激光显微切割技术在揭示人类肾组织区域转录组学中的应用

激光显微切割技术可实现对肾组织样本中特定空间区域进行转录组学分析。这使我们能够获得独特的机会，在疾病诱导的改变发生后仍可识别出感兴趣的结构。该方法的主要优势在于其可与其他组学技术（如单细胞RNA测序）相互补充。

这种方法具有显著的组织节约优势，甚至能够检测到低水平表达的转录本。获取组织样本后，使用设定为零下20摄氏度的冷冻切片机将样本切成12微米厚的切片，并使用载玻片适配器将切片固定在专用的激光显微切割载玻片上。在冷冻切片后的10天内，将89.2微升无RNase的含10% BSA的PBS溶液与4微升FITC标记的鬼笔环肽、1.5微升DAPI、2微升直接偶联Alexa Fluor 546的靶标抗体以及3.3微升RNase抑制剂混合。

将载玻片在 -20 摄氏度的 100% 丙酮中清洗 1 分钟，然后将载玻片放入湿盒中。用新鲜的无 RNase PBS 溶液清洗载玻片表面两次，每次 30 秒，随后用含 10% BSA 的无 RNase PBS 溶液清洗两次，每次 30 秒。最后一次清洗后，在室温下用预先配制的抗体溶液处理样本 5 分钟，然后再次用含 10% BSA 的无 RNase PBS 溶液清洗两次。

第二次洗涤后，在组织培养罩中将载玻片晾干5分钟，然后将其装载到激光显微切割平台上。在装置上安装经过高压灭菌、适用于PCR实验的500微升微量离心收集管，管内预先加入RNA提取试剂盒提供的50微升提取缓冲液。装载完成后，通过染色特征、形态学及位置识别样本中的目标区域。

使用免疫荧光标记至少 500,000 平方微米的目标区域。随后启动激光显微切割，采用高于 40 的激光功率切除该区域。激光显微切割过程完成后，盖上微量离心收集管的管盖，并用力弹击管体，确保管帽内的内容物转移至管底。

离心后，将离心管置于42摄氏度水浴中孵育30分钟，然后再次离心。随后，将上清液转移至从-80摄氏度保存条件下取出的新500微升离心管中。肾脏中肾小管亚节段的鉴定通过特异性肾小管标志物的抗体染色，并结合细胞形态学及结构解剖标志来完成。

荧光标记结合组织形态学特征及图像结构的空间定位，可高置信度地实现肾亚段的可视化。在此代表性下游测序分析中，达到最低解剖区域投入量的成功率超过90%，从而获得足量的总mRNA用于基因检测。在本分析中，100%的样本达到了至少检测出10,000个基因的最低检测阈值。

激光显微切割后，可将已知标志物的基因表达富集分析结果与来自其他区室的结果进行比较。在此分析中，通过激光显微切割区域转录组学鉴定出每个肾单位亚节段的一个标志物，该方法同时获得了相应肾单位亚节段的特异性免疫组织化学染色结果。需要注意的是，激光显微切割技术在很大程度上依赖于操作者准确识别目标结构的能力。

该技术可用于研究特定区域的基因表达特征，进而评估疾病进展中可能涉及的通路，以及健康组织的生物学特性。