶液中浸泡 24 小时后再行处理。为建立大规模培养物以进行突变化沙眼衣原体的成像与分离，将六孔玻璃底培养板每孔接种 6 × 10⁵ 个 C. trachomatis 细胞，每孔加入 2 毫升完全培养基；同时将 24 孔聚苯乙烯培养板每孔接种 1 × 10⁵ 个 C. trachomatis 细胞，每孔加入 1 毫升完全培养基。用诱变处理的沙眼衣原体感染宿主细胞培养物时，在玻璃底培养板中加入约6 × 10⁵个诱变后的原体，每孔加入1.5 mL冰上预冷的HBSS。在另一孔中加入约2 × 10⁵个未进行诱变处理的对照原体，每孔同样加入1.5 mL冰上预冷的HBSS。于37°C振荡孵育15分钟后，使用添加了1 mg/mL肝素的37°C HBSS洗涤感染细胞，随后立即用HBSS冲洗一次。再次用肝素洗涤细胞，随后立即用HBSS单独冲洗两次，以确保完全去除所有肝素。最后一次洗涤后，向每个孔中加入4毫升37摄氏度的成像培养基，并在孔间区域加入37摄氏度的去离子水，然后将培养板放入细胞培养箱中孵育10小时。孵育结束后，将显微镜载物台培养箱设置为5%二氧化碳、37摄氏度。将六孔玻璃底板放入载物台培养箱中。在成像软件中，使用高内涵筛选插件选择六孔板模板，并生成每个孔包含12个视野的成像位置列表；使用自动对焦功能设定自动成像的焦距，设置GFB通道的曝光时间为250毫秒、强度为4%，RFP通道的强度为18%。在24小时的成像周期中，以30分钟为间隔，捕获发育周期的动力学过程，并设置图像采集包含多个Z轴层叠，其聚焦范围需覆盖处于焦点位置切片两侧的区域，然后选择用于成像的相对Z轴位置，在采集窗口中设置多个切片，并使用图像堆栈文件选项，将图像保存为TIFF堆栈文件。为了识别具有不同发育特征的包涵体轨迹，可使用EMS界面中的导入细胞功能，通过Markdown Python笔记本，将来自轨迹统计spots的CSV文件中的包涵体轨迹数据导入Pandas数据框中。使用计算单元计算每条轨迹中早期和晚期报告基因达到最大表达所需的时间，并在“半最大值绘图”单元中使用 Bokeh 绘图包，将表达量达到半最大值的时间相对于 hctB 启动子进行可视化。利用 Bokeh 交互式轨迹 ID 浏览器，识别突变群体中偏离模拟处理散点云的包涵体。在动态动画血细胞图中，通过 EOU 启动子相对于 hctB 启动子的表达强度变化，动态可视化启动子表达动力学的改变。然后在包含体定位细胞中，观察动态图谱中的某一帧图像。为了从目标包含体中分离出发育中的衣原体，将视野对准一个已识别出包含体的孔，使针头经过相差干涉显微镜的白光通道光源，以观察针头位置；使用595纳米激发通道观察用于提取的原体。接着利用微调装置和显微操作仪，将毛细玻璃针移至包含体位置，用针头刺破包含体，并通过显微注射仪将原体吸入毛细玻璃针尖内。将提取的原体从毛细玻璃针头推出，注入已准备好的24孔聚苯乙烯板中的单个孔内，下一提取步骤需使用新的毛细玻璃针头。待每个分离株充分扩增后，用1毫升微量移液器吸头破坏感染的单层细胞，将培养基、细胞碎片及释放出的沙眼衣原体转移至新的1.5毫升微量离心管中。通过离心收集沙眼衣原体沉淀，将沉淀重悬于75微升冰上预冷的蔗糖磷酸盐谷氨酸缓冲液中，随后将包涵体悬液等分为三份，分别加入三个新的1.5毫升螺口微量离心管中，并将离心管储存于-80至-70摄氏度条件下。为建立用于成像 mutagen ISED 分离株的宿主细胞培养体系，需在96孔玻璃底板中每孔加入100 µL完全培养基和1.6 × 10⁴个COS-7细胞进行接种。待宿主细胞单层达到汇合状态后，将收获的突变克隆和野生型沙眼衣原体（Chlamydia）毒株置于冰上解冻，并为每个分离株使用一列进行两倍系列稀释。用野生型沙眼衣原体以约0.5的感染复数（MOI）感染剩余的一列，随后将培养板置于细胞培养箱中孵育10小时。孵育结束后，为每个突变分离株选择三个感染复数低于1的孔，并生成成像位置列表。每个孔包含两个视野。在此散点图中，可以观察到不同沙眼衣原体分离株的EOU和hctB启动子达到半数最大表达所需的时间。克隆株A3667和B3858被选中进行分离，因为它们的EOU启动子达到最大表达所需时间较短，而hctB启动子所需时间较长。通过可视化两种启动子的动态基因表达，可识别出具有改变表达动力学的包涵体，并可利用该动态图的某一帧快照来确定目标包涵体的位置。在这些代表性可视化结果中，共鉴定出24个包涵体用于分离，其中10个在三种不同表型类别中重新检测时表现出差异性动力学特征。8个分离株在感染后约24小时表现出EOU启动子表达水平下降。如A3667克隆所示，B3858分离株也在感染后约24小时表现出EOU启动子表达下降，但hctB启动子表达总体上升；而B3662分离株则表现为EOU启动子荧光信号增强，随后在两个启动子中均突然丧失表达。对突变株B3662的活细胞显微图像分析显示，在感染该突变株的细胞中，宿主细胞裂解发生的时间明显早于感染野生型的细胞。由于这些细胞无法再次感染宿主，可能导致无法回收细胞类型发育缺陷的衣原体。在分离后，可通过全基因组关联分析，结合替代启动子报告基因的引入，通过统计学相关性鉴定参与发育过程的基因。该方法可拓展应用于多种遗传通路的研究、遗传回路机制的解析，以及其他细胞内病原体的探究。

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科研

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免疫学与感染

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