活细胞向前遗传方法，识别和分离衣 原体沙眼中的发育突变体

该协议为具有改变发育特征的衣原体的生成和分离提供了一个独特的工具，最终允许识别调节发育周期的基因。这种方法的主要优点是能够实时跟踪衣原体细胞类型的发展，以及通过改变发育方案来分离衣原体的能力。为了使沙眼衣原体变化，记者看到一种衣原体，里面含有大约三倍于第十至第七的小学体。

与记者的血浆的兴趣和颗粒转换， 思想是库存的中分。使用10%功率的声波10秒，在100微升的意外代谢缓冲液中重新悬浮基本体，并在两个1.5毫升的微型离心管之间均等地分割由此产生的基本体悬浮液。将50微升新鲜准备好的EMS代谢溶液加入衣原体等分，用于诱变，将50微升的杂变代谢缓冲液加入衣原体等分，仅用于股票突变，并在室温下孵育两个样品20分钟。

EMS 是一种已知的致癌物质，在搬运过程中佩戴手套，并在处置前将所有 EMS 污染设备和介质浸泡在一个氢氧化硅摩尔钠中 24 小时。建立批发文化，用于成像和分离多样衣原体气管计。种子六井玻璃底板，六倍十至五成本七细胞，在两毫升完整的介质每井和种子24井聚苯乙烯板与10至第五导致七细胞在一毫升完整的介质每孔。

为了感染宿主细胞培养与突变否认衣原体沙眼感染，五井的玻璃底板约六倍10至第五，突变的基本身体。每井1.5毫升的冰冷HSS。感染剩余的井，大约2倍10至第五模拟突变的初级体在1.5毫升的冰冷HS每口，经过15分钟的孵育在37摄氏度，在摇摆，洗涤受感染的细胞与37摄氏度的HBSS补充1毫克每毫升肝素，然后立即HS冲洗。

再次用肝素清洗细胞，然后立即用HSS单独冲洗两次，以确保去除所有的肝素。上次洗涤后，在每个井中加入四毫升37摄氏度的成像介质。用37摄氏度的去维化水填充井间空间，然后将板放在细胞培养培养箱中10小时。

在孵化结束时，将显微镜阶段的孵化器设定为5%的二氧化碳和37摄氏度。将六井玻璃底板放入舞台孵化器。在成像软件中，使用高含量筛选插件选择六个井板模板，并生成一个由每个井 12 个视场组成的成像位置列表，使用自动对焦选项设置自动成像对焦，并在 GFB 通道的 4% 强度和 RFP 通道的密度为 18% 时将曝光设置为 250 毫秒。

因此，在 24 小时的成像周期中，以 30 分钟的时间间隔捕获开发周期的动力学，并设置图像捕获，以包括多个 Z 堆栈，其焦点范围以 InFocus 切片的两侧结束，然后选择相对 Z 进行成像，在采集窗口中选择多个切片，并使用图像堆栈文件选项。将图像设置为保存为 TIFF 堆栈文件。要识别包含轨道，并更改开发配置文件，请使用 EMS 屏幕中的导入单元格（即标记 Python 笔记本）将包含轨道数据从轨道统计信息中的点、CSV 文件导入 Panda 的数据框。

使用计算单元格计算每个轨道的早期和后期记录器具有最大表达式的时间，并使用半 max 绘图单元格中的散景绘图包将时间两个半最大表达式可视化为半最大值表达式，而不是 hctB prom 的半最大值表达式。使用散景交互式轨道 ID 资源管理器，识别来自突变群体中的内含物，这些包含位于模拟处理散点云之外。为了在动画血细胞图中动态地可视化启动子表达动力学的变化，EOU prom 对 hctB 舞会的表达强度。

然后在包含定位器单元格中可视化动画图形中的快照。为了将发育牛顿与感兴趣的内含物隔离开来，将视场定位在具有识别内含物的井上，并通过针穿过相位差对比度白光通道光源，使针对进行可视化，使用595纳米的激发通道，可视化提取的基本体。并使用微调和微操纵器，将毛细管针操纵到内含物上，用针来破裂内含物，并使用微喷油器将基本体拉入毛细管针尖。

将提取的基本身体，从毛细管针中排出到一孔中，在24孔中放入聚苯乙烯板，并使用新的毛细管针进行下一次萃取。每个分离物充分膨胀后，用一毫升微管尖破坏受感染的单层，将中细胞碎片转移，释放衣原体，进入新的1.5毫升微离心管。通过离心对收获的衣原体进行分离，将颗粒重新悬浮在75微升的冰冷、磷酸蔗糖谷氨酸缓冲液中，然后均等地将内含悬浮液分割，在三个新的1.5毫升螺丝帽微离心管之间，将管储存在零下80度以读取摄氏度。

建立宿主细胞培养物进行突变的成像，将种子分离出一个96井的玻璃底板，其1.6倍10至第四块，每井100微升的完整介质。宿主细胞单层达到汇合解冻后，收获的突变克隆和野生型衣原体在冰上储存，并使用每个分离体一列执行，每个突变体分离物的两倍连续稀释。感染，其余柱与野生型衣原体，在感染的多重性约0.5，并在细胞培养孵化器放置一个板10小时，在孵化结束时，选择三孔每个突变分离，对应于多种感染小于1，并生成一个成像位置列表。

由每井两个视场组成。在此散点图中，可以从单个氯原体分离物中观察到 EOU 和 hctB 启动子最大表达的时间到半，可以观察到克隆 A3667 和 B3858 被选择进行隔离，因为它们生成较短的时间以具有最大表达，从 EOU 启动子和更长的四个 hctB。根据可视化、两个启动子的动态基因表达，可以识别具有已更改动力学的内含物，并且可以使用动画图形的快照来标识感兴趣的内含物的位置。

在这些具有代表性的可视化中，共确定了24个隔离内含物，其中10个显示微分动力学，在重新测试三种不同的表型类别后，8个隔离物在感染后大约24小时内表现出减少的EOU启动子表达。正如 A3667 克隆所证明的，B3858 分离物在感染后大约 24 小时也表现出减少的 EOU 启动子表达。但是，hctB 促进器表达的整体增加，而 B3662 隔离，表示从 EOU 启动器的荧光水平增加，随后在两个启动子中突然失去表达。

对突变B3662的活细胞显微图的分析表明，宿主细胞在感染该突变体的细胞中发生，比野生型感染细胞早得多。细胞类型发育缺乏衣原体恢复，可能是不可能的，因为这些细胞不能重新感染宿主。基因组广泛关联研究可以在分离后使用，通过统计相关性来识别发育基因，并纳入替代启动者报告。

这种方法可以推广到许多遗传途径的探测中，进入遗传回路机制和其他细胞内病原体的解剖。