单细胞水平细菌种间相互作用的动力学可视化

本方案可实现随时间推移在单细胞水平上对细菌种间相互作用进行可视化和追踪。该技术的主要优势在于其适用于研究细菌相互作用，包括细胞追踪、基因表达分析和活性染色。此外，可通过调整实验条件以研究不同的生物体。

首先，准备琼脂糖垫：将2%低熔点琼脂糖溶于10毫升细菌培养基中，使用洁净的50毫升锥形瓶。将锥形瓶放入微波炉中短时间加热，直至琼脂糖完全溶解，然后置于50°C水浴中冷却至少15分钟。将硅胶切片对准35毫米培养皿的开口，翻转培养皿，并用刮刀轻轻敲击硅胶切片，使其固定在培养皿上并去除任何气泡。

琼脂糖冷却后，用移液器将915微升熔融琼脂糖加入模具中，让凝胶垫自然干燥。在开始实验前至少两小时，将显微镜环境室预热至实验所需温度。通过将无尘擦拭纸紧密卷起，制备湿度擦拭纸。

将卷好的擦拭垫放入无菌培养皿中，并直接向擦拭垫加入500微升无菌水。将擦拭垫、垫片和一个无菌35毫米培养皿置于实验温度下预热，以使所有材料达到温度平衡。待垫片干燥后，用移液器将1微升共培养液均匀地滴加到预先温育过的无菌35毫米玻璃盖玻片培养皿底部。

使用无菌镊子从琼脂糖模具中取出硅胶切块，将其侧向倾斜，并将略微弯曲的刮刀滑入琼脂糖垫片边缘下方，使其落入无菌培养皿盖中。用90度角的刮刀从下方轻轻推动琼脂糖垫片，将其转移至接种了细菌细胞的盖玻片上，垫片底部朝下。用刮刀使垫片与盖玻片完全贴合，并轻轻挤压排出任何气泡。

从湿润的擦拭垫上去除多余的水分，并将其放置在培养皿边缘，确保不接触样本垫。样品现在已准备好进行成像。在接种样本垫之前，通过彩色照明调整所有图像帧，完成显微镜的设置。

接种完成后，使用100倍物镜观察培养皿，并聚焦于细菌的生长结果。在成像软件中点击“相位”（phase）选项，通过选择光源并调节光强百分比滑块，调整DIA LED光源的发射强度；或者，可手动输入曝光时间。

通过右键单击相位通道并选择“分配当前显微镜设置”选项，保存相位通道的设置。如果使用荧光，请选择目标荧光通道并设置发射荧光的百分比，然后按照前述方法调整曝光时间。或者，可通过从下拉菜单中选择其他选项之一来更改位深度，以调节动态范围。

通过右键单击荧光通道并选择“分配当前显微镜设置”选项，保存荧光通道的设置。在XY选项卡中，单击点名称列中的复选框，以保存选定的XY兴趣位置。然后单击该选项卡底部的PFS复选框，以开启完美聚焦系统。

聚焦细胞，然后点击PFS列中的箭头，以保存该XY位置的焦距。对所有其他XY位置重复此操作。按照之前演示的方法，在相位选项卡下保存XY位置的设置。

点击时间选项卡，勾选复选框以选择采集间隔、频率和成像持续时间。然后点击波长选项卡，勾选复选框以选择成像所用的通道及通道间隔频率。设置完成后，点击立即运行以开始延时成像。

与单培养条件下的铜绿假单胞菌细胞相比，在与金黄色葡萄球菌共培养时，铜绿假单胞菌以筏状聚集的形态减少，单细胞运动性增强，并向金黄色葡萄球菌菌落方向迁移。铜绿假单胞菌的单细胞将包围并最终侵入金黄色葡萄球菌菌落。实验过程中湿度过高或过低，以及垫片干燥不当，是导致垫片移位并拖动细胞偏离视野的两个常见问题，从而引起图像漂移。

光漂白和光毒性可导致细胞首先失去荧光，随后停止分裂，最终在后续图像中死亡。初始位置过于接近的细胞可能没有足够时间建立分泌信号的梯度，从而影响其他物种的响应。通过在琼脂糖垫中加入碘化丙啶，可对细菌细胞的活力进行可视化观察。

绿色细胞表示正在活跃表达GFP的活细胞，而红色细胞表示经铜绿假单胞菌无细胞上清液处理后被碘化丙啶染色的死细胞。单个铜绿假单胞菌细胞的运动轨迹从其离开菌筏的帧追踪至其到达金黄色葡萄球菌簇的帧。铜绿假单胞菌菌筏与金黄色葡萄球菌簇之间的距离为欧几里得距离，而总轨迹长度则为累积距离。

每个细胞的定向性通过欧几里得距离与累积距离的比值来计算。野生型铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）朝向野生型金黄色葡萄球菌（S.aureus）运动时的定向性显著高于朝向缺乏agr调控分泌因子的金黄色葡萄球菌（S.Aureus）时的定向性，而这些分泌因子是实现定向运动所必需的。在实施本实验方案时，需注意每位研究人员应根据其地理位置、实验室环境及具体实验条件，优化活体成像中琼脂糖垫的干燥条件。

该技术揭示了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）与金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）之间的相互作用，这些相互作用在此前对它们在大量培养中行为的研究中一直被掩盖，使我们更接近于理解这些微生物在感染过程中如何相互作用。