Name: 单细胞物种间细菌相互作用的动力学可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学习利用琼脂糖垫和延时成像技术可视化单细胞水平的细菌种间相互作用。该方法可追踪铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的动态行为，为研究微生物群落中的细胞运动性和活力提供重要工具。

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本工作获得了囊性纤维化基金会博士后到教职过渡奖 LIMOLI18F5（DHL）、囊性纤维化基金会青年教员招聘奖 LIMOLI19R3（DHL）以及美国国立卫生研究院 T32 培训基金 5T32HL007638-34（ASP）的资助。我们感谢 Jeffrey Meisner、Minsu Kim 和 Ethan Garner 分享了成像和制备垫片的初始实验方案及建议。

注意：本实验方案中所有耗材的完整说明及目录编号均可在材料表中找到。
1. M8T 最小培养基的制备
<ol>
	<li>在2 L瓶中，将64 g Na2HPO4·7H2O、15 g KH2PO4和2.5 g NaCl溶解于800 mL超纯水（UPW，电阻率18 MΩ/cm）中，配制1 L的M8最低盐基础培养基（5倍浓缩液）。调节pH至7.6，用UPW定容至1 L。121°C高压灭菌45分钟。</li>
	<li>在1 L瓶中，将100 g葡萄糖溶解于400 mL UPW中，配制500 mL葡萄糖溶液（20% w/v）。用UPW定容至500 mL。121°C高压灭菌45分钟。</li>
	<li>将100 g胰蛋白胨溶解于400 mL UPW中，配制500 mL胰蛋白胨溶液（20% w/v）。用UPW定容至500 mL。121°C高压灭菌45分钟。</li>
	<li>在600 mL UPW中加入200 mL 5倍浓缩M8最低盐溶液（终浓度1倍）、10 mL 20%葡萄糖溶液（终浓度0.2%）、1 mL 1 M MgSO4（终浓度1 mM）和50 mL 20%胰蛋白胨溶液（终浓度1%），配制1 L M8 + 10%胰蛋白胨（M8T）最低培养基。用UPW定容至1 L，通过0.2 μm无菌滤膜过滤，收集至无菌的500 mL培养基储存瓶中。</li>
</ol>
第1天：
2. 细菌过夜培养物的制备
<ol>
	<li>取单个铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）或金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌落接种于5 mL M8T最低培养基中（根据需要添加抗生素），在37 °C有氧条件下培养过夜，时间不超过16小时。 
	注：本方法选用铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）这两种细菌病原体，因为它们常在慢性感染中共同被分离到，研究它们之间的相互作用对于理解多微生物感染期间对患者预后的影响具有重要意义。根据研究重点的不同，也可选用其他细菌种类。</li>
</ol>
第2天：
3. 细菌菌株的传代培养
<ol>
	<li>将铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）以1:500比例、金黄色葡萄球菌（S. aureus）以1:1000比例接种于5 mL新鲜M8T培养基中（如需要可加入抗生素）。在37 °C条件下振荡培养，直至菌液达到对数中期（OD600 = ~0.3 - 0.5）。</li>
</ol>
4. 准备垫片模具的材料
<ol>
	<li>使用本生灯加热扁平圆形实验刮勺的一端，直至其扁平部分的一半可弯曲成90°角，从而制备金属刮勺。另取一把扁平圆形实验刮勺，用本生灯加热其末端，并将最后10 mm略微弯曲至45 °C角。</li>
	<li>将硅胶模具的四个角剪去，使模具能够放入35 mm培养皿中。</li>
	<li>将刮勺和一对镊子浸入70%乙醇中进行消毒，随后通过本生灯火焰灼烧灭菌。</li>
	<li>用70%乙醇清洁培养皿和硅胶模具，并用无绒布擦干。</li>
</ol>
5. 琼脂糖垫的制备
注意：本实验中使用的垫片以M8T最低培养基作为该方案所用细菌的营养来源。然而，可根据不同生物体的需求调整垫片中的营养成分。
<ol>
	<li>在洁净的 50 mL 锥形瓶中，将 2% 低熔点琼脂糖溶于 10 mL M8T 溶液中。使用微波炉以短时间间隔（2–5 秒）加热，直至琼脂糖完全溶解，避免瓶内液体沸腾溢出。溶解后，置于 50 °C 水浴中冷却至少 15 分钟。</li>
	<li>通过将硅胶模具切口与 35 mm 培养皿的开口对齐来准备模具，并用刮刀轻轻敲击，使硅胶牢固贴合培养皿，并排除模具与培养皿之间的所有气泡。</li>
	<li>冷却后，用移液器将 915 µL 熔融琼脂糖加入模具中。将皿盖略微打开，室温下干燥 30 分钟。</li>
	<li>用盖子盖好培养皿，再于室温下静置 2 小时。</li>
	<li>将无尘擦拭纸紧密卷起，制备湿度擦拭条。将卷好的擦拭纸放入无菌培养皿中，并均匀滴加 500 µL 无菌水至擦拭纸上。于 37 °C 温育 1 小时。</li>
	<li>将琼脂糖垫和无菌 35 mm 培养皿于 37 °C 预热 1 小时。</li>
</ol>
6. 细菌细胞的制备与接种垫的接种
<ol>
	<li>测定每个亚培养物的OD600，并将P. aeruginosa用预热至37 °C的M8T培养基稀释至OD600 = 0.03，将S. aureus稀释至OD600 = 0.10。将P. aeruginosa和S. aureus按1:1比例混合，并涡旋振荡。 
	注意：如果菌株需要抗生素，可在过夜培养和亚培养中添加抗生素，但在为成像而混合菌种时不应添加，以防影响共培养中的其他菌种。每种使用中的生物体/质粒均需确定质粒稳定性及抗生素对共培养中所有菌种的影响。</li>
	<li>用移液器将1 µL共培养液均匀滴加到预热的无菌35 mm玻璃盖玻片培养皿底部。</li>
	<li>使用无菌镊子从模具中取出硅胶切片。</li>
	<li>使用无菌刮铲从培养皿中取出凝胶垫。
	<ol>
		<li>将略微弯曲的刮铲插入凝胶垫边缘下方，同时将模具倒置，使其落入无菌培养皿盖上。 
		注意：切勿强行推出凝胶垫，以免撕裂。注意记录凝胶垫的底面朝向。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用90°角刮铲将凝胶垫底面朝下转移至含有细菌细胞的培养皿中，将其滑至接种好的盖玻片上方。使用90°角刮铲使凝胶垫与盖玻片完全贴合，并轻轻压出任何气泡。</li>
	<li>将湿润擦拭纸上的多余水分去除后，放置于培养皿边缘周围，确保不接触凝胶垫。样品现在可用于成像。</li>
</ol>
7. 为活体成像设置显微镜
<ol>
	<li>在实验设置前至少2小时，将环境培养箱预热至37 °C。</li>
	<li>打开所有组件，包括显微镜、计算机以及明场和荧光成像的光源。</li>
	<li>启动成像软件，并确保光源已连接并正常运行。</li>
	<li>进行科勒照明27&#160;以对齐所有成像平面。
	<ol>
		<li>首先使用20倍物镜和“假”培养皿将标记的盖玻片调至焦点。确保聚光镜转盘处于“打开”位置。 
		注意：应对每个独特的物镜/样品执行科勒照明，以正确对齐成像平面。然而，使用低倍镜在“假”培养皿上进行调焦和对齐，可加快高倍镜下活体样品的设置过程，从而缩短设置与实验开始之间的时间。</li>
		<li>聚焦聚光镜。
		<ol>
			<li>关闭视场光阑。 
			注意：应出现一个八边形光圈。如果聚光镜完全失焦，整个视野（FOV）将变暗。</li>
			<li>旋转聚光镜调焦旋钮，直至八边形边缘清晰锐利。 
			注意：随着成像平面向正确对齐位置接近，光强将增加。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对齐聚光镜。
		<ol>
			<li>通过调节对中旋钮使视场光阑居中。 
			注意：八边形应位于视野中心。不同显微镜的对中旋钮可能不同。例如，某些显微镜聚光镜配有旋钮，而其他则使用需要螺丝刀的螺丝。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>聚焦灯丝并调节聚光镜孔径。
		<ol>
			<li>将相位望远镜或伯特兰透镜插入光路，以观察物镜的后焦平面。 
			注意：应看到两个同心圆。</li>
			<li>旋转伯特兰透镜的调焦旋钮，直至环状结构清晰锐利。</li>
			<li>将伯特兰透镜从光路中移除。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>打开视场光阑，直到八边形刚好位于视野之外。</li>
		<li>切换至100倍物镜，在加入一滴浸油前将匹配的相位环滑入位，并将准备好的样品皿置于其上。</li>
		<li>使用含细菌样品的培养皿，在100倍物镜下进行科勒照明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仅使用微调旋钮对细菌进行聚焦。一旦通过目镜观察到视野中的细菌清晰成像，按下显微镜上的相机按钮，将光路切换至相机。</li>
	<li>在成像软件中点击相位选项。</li>
	<li>通过在软件中选择光源，并手动输入所需光强百分比或拖动光强百分比标尺上的滑块，调节DIA LED光源发射的光强百分比。</li>
	<li>通过点击光源并手动输入所需曝光时间，或从提供的下拉菜单中选择曝光时间，调节DIA LED光源的曝光时间。 
	注意：曝光时间将根据所使用的相机而有所不同。</li>
	<li>若使用荧光成像，通过点击感兴趣的荧光通道（如TxRed、GFP），在每个相应通道中调整相机设置。
	<ol>
		<li>设定荧光光源发射的百分比，然后调节曝光时间（操作方式同步骤7.7和7.8中DIA LED光源的设置）。</li>
		<li>或者，在可视化控制的下拉菜单中选择其他位深选项，以改变动态范围。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在采集控制菜单中点击XY选项，选择感兴趣的XY位置。
	<ol>
		<li>使用操纵杆移动载物台位置，或通过在屏幕上点击并拖动视野，点击空白框以保存特定位置的X和Y坐标。 
		注意：建议为延时成像选择不超过三个、尽可能靠近的XY位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在采集控制菜单的XY选项卡中点击PFS复选框，或按下操纵杆控制面板上的PFS按钮，开启完美聚焦系统（PFS）。</li>
	<li>旋转微调旋钮，对细菌细胞进行聚焦。</li>
	<li>当细胞处于所需焦平面时，为每个XY位置点击一次PFS按钮。 
	注意：PFS可在延时实验期间补偿Z轴漂移，这对于长时间维持细菌细胞的聚焦至关重要。不同制造商具有不同的补偿系统。</li>
	<li>在采集控制菜单中选择各通道（如相位对比和各荧光染料）的图像采集条件，包括采集间隔和频率。 
	注意：本研究所展示的实验中，相位对比图像每5-10秒采集一次，而GFP和TxRed通道的荧光图像每20分钟采集一次。</li>
	<li>在显微镜和采集参数设置完成后，开始成像。</li>
</ol>
8. 可选：活细胞/死细胞成像的改进方法
<ol>
	<li>将2%琼脂糖溶于10 mL M8T中，然后在50 °C水浴中冷却至少15分钟。</li>
	<li>向熔化的琼脂糖中加入1 mM碘化丙啶。</li>
	<li>冷却后，用移液器将915 μL琼脂糖加入已准备好的模具中。</li>
	<li>将盖子略微打开，室温下避光干燥30分钟。</li>
	<li>用盖子盖好培养皿，再于室温下放置2小时。</li>
	<li>制备保湿纸巾。
	<ol>
		<li>将无尘纸紧密卷起。</li>
		<li>将纸巾放入无菌培养皿中，并加入500 µL无菌水润湿纸巾。</li>
		<li>在37 °C下孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将琼脂垫和一个无菌的35 mm培养皿在37 °C下孵育1小时。</li>
	<li>按照第6节“细菌细胞的制备与接种琼脂垫”中的说明进行培养皿的接种。</li>
</ol>
9. 数据分析
<ol>
	<li>细胞鉴定
	<ol>
		<li>在成像软件中打开图像文件，并将文件裁剪为仅包含用于追踪的帧，放大至目标细胞区域，并仅保留相差通道。 
		注意：裁剪后的文件可另存为新文件，以便存储追踪数据，而不影响原始文件。</li>
		<li>在分析控制菜单中选择“选择感兴趣区域（ROI）”选项，并在用于分析的第一帧中，通过勾画单个细菌细胞或细胞簇来定义ROI。 
		注意：ROI可手动定义，也可通过二值化方式定义。
		<ol>
			<li>手动定义ROI
			<ol>
				<li>勾画每个单独的细菌细胞或细胞簇的轮廓，以手动定义ROI。 
				注意：在分析软件中，P. aeruginosa 或其他杆状细胞可通过选择椭圆 ROI工具，并绘制与细菌细胞大小相匹配的椭圆来手动勾画。或者，可选择多边形 ROI工具来勾画非传统形状的ROI，例如细胞簇。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>识别二值化ROI
			<ol>
				<li>点击分析控制菜单中的二值转ROI选项，以定义二值化ROI。 
				注意：在相差通道中，通过将像素较暗的细菌细胞与像素较亮的背景分离，可在二值图层中定义对象。</li>
				<li>为对细胞进行阈值分割，请在分析控制菜单中选择阈值选项。选择目标通道，并调节荧光直方图中的滑块以调整阈值区间。 
				注意：通过阈值分割细菌细胞，也可在荧光图像中定义用于ROI的二值化对象。阈值设定用于确定哪些荧光&#160;强度被视为对象，哪些荧光强度属于背景。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞追踪
	<ol>
		<li>为手动追踪ROI，请选择成像序列中的下一帧，并通过点击并拖动每个ROI，将其位置调整至原始细菌细胞的新位置。 
		注意：若细菌细胞未发生位移，则无需移动ROI。</li>
		<li>在所有需追踪细胞的连续帧中重复此操作。</li>
		<li>当细胞分裂时，按照步骤9.1所述方法将子代细胞定义为新的ROI，并开始追踪新分裂的细胞。 
		注意：若细胞以二值化方式识别，可使用追踪二值化对象功能在选定帧中自动追踪ROI。</li>
		<li>完成所有选定帧的细胞追踪后，导出数据以供分析。</li>
		<li>打开数据表格，确定分析所需的测量参数（例如，对象速度、加速度或路径长度）。 
		注意：若需测量定向性，需获取“路径长度”和“直线长度”两个参数。“直线长度”表示欧几里得距离，即从轨迹起点到S. aureus菌落边缘的直线距离；“路径长度”表示累积距离，即所有帧中轨迹线段的总和。定向性可通过欧几里得距离D(E)（直线长度）与累积距离D(A)（路径长度）的比值计算得出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光定量
	<ol>
		<li>按照步骤9.1所述方法，为荧光标记的细菌细胞定义ROI。</li>
		<li>在其余荧光图像帧中，重复对细菌细胞或细胞簇的勾画或ROI移动操作。</li>
		<li>将生成的数据表导出为电子表格文件，用于荧光强度分析。</li>
		<li>在数据表格中查找“平均强度”列，该列代表所勾画细菌细胞ROI的平均荧光强度。</li>
		<li>绘制平均强度值的变化曲线，以观察荧光随时间的变化情况。 
		注意：荧光随时间的变化反映了所标记目标基因的基因表达波动情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+analysis+of+Vibrio+parahaemolyticus+variants+in+high-+and+low-+viscosity+microenvironments+by+use+of+digital+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing.</a> Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).</li>
<li>Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+diffusion+coefficients+in+biofilms+by+confocal+laser+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).</li>
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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

本文介绍的方法描述了一种在单细胞水平上对细菌物种相互作用进行活细胞成像的实验方案，并针对其他应用（包括细胞追踪和细胞活力监测）进行了相应优化。该方法为研究微生物在共培养条件下随时间变化的单细胞行为开辟了新的途径。具体而言，该方案展示了这种共培养方法在观察细菌表面行为方面的实用性，尤其适用于研究同时具有表面相关和液体中运动附属结构的微生物。例如，通过将细菌运动限制在单一焦平面的表面上，可以清晰地观察到P. aeruginosa在响应S. aureus时由菌毛介导的增强且具有方向性的运动行为。
如前所述，要在此成像方法中获得最佳结果，需考虑若干条件，包括样品及成像仪器（即物镜和载物台）的温度与湿度。有关更多提示和故障排除方法，请参见补充文件1。成功应用本实验方案的关键步骤之一是琼脂糖垫的制备，因为干燥不充分是最常见的问题之一。如图3A所示，若琼脂糖垫干燥时间不足，在延时成像初期会出现漂移现象；而干燥时间过长的垫片则会开始收缩，导致细胞在成像数小时后漂出视野（...

多微生物群落很常见&#160;在自然界中，跨越多种环境1,2,3 以及人类生态位4,5一些最著名的人类疾病中的多微生物感染包括牙科生物膜6慢性伤口7,8慢性阻塞性肺疾病患者中的呼吸道感染9呼吸机相关性肺炎10，以及遗传病囊性纤维化（CF）11,12这些感染通常由多种多样的微生物物种组成；然而，近期研究主要关注革兰氏阳性菌之间的相互作用 金黄色葡萄球菌 革兰氏阴性细菌 铜绿假单胞菌 已出现。包括这些病原体共感染患者的多项研究 体外 分析揭示了竞争性和协作性相互作用，这些作用可能对疾病进展、微生物存活、毒力、代谢以及对抗生素的敏感性产生深远且出乎意料的影响（详见 Hotterbeekx 等，2017 年综述）13 和 Limoli 与 Hoffman，20193).
人们对感染过程中种间相互作用的兴趣日益增长，由此发展出多种研究多微生物群落行为的方法。通常，这些研究采用基于平板或液体培养基的实验方法，来探究单一种群培养与共培养之间的表型差异。例如，在固体表面共培养P. aeruginosa和S. aureus，可观察到生长抑制现象，或菌落表型、色素及多糖产生等方面的变化14,15,16。在生物或非生物表面形成的混合物种生物膜，以及在液体培养基中进行的细菌共培养，也使得研究人员能够测量生长、代谢、抗生素耐受性、竞争关系和存活能力等方面的变化，同时还能分析基因和蛋白的表达情况17,18。尽管这些整体培养实验揭示了P. aeruginosa与S. aureus在群落尺度上可能如何相互影响，但它们无法回答有关单细胞水平上相互作用的关键问题。本文所介绍的方法通过聚焦于共培养群落中单个细胞随时间推移在运动性、细胞活力以及基因表达方面的变化，进一步丰富了研究种间相互作用的技术手段。
单个细胞之间的相互作用可能与大量细胞群体中的相互作用存在显著差异。通过单细胞分析，可以量化细胞群体内的异质性，以研究细胞的空间位置如何影响群落动态，或群体中各个成员的基因和蛋白表达水平如何变化。对细胞进行追踪还能揭示单个细胞在多个世代中的运动方式和行为特征。通过同时追踪细胞的运动及其基因表达的变化，可以建立基因波动与相应表型之间的关联。已有文献描述了在单细胞水平研究单一细菌物种的实验方案。这些研究利用随时间推移的活细胞成像技术，在单一焦平面上进行观察，有助于研究细胞分裂和对抗生素的敏感性等表型19,20。此外，还应用了其他活体成像显微技术来监测单一细菌物种的生长、运动性、表面定植以及生物膜形成过程21,22,23。然而，尽管这些研究加深了人们对单一种类细菌生理特性的理解，但针对共培养条件下多种细菌物种随时间变化的单细胞行为的实验仍较为有限。
本文对先前用于单物种成像的实验方案进行了改进，以研究铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）与金黄色葡萄球菌（S. aureus）之间的相互作用。这两种微生物可根据其细胞形态在相差显微镜下加以区分（P. aeruginosa 为杆菌&#160;，而 S. aureus 为球菌）。该方法的建立使得研究人员最近能够观察到在 S. aureus 存在条件下 P. aeruginosa 以往未被描述的运动行为24。P. aeruginosa 被发现能够远距离感知 S. aureus，并表现出增强的、定向的单细胞运动，朝向 S. aureus 细胞簇移动。研究表明，P. aeruginosa 向 S. aureus 的运动依赖于IV型菌毛（TFP），这是一种毛发状结构，通过协调的伸展与回缩产生一种称为“抽搐运动”的移动方式25。
这些研究证明了该方法在探究物种间早期相互作用方面的实用性。然而，在较高的细胞密度和较晚的相互作用时间点进行成像较为困难，因为此时已无法识别单层细胞，这主要给成像后的分析带来挑战。鉴于这一局限性，该方法最适合用于研究早期相互作用，随后可通过传统的宏观检测方法在代表后期相互作用的较高细胞密度条件下进行后续验证。该方法的其他局限性还包括通量较低，因为每次只能对一个样本进行成像，以及显微镜、相机和环境培养室的成本较高。此外，荧光显微成像可能对细菌细胞造成光毒性与荧光淬灭等风险，因此限制了荧光图像的采集频率。最后，该方法所使用的琼脂糖垫对环境变化极为敏感，因此必须严格控制温度和湿度等条件，否则琼脂糖垫可能发生收缩或膨胀。尽管该方法并不能模拟宿主环境，但它为研究不同细菌物种在表面的响应行为提供了线索，这些线索可在后续设计用于模拟环境或宿主条件的实验中进一步验证。
该方法与以往追踪单细胞运动的研究不同，其将细胞接种于盖玻片与琼脂糖垫之间，使细胞被限制在表面。这使得能够在单一焦平面上对细胞进行长时间追踪；然而，该方法限制了在液体中浸没时所观察到的细胞短暂接触表面的周期性行为26。在琼脂糖垫下对细菌进行成像的另一个优势在于，其模拟了经典的宏观平板基底下的接种检测方法，后者常用于研究P. aeruginosa的抽搐运动能力25。在此类检测中，细菌细胞被接种于培养皿底部与琼脂之间，细胞在移动过程中被限制于单一平面，从接种点向外沿皿底扩散，这与本显微镜实验方案非常相似。
本文所展示的用于观察物种间相互作用的延时显微镜实验方案包括以下步骤：1）制备细菌样品和琼脂糖垫，2）选择显微成像的显微镜设置，以及3）成像后的分析。通过相差显微镜以较短的时间间隔连续采集图像，可实现对细胞运动的详细可视化及细胞轨迹追踪。此外，荧光显微镜可用于随时间监测细胞活力或基因表达情况。本文以在琼脂糖垫中添加细胞活力染料为例，展示了一种适用于荧光显微镜的实验改进方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;琼脂糖垫&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿，带 20 mm 微孔，#1.5 盖玻片</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>一个用于琼脂糖垫模具，一个用于实验</td></tr><tr><td>KimWipes 擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Nu-Sieve GTG/Lonza</td><td>50081</td><td>用于制备琼脂糖垫</td></tr><tr><td>圆底刮刀</td><td>VWR</td><td>82027-492</td><td></td></tr><tr><td>圆锥形刮刀</td><td>VWR</td><td>82027-530</td><td></td></tr><tr><td>硅胶隔离器，按压密封，单孔，直径 D 2.0 mm × 20 mm，硅胶/粘合剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6685-25EA</td><td>用于琼脂糖垫模具</td></tr><tr><td>无菌培养皿，85 mm</td><td>Kord-Valmark / 由 RPI 销售</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>VWR</td><td>89259-944</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;M8T 最小培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D (+) 葡萄糖</td><td>RPI</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>RPI</td><td>P250500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0123173</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor Sona 4.2B-11</td><td>Andor</td><td>77026135</td><td>相机，420 万像素背照式 sCMOS，11 &amp;mu;m 像素，95% 量子效率，48 帧/秒，USB 3.0，F 接口</td></tr><tr><td>滤光立方体 GFP</td><td>Nikon</td><td>96372</td><td>滤光立方体</td></tr><tr><td>滤光立方体 TxRed</td><td>Nikon</td><td>96375</td><td>滤光立方体</td></tr><tr><td>H201-NIKON-TI-S-ER</td><td>Okolab</td><td>77057447</td><td>载物台培养箱</td></tr><tr><td>Nikon NIS-Elements AR 配备 GA3 以及 2D 和 3D 跟踪功能</td><td>Nikon</td><td>77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950</td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>Nikon Ti2 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>Model Ti2-E</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo &amp;#411;20x 物镜 (0.75NA)</td><td>Nikon</td><td>MRD00205</td><td>物镜</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo &amp;#411;100x 油镜 Ph3 DM 物镜 (1.45NA)</td><td>Nikon</td><td>MRD31905</td><td>物镜</td></tr><tr><td>ThermoBox 带内置风扇加热器</td><td>Tokai Hit</td><td>TI2TB-E-BK</td><td>封闭装置</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细菌菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; PA14 (WT)</td><td></td><td>PMID: 7604262</td><td>非黏液型原养型</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; PA14 (WT) pSMC21 (&lt;em&gt;Ptac-GFP&lt;/em&gt;)</td><td></td><td>PMID: 9361441</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; PAO1 (WT) p&lt;em&gt;PrpoD-mKate2&lt;/em&gt;</td><td></td><td>PMID: 26041805</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt; USA300 LAC (WT)</td><td></td><td>PMID: 23404398</td><td>USA300 CA-耐甲氧西林菌株 LAC，无质粒</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt; USA300 LAC (WT) pCM29 (&lt;em&gt;sarAP1-sGFP&lt;/em&gt;)</td><td></td><td>PMID: 20829608</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt; USA300 LAC &amp;#916;&lt;em&gt;agrBDCA&lt;/em&gt;</td><td></td><td>PMID: 31713513</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;活率染色剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td>LIVE/DEAD&amp;trade; BacLight&amp;trade; 细菌活率检测试剂盒</td></tr></tbody></table>

单细胞水平细菌种间相互作用的动力学可视化

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

多微生物群落普遍存在于自然界中，但在单细胞水平上研究它们的相互作用却十分困难。因此，已开发出一种基于显微镜的方法，用于观察两种细菌病原体之间的种间相互作用。本文展示了该方法用于研究一种可运动的革兰氏阴性病原菌Pseudomonas aeruginosa与一种非运动性革兰氏阳性病原菌Staphylococcus aureus之间相互作用的应用。该实验方案包括将两种菌共同接种于盖玻片与琼脂糖垫之间，使细胞保持在单一焦平面上，从而实现对细菌在空间和时间维度上的行为进行可视化观察。
此外，本文展示的时间序列显微镜技术非常适合观察两种或多种细菌物种之间发生的早期相互作用，包括单一种类培养以及与其他物种共培养条件下细菌运动性的变化。由于显微镜装置中样品空间有限，当细胞群体数量过高时，该方案在研究细菌物种间后期相互作用方面的适用性较低。然而，该方案具有多种不同的应用，包括使用染色方法对活菌和死菌细胞进行成像、通过荧光报告系统定量基因或蛋白表达水平，以及在单物种和多物种实验中追踪细菌细胞的运动。

成功应用所述方法将获得一系列帧，这些帧可生成一段视频，用于随时间观察物种间的相互作用。示意图中 图1 展示了成像材料制备过程中关键步骤的可视化方法。该方法的应用使得能够演示 P. aeruginosa 单培养与共培养条件下表现出不同行为的细胞 S. aureus. 与……相比 P. aeruginosa 单培养中保持成筏状聚集的细胞，在与共培养时 S. aureus, P. aeruginosa 增强了单细胞向特定方向的运动能力 S. aureus 菌落（图 2A-2B）。荧光标记的细菌菌株还可用于观察细菌物种的混合群体。使用GFP标记的 P. aeruginosa 允许观察到在之后 P. aeruginosa 单个细胞的运动性增强，它们将包围并最终侵入 S. aureus 菌落（图 ...

该活细菌细胞成像方案可实现随时间推移在单细胞水平上可视化多种细菌物种之间的相互作用。通过延时成像，可观察每种细菌在单培养或共培养条件下的行为，从而研究多物种细菌群落中的种间相互作用，包括单个细胞的运动性和存活能力。

多微生物群落普遍存在于自然界中，但在单细胞水平上研究它们的相互作用具有挑战性。因此，需要一种基于显微镜的方法……

本方案可实现随时间推移在单细胞水平上对细菌种间相互作用进行可视化和追踪。该技术的主要优势在于其适用于研究细菌相互作用，包括细胞追踪、基因表达分析和活性染色。此外，可通过调整实验条件以研究不同的生物体。首先，准备琼脂糖垫：将2%低熔点琼脂糖溶于10毫升细菌培养基中，使用洁净的50毫升锥形瓶。将锥形瓶放入微波炉中短时间加热，直至琼脂糖完全溶解，然后置于50°C水浴中冷却至少15分钟。将硅胶切片对准35毫米培养皿的开口，翻转培养皿，并用刮刀轻轻敲击硅胶切片，使其固定在培养皿上并去除任何气泡。琼脂糖冷却后，用移液器将915微升熔融琼脂糖加入模具中，让凝胶垫自然干燥。在开始实验前至少两小时，将显微镜环境室预热至实验所需温度。通过将无尘擦拭纸紧密卷起，制备湿度擦拭纸。将卷好的擦拭垫放入无菌培养皿中，并直接向擦拭垫加入500微升无菌水。将擦拭垫、垫片和一个无菌35毫米培养皿置于实验温度下预热，以使所有材料达到温度平衡。待垫片干燥后，用移液器将1微升共培养液均匀地滴加到预先温育过的无菌35毫米玻璃盖玻片培养皿底部。使用无菌镊子从琼脂糖模具中取出硅胶切块，将其侧向倾斜，并将略微弯曲的刮刀滑入琼脂糖垫片边缘下方，使其落入无菌培养皿盖中。用90度角的刮刀从下方轻轻推动琼脂糖垫片，将其转移至接种了细菌细胞的盖玻片上，垫片底部朝下。用刮刀使垫片与盖玻片完全贴合，并轻轻挤压排出任何气泡。从湿润的擦拭垫上去除多余的水分，并将其放置在培养皿边缘，确保不接触样本垫。样品现在已准备好进行成像。在接种样本垫之前，通过彩色照明调整所有图像帧，完成显微镜的设置。接种完成后，使用100倍物镜观察培养皿，并聚焦于细菌的生长结果。在成像软件中点击“相位”（phase）选项，通过选择光源并调节光强百分比滑块，调整DIA LED光源的发射强度；或者，可手动输入曝光时间。通过右键单击相位通道并选择“分配当前显微镜设置”选项，保存相位通道的设置。如果使用荧光，请选择目标荧光通道并设置发射荧光的百分比，然后按照前述方法调整曝光时间。或者，可通过从下拉菜单中选择其他选项之一来更改位深度，以调节动态范围。通过右键单击荧光通道并选择“分配当前显微镜设置”选项，保存荧光通道的设置。在XY选项卡中，单击点名称列中的复选框，以保存选定的XY兴趣位置。然后单击该选项卡底部的PFS复选框，以开启完美聚焦系统。聚焦细胞，然后点击PFS列中的箭头，以保存该XY位置的焦距。对所有其他XY位置重复此操作。按照之前演示的方法，在相位选项卡下保存XY位置的设置。点击时间选项卡，勾选复选框以选择采集间隔、频率和成像持续时间。然后点击波长选项卡，勾选复选框以选择成像所用的通道及通道间隔频率。设置完成后，点击立即运行以开始延时成像。与单培养条件下的铜绿假单胞菌细胞相比，在与金黄色葡萄球菌共培养时，铜绿假单胞菌以筏状聚集的形态减少，单细胞运动性增强，并向金黄色葡萄球菌菌落方向迁移。铜绿假单胞菌的单细胞将包围并最终侵入金黄色葡萄球菌菌落。实验过程中湿度过高或过低，以及垫片干燥不当，是导致垫片移位并拖动细胞偏离视野的两个常见问题，从而引起图像漂移。光漂白和光毒性可导致细胞首先失去荧光，随后停止分裂，最终在后续图像中死亡。初始位置过于接近的细胞可能没有足够时间建立分泌信号的梯度，从而影响其他物种的响应。通过在琼脂糖垫中加入碘化丙啶，可对细菌细胞的活力进行可视化观察。绿色细胞表示正在活跃表达GFP的活细胞，而红色细胞表示经铜绿假单胞菌无细胞上清液处理后被碘化丙啶染色的死细胞。单个铜绿假单胞菌细胞的运动轨迹从其离开菌筏的帧追踪至其到达金黄色葡萄球菌簇的帧。铜绿假单胞菌菌筏与金黄色葡萄球菌簇之间的距离为欧几里得距离，而总轨迹长度则为累积距离。每个细胞的定向性通过欧几里得距离与累积距离的比值来计算。野生型铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）朝向野生型金黄色葡萄球菌（S.aureus）运动时的定向性显著高于朝向缺乏agr调控分泌因子的金黄色葡萄球菌（S.Aureus）时的定向性，而这些分泌因子是实现定向运动所必需的。在实施本实验方案时，需注意每位研究人员应根据其地理位置、实验室环境及具体实验条件，优化活体成像中琼脂糖垫的干燥条件。该技术揭示了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）与金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）之间的相互作用，这些相互作用在此前对它们在大量培养中行为的研究中一直被掩盖，使我们更接近于理解这些微生物在感染过程中如何相互作用。

kinetic-visualization-single-cell-interspecies-bacterial

Research

科研

JoVE Journal

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