Name: 缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 MicroRNAs 的定量检测方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 学习使用定量实时逆转录聚合酶链反应检测缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中microRNA表达的方法。该方案通过手术诱导肾缺血，提取并纯化microRNA样本，为急性肾损伤诊断提供可靠的生物标志物研究基础。

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感谢 Nam Nguyen 博士对本文初稿的编辑。

所有动物实验方案均经日本医科大学动物伦理委员会批准，并依照日本医科大学实验动物使用与护理指南中的规定进行。
1. IRI 模型
注意：在整个操作过程中需密切监测低体温、肠道湿润度及麻醉深度。
<ol>
	<li>准备以下物品：一个含有浸透异氟烷的棉球的50 mL离心管、加热手术垫、盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿、无菌手术刀片和无菌镊子。将PBS维持在37 °C。 
	注意：本缺血-再灌注损伤（IRI）模型使用雄性C57BL/6小鼠（9周龄，20–25 g）建立，小鼠饲养于温度、湿度受控且具有12小时光照-黑暗循环的环境中。</li>
	<li>使用异氟烷麻醉动物：诱导浓度为3%–5%，维持浓度为2%–3%，夹闭期间浓度为1%–1.5%。为防止麻醉期间角膜干燥，需在眼睛上涂抹眼用软膏。通过反射消失确认麻醉深度。吸入麻醉的优点是可灵活调整麻醉时间。由于需要剥离肾脏周围组织，手术可能耗时较长。然而，吸入麻醉的缺点是容易导致体温下降。在夹闭期间应维持足够的麻醉深度以防止对足趾夹捏产生反应，同时避免不必要的深度麻醉。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠仰卧固定于加热手术垫上，去除切口区域周围的毛发，并使用含氯己定的消毒液和70%乙醇对小鼠腹部皮肤进行消毒&#160;。术前30分钟皮下注射布托啡诺，剂量为0.1 mg/kg。</li>
	<li>使用手术刀片和镊子在腹部皮肤、肌肉和腹膜上做正中切口。</li>
	<li>用PBS润湿的棉签轻轻将肠管推向腹腔外左侧，暴露右侧肾脏和输尿管。手术时间过长可能导致术后肠道损伤。因此，若能获得足够视野，建议不将肠管完全移出腹腔进行操作。避免肠道干燥。干燥的棉签或纱布可能造成肠道损伤。</li>
	<li>用弯头镊子提起右侧输尿管，使用4/0编织丝线对右侧输尿管进行双重结扎。在两道结扎线之间剪断输尿管，保留靠近肾脏一侧的结扎线较长。</li>
	<li>小心握住残留的结扎线，避免过度牵拉，钝性分离沿肾脏走行的结缔组织和脂肪组织。将肾脏轻柔牵出体外进行操作可降低对肝脏造成物理损伤的风险。
	<ol>
		<li>识别除肾上腺动静脉以外为右肾供血的血管，并予以结扎或夹闭。当右肾充分游离后，使用4/0编织丝线结扎右肾动脉和静脉。也可使用止血夹替代缝合。</li>
		<li>用PBS润湿的棉签将肠管轻轻推向腹腔外右侧，暴露左肾，随后用湿润敷料覆盖肠管以防止其干燥。分离左肾周围的结缔组织和脂肪组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>识别除肾上腺动静脉以外为左肾供血的血管，并予以结扎或夹闭。夹闭左肾动脉和静脉以诱导左肾缺血。止血夹应置于距离肾脏约1 cm处，以避免损伤肾实质。成功的缺血可通过肾脏颜色逐渐均匀变暗在视觉上确认。</li>
	<li>将肠管复位回腹腔，注意避免肠管扭转；暂时关闭腹部皮肤并覆盖敷料以维持湿润环境。在夹闭期间维持适当的麻醉深度以防止对足趾夹捏产生反应，同时避免不必要的深度麻醉。夹闭时间为25–45分钟。更长的夹闭时间会导致更严重的肾损伤，但也会增加长期死亡率。可根据病理学结果进行调整。</li>
	<li>缺血期结束后移除止血夹。确保血流再灌注恢复且肾脏颜色改善。在关闭腹部皮肤前确认肠管无扭曲。在腹壁分两层缝合前，腹腔内注射PBS作为液体补充。使用4-0尼龙线缝合腹部皮肤。对于较长的肾脏缺血时间，分别缝合腹壁和腹膜可能有助于减少肠粘连的发生。</li>
	<li>为降低术后感染风险，对手术区域涂抹抗菌剂（如碘-酒精溶液）。根据需要皮下注射布托啡诺，剂量为0.1 mg/kg。</li>
</ol>
2. 肾脏样本采集
注意：本实验采用 45 分钟夹闭时间，于 24 小时后采集肾脏。
<ol>
	<li>用5%异氟烷麻醉动物，并通过反射消失确认麻醉深度。</li>
	<li>使用剪刀和镊子在腹部皮肤、肌肉和腹膜上做正中切口。用27 G针头穿刺下腔静脉采集血液。</li>
	<li>在胸壁做正中切口，将23 G针头插入左心室，确认回血。在肝脏上做切口并注入20 mL PBS。随着血液排出，肝脏颜色由红色变为粉红色，表明血液已充分排出。</li>
	<li>用镊子和剪刀取出左肾，在培养皿中用PBS冲洗。用镊子去除肾筋膜，注意避免肾脏干燥。</li>
	<li>将肾脏切成两半，一半用于组织病理学检查，另一半用于下一步实验。避开肾盂，取30 mg肾组织，使用前保存于−80 °C。</li>
</ol>
3. 从肾脏样本中纯化miRNA
注意：此处使用玻璃匀浆器和微型离心柱中的生物聚合物剪切系统，对重约30 mg的肾脏样品进行匀浆处理。随后，采用基于二氧化硅膜的离心柱法从肾脏样品中分离miRNA。
<ol>
	<li>准备以下物品：1.5 或 2.0 mL 微量离心管、100% 乙醇、氯仿、玻璃匀浆器、冰、置于微量离心柱中的生物聚合物剪切系统9、基于二氧化硅膜的离心柱9、基于苯酚/胍的裂解试剂、含胍和乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 1）以及含乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 2）。</li>
	<li>将 30 mg 肾组织样本放入玻璃匀浆器中，并加入 700 µL 基于苯酚/胍的裂解试剂。此步骤需在冰上操作，因为组织对热敏感，易发生变性。</li>
	<li>通过缓慢旋转研杵轻压样本，对肾组织进行匀浆。在冰上重复该过程数十次，直至肾组织完全溶解于基于苯酚/胍的裂解试剂中。若后续检测未能获得 miRNA，可能原因在于组织溶解不充分。</li>
	<li>为进一步匀浆，将匀浆后的裂解液转移至置于 2.0 mL 收集管中的微量离心柱式生物聚合物剪切系统中。在室温下以 14,000 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>将匀浆后的裂解液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>向匀浆裂解液中加入 140 µL 氯仿，并牢固盖紧管盖。通过反复倒置混匀 15 秒。</li>
	<li>在室温下孵育 2–3 分钟，随后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>将上清液（通常为 300 µL）小心转移至新的微量离心管中，避免扰动沉淀，并加入 1.5 倍体积（通常为 450 µL）的 100% 乙醇。通过涡旋振荡混匀 5 秒。</li>
	<li>用移液器将最多 700 µL 样品加入置于 2.0 mL 收集管中的基于二氧化硅膜的离心柱中。盖紧柱盖，在 15,000 × g 下离心 15 秒。离心后，弃去收集管中的穿流液。</li>
	<li>向基于二氧化硅膜的离心柱中加入 700 µL 洗涤缓冲液 1，彻底清洗样本。盖紧柱盖，在 15,000 × g 下离心 15 秒。离心后，弃去收集管中的穿流液。</li>
	<li>向基于二氧化硅膜的离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液 2，以去除任何残留的盐分。盖紧柱盖，在 15,000 × g 下离心 15 秒。离心后，弃去收集管中的穿流液。
	<ol>
		<li>重复步骤 3.11。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再次将基于二氧化硅膜的离心柱在 15,000 × g 下离心 1 分钟。离心后，弃去收集管中的穿流液。</li>
	<li>将基于二氧化硅膜的离心柱放入新的 1.5 mL 收集管中。向柱中转移 25 µL 无 RNase 水，盖紧柱盖。在室温下静置 5 分钟，然后在 15,000 × g 下离心 1 分钟。</li>
	<li>将含有 miRNA 的 25 µL 洗脱液转移至新的微量离心管中。由于 miRNA 在反复冻融过程中易降解，建议将样本分装至 2 或 3 个管中。使用前于 −80 °C 保存。</li>
</ol>
4. miRNA 的逆转录
注意：此处使用逆转录酶、poly(A)聚合酶和oligo-dT引物，将1.0 µg的分离RNA进行逆转录。
<ol>
	<li>准备以下物品：1.5 mL 微量离心管；8 孔条状管；无 RNase 水；冰；含有脱氧核苷酸、核糖核苷三磷酸和 oligo-dT 引物的 10x 核酸混合液；poly(A) 聚合酶与逆转录酶混合液；以及激活缓冲液，包括 Mg2+、脱氧核糖核苷酸、oligo-dT 引物和随机引物10。</li>
	<li>配制主混合液，每管总量为 8.0 µL，包含 2.0 µL 10x 核酸混合液、2.0 µL poly(A) 聚合酶与逆转录酶混合液，以及 4.0 µL 5x 激活缓冲液（含 Mg2+、脱氧核糖核苷酸、oligo-dT 引物和随机引物）。</li>
	<li>将 8.0 µL 主混合液加入每根离心管中。</li>
	<li>向每根管中加入 1.0 µg 从肾组织样本中分离纯化的 miRNA。</li>
	<li>用无 RNase 水补加至每管总体积为 20 µL，通过移液器反复吹打充分混匀，并在 1,500 x g 条件下离心 15 秒。</li>
	<li>将样品在 37 °C 下孵育 60 分钟，随后立即在 95 °C 下孵育 5 分钟。此步骤可在热循环仪中进行。</li>
	<li>将 cDNA 转移至新的微量离心管中，并用无 RNase 水稀释 10 倍（1:10）。</li>
	<li>稀释后的 cDNA 可短期保存在冰上，长期保存则需置于 −80 °C，使用前取出。</li>
</ol>
5. miRNA 的 qRT-PCR
注意：miRNA 的 qRT-PCR 采用嵌合染料法进行。此处使用了针对 U6 小核 RNA-2（RNA-2）、miRNA-17-5p、miRNA-18a-5p、miRNA-21a-5p、miRNA-132-3p、miRNA-212-3p、miRNA-223-3p 和 miRNA-574-5p 的引物。
<ol>
	<li>准备以下物品：1.5 mL 微量离心管、用于 qRT-PCR 的 96 孔反应板、96 孔反应板用粘性封膜、miRNA 特异性引物、包含 Taq DNA 聚合酶、PCR 缓冲液、脱氧核苷酸和通用引物10 的 PCR 主混合液，以及实时 PCR 仪器。</li>
	<li>为每孔配制主混合液，包含 12.5 µL 的 2x PCR 主混合液、2.5 µL 溶解于无核酸酶水中的 miRNA 引物（5 µM）以及 1.25 µL 的 10x 通用引物。</li>
	<li>将 22.5 µL 主混合液加入 96 孔板的每个孔中。</li>
	<li>向每个孔中加入 2.5 µL 模板 cDNA。</li>
	<li>使用 96 孔反应板粘性封膜密封反应板，随后在 1,000 × g 条件下离心 30 秒。</li>
	<li>使用实时 PCR 仪器及配套软件运行 PCR 扩增程序，步骤如下：
	<ol>
		<li>将反应板放入实时 PCR 仪器中，利用实时 PCR 软件为每孔的样品和目标 miRNA 指定名称。</li>
		<li>根据说明书，在实时 PCR 软件中设置以下扩增程序：95 °C 预变性 15 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 15 秒、55 °C 退火 30 秒和 70 °C 延伸 30 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用实时 PCR 仪器的软件分析 qRT-PCR 数据，检查是否存在非特异性反应。通过分析解离曲线或熔解曲线，确认未发生非目标扩增。
	<ol>
		<li>以 RNU-6 作为内参对照，对目标 miRNA 的表达水平进行标准化处理，并采用 2−ΔΔCT 法11 计算目标 miRNA 的相对表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

根据本文所述方案，成功从缺血-再灌注损伤（IRI）小鼠的肾脏中纯化出miRNA，并通过qRT-PCR进行检测。在该方案中诱导IRI过程的关键点包括对体温和麻醉浓度的密切监控，这些因素已知会影响急性肾损伤（AKI）20。本方案的优势在于能够直观确认是否已实现缺血-再灌注。然而，该IRI模型也存在一些局限性。延长夹闭时间以诱导严重缺血会增加动物死亡率。此外，若使用左肾动脉夹闭未能实现肾缺血，原因可能是除肾动脉和肾静脉外的其他向肾供血血管未被结扎或夹闭。诱导AKI的替代方法还包括药物注射（如叶酸、马兜铃酸、顺铂、庆大霉素、甘油、L-咪唑啉、CoCL2、卡那霉素和呋塞米）。与药物诱导的AKI模型相比，本模型可精确确定AKI的发生时间，且AKI分期的个体差异极小。与双侧肾缺血模型相比，采用本文所述方案可更可靠地诱导IRI。在本模型中，易于在IRI前后给予药物干预，包括应用调控基因或蛋白的miRNA或相关化合物，且切除的右侧肾组织可作为对照使用。
本方案中关于miRNA纯化有三个关键点。第一，必须在冰上提取总RNA，因为mi...

肾脏缺血-再灌注损伤（IRI）是急性肾损伤（AKI）发生的主要危险因素之一1。AKI 在患者预后中具有重要意义，但目前尚未建立特异性治疗手段和早期诊断生物标志物。
microRNA（miRNA）是一类短链非编码RNA，长度约为18–25个碱基。miRNA在体液中具有较高的稳定性，且其序列在动物中高度保守2。miRNA通过调控数千个靶基因，调节多种蛋白质的表达，从而影响多种信号通路2,3,4,5,6,7,8。近年来研究表明，miRNA参与多种疾病状态的发生发展，并可作为多种疾病早期诊断的有效生物标志物。
本实验方案的总体目标是成功纯化并检测由缺血-再灌注损伤（IRI）诱导的急性肾损伤（AKI）小鼠模型肾脏中的miRNA。该IRI模型是急性肾损伤和肾纤维化研究中广泛使用的模型。IRI模型的优点包括能够直观确认是否实现了缺血-再灌注，并能确定AKI发生的准确时间。然而，夹闭时间过长虽可导致广泛的肾小管损伤，但伴随较高的死亡率；而夹闭时间过短则不会引起肾小管损伤，从而导致该实验模型中肾小管损伤进展存在较大变异性。与双侧夹闭模型相比，单侧肾IRI模型中所采集的对侧肾切除组织可作为对照，并确保肾功能衰竭的发生。
使用玻璃匀浆器研磨肾脏样品，从中分离蛋白质和核酸，并进一步分离DNA和RNA9。采用基于二氧化硅膜的离心柱法从肾脏样品中纯化总RNA（包括miRNA）9。随后，以总RNA为模板，利用多聚腺苷酸酶和寡核苷酸-dT引物进行cDNA合成（逆转录）10。最后，通过使用嵌入染料的qRT-PCR检测miRNA的表达水平10。与终点法PCR扩增产物量的检测相比，qRT-PCR能够更准确地定量基因表达。qRT-PCR可测量高浓度样品，且具有宽广的动态范围，其定量结果依赖于循环次数，因而更为精确。既往研究报道，简单的操作流程即可有效纯化并检测组织中的miRNA8,9,10。本实验方案中所述的cDNA合成（逆转录）及利用嵌入染料进行qRT-PCR检测miRNA表达的方法，已被证实具有高准确性和高灵敏度10。
此外，该方案操作简便，且在不同实验室之间具有良好的重复性。因此，该方案适用于需要在小鼠急性肾损伤（AKI）肾脏中进行高精度和高灵敏度miRNA检测的研究。

<table><tbody><tr><td>无钩弯头锥形镊子</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>MA-47</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>洗涤缓冲液1</td></tr><tr><td>Buffer RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>洗涤缓冲液2</td></tr><tr><td>C57B6小鼠</td><td>SLC</td><td>未分配</td><td></td></tr><tr><td>带齿镊子</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>MA-49</td><td></td></tr><tr><td>无齿镊子</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>MA-48-1</td><td></td></tr><tr><td>止血夹</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN&amp;minus;353</td><td></td></tr><tr><td>用于qRT-PCR的MicroAmp光学96孔反应板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96孔反应板</td></tr><tr><td>MicroAmp光学粘性封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>96孔反应板用粘性封膜</td></tr><tr><td>miRNA-132-3p引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00003458</td><td>5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG</td></tr><tr><td>miRNA-17-5p引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00029274</td><td>5'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG</td></tr><tr><td>miRNA-18a-5p引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00031514</td><td>5'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG</td></tr><tr><td>miRNA-212-3p引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00003815</td><td>5'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC</td></tr><tr><td>miRNA-21a-5p引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>5'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA</td></tr><tr><td>miRNA-223-3p引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00003871</td><td>5'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA</td></tr><tr><td>miRNA-574-5p引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00043617</td><td>5'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>基于硅胶膜的离心柱</td></tr><tr><td>miScript II RT试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>QIA shredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>微型离心柱中的生物聚合物破碎系统</td></tr><tr><td>QIAzol裂解试剂</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>基于苯酚/胍的裂解试剂</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex实时荧光定量PCR系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>实时荧光定量PCR仪器</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex软件版本1.2.1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>实时荧光定量PCR仪器软件</td></tr><tr><td>RNU6-2引物</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>未公开</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>B-2</td><td></td></tr><tr><td>血管夹施夹器</td><td>VITALITEC</td><td>1621420</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 microrna 定量检测的方法

A Quantitative Detection Method for MicroRNAs in the Kidney of an Ischemic Kidney Injury Mouse Model

微小RNA（miRNA）参与多种疾病状态，在小鼠疾病的早期诊断和治疗中可作为有效的生物标志物。然而，目前尚未建立针对急性肾损伤（AKI）小鼠肾脏中miRNA纯化及其表达检测的标准操作流程。本研究建立了一种高效且简便的实验方案，用于在通过肾缺血-再灌注诱导的AKI小鼠模型中，利用实时定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）对肾脏中的miRNA进行纯化和定量分析。该方案包括五个步骤：1）通过肾缺血-再灌注诱导AKI；2）采集肾脏组织；3）从肾脏中提取包含miRNA在内的总RNA；4）通过miRNA的反转录合成cDNA；5）采用qRT-PCR检测miRNA的表达水平。利用本方案，可构建出轻度至重度不同表型的肾缺血-再灌注损伤AKI模型。此外，若严格按照操作流程执行，可获得个体差异极小、表型稳定的AKI模型。该qRT-PCR检测方法具有极宽的动态检测范围，能够区分成熟miRNA，并以高特异性实现准确量化。本方案可用于研究AKI肾脏中miRNA的表达谱。

本研究探讨了急性肾损伤（AKI）小鼠中的miRNA表达谱。目前，miRNA表达谱已在小鼠的多种器官和组织中得到研究。miRNA是重要的转录后调控因子，现已被广泛应用于包括急性肾损伤（AKI）在内的多种疾病的特征分析中。miRNA有望帮助阐明病理状态，并可用于AKI的治疗12。AKI的主要病因包括缺血-再灌注损伤（IRI）、肾毒性损伤和脓毒症。肾脏的缺血-再灌注损伤（IRI）是导致AKI发生的主要危险因素之一。已有大量研究报道多种miRNA参与了AKI的发生发展过程13。
本研究采用此处所述方案，探究了在脓毒症和缺血-再灌注损伤（IRI）模型中均发生改变的miRNA。根据微阵列分析结果，筛选出在急性肾损伤（AKI）小鼠肾脏中表达上调的17种miRNA，并进一步研究其中已有报道在人体中表达的7种miRNA。通过本论文所述qRT-PCR方案检测发现，与假手术小鼠相比，IRI小鼠肾脏中6种miRNA（miRNA-17-5p、miRNA-18a-5p、miRNA-21a-5p、miRNA-132-...

本文介绍了一种利用实时定量反转录聚合酶链式反应检测急性肾损伤小鼠模型肾脏中微小RNA表达水平的实验方案。该方案重点针对缺血性肾损伤小鼠模型，并强调微小RNA样本的精细提取过程。

一种用于缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 microRNA 定量检测的方法

微小RNA（miRNAs）参与多种疾病状态，在小鼠疾病的早期诊断和治疗中具有良好的生物标志物潜力。然而，……

microRNA 在急性肾损伤（AKI）中的表达改变可能对生物标志物和治疗具有重要意义。本方案操作简便，可在不同实验室之间获得稳定一致的结果。肾脏缺血再灌注损伤（IRI）是导致急性肾损伤（AKI）的主要危险因素之一。对 IRI 引起改变的 microRNA 进行定量分析有助于疾病诊断。从肾脏样本中纯化的 microRNA 可应用于其他系统。在整个操作过程中，需密切监测低体温、肠道湿润度以及麻醉深度。这是因为该操作涉及多种手动技术，需要熟练掌握。[旁白] 确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将麻醉后的小鼠仰卧位放置于加热的手术垫上。沿腹部正中线做切口后，用 PBS 湿润的棉签轻轻将肠管推向腹腔外左侧，以暴露右侧肾脏和输尿管，并使用弯头镊子提起右侧输尿管。用 4-0 编织丝线在两个位置结扎输尿管，靠近肾脏侧的结扎线留得更长一些，然后在两结扎线之间剪断。小心持留下的结扎线，钝性分离沿肾脏走行的结缔组织和脂肪，识别一支非肾动脉或肾静脉、但为右肾供血的血管。结扎该血管，当右肾充分游离后，结扎肾静脉和肾动脉。用 PBS 湿润的棉签将肠管轻轻推向腹腔外右侧，暴露左肾，并用湿润的手术巾覆盖肠管。按上述方法准备左肾后，于距肾脏 1 厘米处夹闭肾动脉和肾静脉，以诱导左肾缺血。成功的缺血可通过肾脏组织逐渐均匀变暗在视觉上确认。确认缺血后，将肠管组织复位回腹腔，注意避免肠管扭转，并暂时关闭腹壁皮肤并覆盖手术巾。25 至 45 分钟后，移除夹闭夹，并确认血流再灌注及肾脏颜色改善。确认肠管无扭曲后，向腹腔内注射 PBS，然后使用 4-0 尼龙缝线分两层缝合腹肌和皮肤。在缺血损伤诱导后 24 小时，重新打开正中切口，使用 27 号针头从下腔静脉采集血液。在胸壁做正中切口，将 23 号针头插入左心室。确认针头内有回流血液后，在肝脏右叶做切口，并注入 20 毫升 PBS。肝脏颜色由红色变为粉红色，表明血液已充分排出。使用镊子和剪刀切除左肾，并将切除的组织置于 PBS 培养皿中清洗。然后用镊子去除肾筋膜，注意避免肾脏干燥，并沿垂直正中线将肾脏切成两半。为纯化 microRNA，取 30 毫克冷冻肾脏样本置于冰上装有 700 微升苯基胍类裂解试剂的玻璃匀浆器中，缓慢并反复旋转研杵，彻底匀浆样本。组织完全解离后，将匀浆裂解液转移至装有生物聚合物破碎系统的微量离心柱（置于 2 毫升收集管中），通过离心将样本收集至管底。将裂解液转移至另一含有 140 微升氯仿的新微量离心管中，盖紧管盖后颠倒混匀 15 秒。室温孵育 2 至 3 分钟后，离心沉淀样本，将上清液转移至另一新微量离心管中，其中加入 1.5 倍体积的 100% 乙醇，注意勿扰动沉淀。涡旋混匀 5 秒后，取 700 微升样本转移至基于二氧化硅膜的离心柱（置于 2 毫升收集管中）。短暂离心后弃去穿流液，每次使用 500 微升洗涤缓冲液 2，在新的二氧化硅膜离心柱中清洗样本两次，以去除任何残留盐分。第二次洗涤后，再次离心二氧化硅膜离心柱，弃去穿流液后将柱子转移至新的 1.5 毫升收集管中。向柱中加入 25 微升无 RNase 水，室温孵育 5 分钟后再次离心。然后将含 microRNA 的 25 微升洗脱液转移至新的微量离心管中。本研究探讨了在人类中表达且在急性肾损伤小鼠肾脏中上调的 7 种 microRNA。通过定量实时 PCR 分析发现，与假手术小鼠相比，缺血再灌注损伤小鼠肾脏中 6 种 microRNA 的水平显著升高。血清尿素氮和肌酐水平以及急性肾小管坏死程度也显著上调。用于缺血再灌注损伤诊断和急性肾损伤特异性治疗的生物标志物仍不明确。我希望 microRNA 的研究能够取得进展，从而促进急性肾损伤的诊断与治疗。

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缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 MicroRNAs 的定量检测方法

MicroRNA 原位 福尔马林固定肾脏组织的杂交检测

本文所述的肾脏缺血再灌注损伤小鼠模型包括右肾切除术以获取对照组织，以及夹闭左肾蒂以诱导缺血，从而导致急性肾损伤。该模型采用经腹正中切口，所有操作均通过单一手术切口完成。...

肾缺血再灌注损伤：一种小鼠损伤与再生模型

本方案描述了应在肾小球疾病小鼠模型中进行的完整肾脏检查。这些方法可对肾小球功能进行详细的功能性、结构性和机制性分析，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。...

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microRNA 参与了 IgA 肾病的发病机制。我们建立了一种可靠的方法，用于检测 IgA 肾病小鼠模型（HIGA 小鼠）肾脏中 microRNA 的表达水平。这一新方法将有助于验证 miRNA 在 IgA...

免疫球蛋白A肾病小鼠肾脏中微小RNA表达的检测

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在此，我们将外源性人工合成的miRNA模拟物递送至肾脏 通过 在多种肾脏疾病小鼠模型中，通过尾静脉注射非病毒载体和聚乙烯亚胺纳米颗粒，导致肾脏中靶向miRNA显著过表达，从而抑制了多种小鼠模型中肾脏疾病的进展。...

利用聚乙烯亚胺纳米颗粒在多种肾病小鼠模型中向肾脏递送外源性人工合成的miRNA模拟物

本文介绍了一种缺血性慢性肾病模型，该模型采用单侧肾缺血再灌注损伤，并在样本采集前一日进行对侧肾切除术；该方案可在28天和42天时实现基于血清的功能评估，具有高存活率和可重复的慢性肾病病理特征，为机制研究和干预研究提供了多功能平台。...

由肾脏缺血/再灌注损伤诱导的小鼠急性至慢性肾病转化模型

采用激光散斑对比成像系统监测小鼠右肾切除后单侧肾缺血-再灌注过程中肾微血管血流的变化。...

小鼠肾缺血-再灌注损伤期间通过激光散斑对比成像监测微血管灌注

已提出移植分离的胰岛可能成为治疗1型糖尿病的一种潜在方法。本文介绍一种从小鼠胰腺中分离胰岛并将其移植至肾包膜下空间的方法。...

小鼠胰岛分离与肾包膜下移植方法

学习使用定量实时逆转录聚合酶链反应检测缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中microRNA表达的方法。该方案通过手术诱导肾缺血，提取并纯化microRNA样本，为急性肾损伤诊断提供可靠的生物标志物研究基础。

一种用于缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 microRNA 定量检测的方法

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