胚胎微注射技术，用于在库莱克斯五角星高效位点特异性突变体
2020年5月24日
该协议描述了 Culex五角星胚胎的 微注射程序，这些胚胎通过CRISPR/Cas9基因编辑工具进行优化。该技术可以有效地生成特定地点、遗传的生殖系突变，可用于在这种研究不足的疾病载体中构建遗传技术。
胚胎显微注射技术为许多基于遗传的媒介控制工具的开发铺平了道路。尽管许多昆虫物种已经制定了完善的方案，但 Culex quinquefasciatus 的研究仍然相对不足。该显微注射方案经过专门设计，以适应 Culex quinquefasciatus 的独特生物学特性，包括卵收集、卵筏分离和注射后程序。
这种方法可能适用于任何感兴趣的库蚊物种，并可用于研究基因功能或为库蚊物种生成基于遗传的控制技术。首先将鸡蛋与木筏分开。用镊子或画笔按压木筏，将单个鸡蛋分开。
将鸡蛋放在横跨载玻片顶部的一条薄薄的双面胶带上对齐，努力使每个鸡蛋的前侧指向同一方向。通过将卤代烃试剂与水轻轻混合，并在 25 摄氏度下孵育混合物来制备卤代烃混合物。用卤烃油混合物覆盖对齐的鸡蛋。
要生成用于显微注射的针头，请按照制造商的说明将铝硅酸盐毛细管玻璃放入拔针器中。将热量设置为 560，速度设置为 100，延迟设置为 70，拉力设置为 97，压力设置为 500。然后激活拔针器。
以50 度角轻轻触摸旋转金刚石研磨板上拉出的针尖约 10 秒，使针尖倾斜。将拉动和斜切的针嵌入培养皿中建模师的粘土线条中。准备由基因组修饰试剂组成的注射混合物并将其储存在冰上。
使用微量进样器吸头将两微升注射混合物装入注射针中。将装满的注射针放入与电子显微注射器相连的显微作器中，并将载玻片与对齐的鸡蛋放在复合显微镜的载物台上。使用显微作器，将针头对准胚胎的后端，呈 25 至 35 度角。
小心地将针头插入胚胎中，并以胚胎体积约 10% 的量注入混合物。一次注射 20 个卵子，然后停止并执行胚胎恢复程序。注射后 20 分钟内，用干净的画笔轻轻刷洗鸡蛋，小心地去除鸡蛋上的卤烃油。
用画笔提起鸡蛋，将它们放入一杯双蒸水中，注意将鸡蛋保持在表面。在接下来的 7 天内，每天检查鸡蛋是否孵化，并遵循正常的幼虫饲养程序。使用立体镜筛选注射的蚊子的突变表型。
该方法已用于成功产生对黑眼色素沉着发展至关重要的基因的体细胞和种系突变。通过筛查注射个体瞳孔期眼中色素沉着的丧失，对 CRISPR-Cas9 产生的体细胞突变进行评分。体细胞突变通常以嵌花表型的形式存在，其中部分但不是全部细胞具有突变表型。
种系突变率是通过杂交镶嵌 G 零个体和对完全白眼后代的评分来确定的。这些实验导致胚胎存活率为 64% 至 82%，体细胞诱变率为 37% 至 57%，种系诱变率大于 61%。通过多重 sgRNA 靶向同一基因中的多个基因座，体细胞和种系诱变率提高到 86%此外，许多代以来，白色突变体的活纯合子储液已成功保存在实验室中。
为了优化存活率和诱变率，在尝试显微注射之前，应适当准备所有材料，包括卤烃油、注射液和针头。这将允许更简化和集中的显微注射过程。
概览
本协议概述了适用于美利奴库蚊胚胎的微注射技术，优化用于CRISPR/Cas9基因编辑。它能高效地生成遗传性生殖细胞突变，用于遗传学研究和媒介控制技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因工程
- 媒介生物学
- CRISPR/Cas9技术
背景
- 美利奴库蚊是一个研究不足的疾病媒介。
- 微注射技术对于开发基因控制工具至关重要。
- 其他昆虫物种的现有协议已经很完善。
- 该方法适应了库蚊属物种的独特生物特性。
研究目的
- 开发适用于美利奴库蚊的微注射协议。
- 促进基因功能研究和基因控制技术。
- 优化注射胚胎的存活率和诱变率。
使用的方法
- 卵的收集和帘分离技术。
- 卤代碳油和注射混合物的制备。
- 使用微操纵器进行胚胎的微注射。
- 注射后筛选突变表型。
主要结果
- 实现了64-82%的胚胎存活率。
- 体细胞诱变率在37-57%之间。
- 生殖细胞诱变率超过61%。
- 多重sgRNAs提高了诱变率至86%。
结论
- 该协议成功地产生了体细胞和生殖细胞突变。
- 在实验室中维持了活力的纯合突变体。
- 正确准备材料增强了微注射过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient embryo microinjection enables site-specific mutagenesis in Culex quinquefasciatus, a key vector for diseases such as West Nile virus and lymphatic filariasis. This capability supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by generating heritable mutations for functional gene studies. The protocol addresses species-specific barriers, improving predictive confidence in vector control target identification and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise gene knockout in a disease-relevant insect vector.
- Operational Value: Provides a reproducible method to generate germline mutations for functional validation of targets involved in pathogen transmission.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking gene disruption to phenotypic outcomes critical for vector competence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantifiable mutagenesis readouts (somatic and germline rates) to assess editing efficiency across guide RNA designs.
- Operational Value: Standardizes embryo handling and injection conditions, improving assay reproducibility across experimental batches.
- Scalability: Enables multiplexed sgRNA delivery to increase mutagenesis rates, supporting high-throughput target screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates heritable white-eye mutants to establish stable genetic lines for long-term phenotypic and transmission studies.
- Operational Value: Achieves embryo survival rates of 64–82%, ensuring sufficient viable mutants for downstream phenotypic screening.
- Translational Continuity: Maintains viable homozygous mutant stocks across generations, supporting preclinical evaluation of genetic control strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis to lead identification by enabling functional genomics in an understudied vector species.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis to clarify gene function in pathogen-vector interactions.
- Screening: Delivers quantitative mutagenesis rates (37–57% somatic, >61% germline) to compare guide RNA efficacy and optimize editing conditions.
- Analytics: Enables scoring of mutant phenotypes through stereoscopic screening, providing measurable outputs for hit validation.
- Translational Research: Facilitates continuity from gene discovery to preclinical model development by generating stable mutant lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized microinjection workflow adaptable across Culex species, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling direct genotype-phenotype linkage in a vector-borne disease model.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized egg alignment, halocarbon overlay, and needle preparation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional validation of targets essential for vector survival or pathogen transmission.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on heritable mutation rates and phenotypic severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, micromanipulation, and fluorescent or stereoscopic screening.
- Dependent on needle puller, microinjector, and halocarbon oil preparation for embryo viability.
- Necessitates cross-team standardization of egg collection and raft separation techniques.
- Adaptation across Culex species may require adjustments to injection volume and needle geometry.
- Practical limitations include embryo fragility and the need for immediate post-injection recovery to maintain survival rates.
