单细胞物种间细菌相互作用的动力学可视化
August 5th, 2020
这种活细菌细胞成像协议允许可视化多个细菌物种之间在一段时间的单细胞水平相互作用。延时成像允许在单一培养或联合培养中观察每个细菌物种，以询问多物种细菌群落中的外来物种相互作用，包括单个细胞的动性与生存能力。
该协议允许可视化和跟踪物种间细菌相互作用在单个细胞水平随着时间的推移。这种技术的主要优点是它适用于研究细菌相互作用，包括细胞跟踪，基因表达和生存能力染色。此外，条件可以修改，以研究不同的生物体。
首先，在干净的50毫升Erlenmeyer烧瓶中，将2%的低熔黄糖融化在10毫升的细菌生长介质中，准备阿加罗斯垫。短间隔微波烧瓶，直到黄糖在溶液中，然后让它在50摄氏度的水浴中冷却至少15分钟。将切口的硅与 35 毫米盘的开口对齐，然后翻转盘子，然后用铲子轻轻敲击切出的硅，将其固定到盘子上，并清除任何气泡。
一旦阿加罗斯冷却，移液器915微升的熔融加糖进入模具，让垫干燥。在建立实验前至少两小时将显微镜环境室加热到实验温度。通过紧密卷起无绒湿巾来准备湿度湿巾。
将卷拭子放在无菌培养皿内，并将 500 微升无菌水直接添加到湿巾中。将湿巾、垫和无菌 35 毫米的盘子加热到实验温度，以便平衡所有材料。一旦垫干燥，移液器一微升共培养均匀地穿过预热无菌 35 毫米玻璃盖盘的底部。
使用无菌钳子从 agarose 模具中取出硅胶，将其倾斜到侧面，并在 agarose 垫边缘下滑动一根稍微弯曲的铲子，将其放到无菌培养板盖上。将垫转移到盘子，将细菌细胞底部向下滑动一个90度角铲在垫下，并把它放在接种盖滑的顶部。使用铲使垫在盖上滑动，然后轻轻压出任何气泡。
去除湿巾中多余的水分，并将其放在盘子边缘，确保它不会接触垫。该示例现已准备好进行成像。在接种焊盘之前，通过执行颜色照明来对齐所有图像帧来设置显微镜。
接种的菜准备好后，查看100倍目标，并专注于细菌结果。单击成像软件中的相位选项，通过选择光源并在光百分比刻度上滑动条形来调整 DIA LED 光发出的百分比。或者，手动输入曝光时间。
右键单击相位通道并选择"分配当前显微镜设置"选项，以保存相位通道的设置。如果使用荧光，请选择感兴趣的荧光通道并设置发出的荧光光的百分比，然后按前面所述调整曝光时间。或者，通过选择下拉菜单中的其他选项之一来更改出价深度以调整动态范围。
右键单击荧光通道并选择"分配电流显微镜设置"选项，保存荧光通道的设置。在"XY"选项卡中，单击点名称列中的框以保存所选的 XY 感兴趣位置。然后单击选项卡底部的 PFS 框以打开完美的对焦系统。
聚焦单元格并单击 PFS 列中的箭头以保存 XY 位置的焦点。对所有其他 XY 位置重复此过程。如前所述，将 XY 位置的设置保存在相位选项卡下。
单击时间选项卡并选中该框以选择采集间隔、频率和成像持续时间。然后单击波长选项卡并选中该框以选择要用于成像和通道间隔频率的通道。使用设置进行钓鱼时，单击"立即运行"以启动时间推移成像。
与单培养中的P.aeruginosa细胞相比，P.aeruginosa与S.aureus联合培养时仍分组在木筏中，P.aeruginosa增加了单细胞对S.aureus菌落的活力。P.aeruginosa 单细胞将包围并最终入侵S.aureus菌落。实验期间湿度过重或过小以及干燥垫不正确是导致垫移和将细胞拖出视野的两个常见问题。
照片漂白和照片毒性可导致细胞首先失去荧光，然后停止分裂，并最终在随后的帧中死亡。最初距离太近的细胞可能没有足够的时间建立其他物种可以响应的分泌信号梯度。细菌细胞的生存能力可以通过在糖垫中加入碘化丙二来可视化。
绿色细胞表示活细胞积极表达GP，而红细胞表示死丙碘化染色细胞后，治疗与P.aeruginosa细胞自由上经剂。单个P.aeruginosa细胞的运动从细胞离开木筏的框架中跟踪，通过细胞到达S.aureus聚类的框架。P.aeruginosa木筏和S.aureus星团之间的距离提供欧几里德距离，而总轨道长度提供累积距离。
每个单元格的定向度计算为欧氏距离与累积距离的比率。野生类型P.aeruginosa向野生类型S.aureus移动，其定向性明显高于S.aureus，缺乏对定向运动所必需的调节分泌因子。在尝试此协议时，必须记住，每个研究者都需要根据地理位置、实验室环境及其特定实验，优化现场成像中干燥红糖垫的条件。
这项技术揭示了伪多莫纳斯亚鲁吉诺萨和金黄色葡萄球菌之间的相互作用，以前在我们调查它们在散装培养中的行为时被掩盖，使我们更接近于了解这些生物体在感染期间是如何相互作用的。
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概述
该协议允许对单细胞水平上的种间细菌相互作用随时间进行可视化和跟踪。时间跨度成像使得能够在单培养和共培养环境中观察个体细菌物种。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 理解细菌相互作用对于研究微生物群落至关重要。
- 单细胞成像提供了细胞运动性和活力的洞见。
- 该方法可以适应各种细菌物种。
- 时间跨度成像增强了动态相互作用的分析。
研究目的
- 可视化细菌之间的种间相互作用。
- 随时间跟踪个体细菌细胞。
- 评估不同条件下的细胞活力和运动性。
使用的方法
- 为细菌培养准备琼脂垫。
- 微波融化生长培养基中的低熔点琼脂。
- 冷却琼脂并对准硅切割物以进行成像。
- 使用时间跨度成像来观察细菌相互作用。
主要结果
- 成功可视化单细胞水平上的细菌相互作用。
- 观察了在各种条件下的细胞运动性和活力。
- 洞见了细菌群落中的种间动态。
- 该方法对不同细菌物种的适应性。
结论
- 该协议对于研究细菌相互作用是有效的。
- 时间跨度成像提供了关于细胞行为的宝贵数据。
- 未来的应用可能包括多种细菌物种和条件。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of interspecies bacterial interactions at single-cell resolution, supporting mechanistic de-risking in antimicrobial target validation. By capturing dynamic motility and invasion behaviors in co-culture, it provides predictive confidence for early-stage therapeutic hypothesis testing. The method’s adaptability to different pathogens enhances translational continuity in infectious disease research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing pathogen-specific motility changes in response to interspecies signaling.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of invasion behaviors dependent on virulence factor expression.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying directed cell movement as a functional readout of pathway activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible co-culture conditions.
- Operational Value: Standardizes assay readiness through controlled agarose pad preparation and environmental equilibration.
- Scalability: Supports platform reuse across bacterial species with modifiable growth media and staining conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects early discovery observations to preclinical viability assessment via live/dead staining with propidium iodide.
- Mechanistic De-risking: Tracks gene expression dynamics using fluorescent reporters to correlate genotype with interaction phenotypes.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven decisions by quantifying Euclidean and accumulated distances as metrics of interaction strength.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative imaging outputs that inform go/no-go decisions in antimicrobial development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how secreted factors modulate single-cell motility in co-culture.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized pad preparation and environmental controls ensuring reproducible imaging.
- Analytics: Generates quantitative readouts including directedness ratios, Euclidean distance, and track length for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work via viability staining that mirrors infection-relevant host-pathogen outcomes.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular imaging capability applicable to diverse bacterial pairs beyond P. aeruginosa and S. aureus.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly visualizing invasion dynamics obscured in bulk culture.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized agarose pad preparation and microscope setting preservation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking virulence factor expression to measurable motility changes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through quantifiable interaction metrics that reflect pathogenic potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy setup, time-lapse imaging, and bacterial co-culture handling.
- Depends on environmental control systems for humidity and temperature to prevent pad drift during acquisition.
- Necessitates standardization across teams for agarose pad preparation and staining protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for different bacterial motility profiles and growth requirements.
- Limited by sample space constraints, making it unsuitable for high-density population studies over extended durations.
