缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 MicroRNAs 的定量检测方法

AKI 中 microRNA 表达的改变可能有助于生物标志物和治疗。该协议很简单，并且在实验室之间取得了一致的结果。肾脏的 IRI 是 AKI 的主要危险因素之一。量化被 IRI 改变的 microRNA 可以做出诊断。从肾脏样本中纯化的 MicroRNA 应用于其他系统。在整个手术过程中仔细监测体温过低、肠道保湿和麻醉深度。这是因为有许多手动技术需要习惯。

[旁白]确认对脚趾捏没有反应后，将麻醉的小鼠仰卧位放在加热的手术垫上。做腹部中线切口后，用蘸有PBS的棉签轻轻将肠道推到腹腔外左侧，露出右肾和输尿管，用斜角镊子提起右侧输尿管。用4-0丝编织缝线在两个地方结扎输尿管，为更靠近肾脏的缝合线留下更长的系带，并在缝合线之间剪开。小心地握住剩余的缝线，钝地解剖肾脏的结缔组织和脂肪，并确定血管不是向右肾供血的肾动脉或静脉。结扎血管，当右肾充分分离时，结扎肾静脉和动脉。使用蘸有 PBS 的棉签，轻轻地将肠道推向腹腔外的右侧，露出左肾，并用湿润的窗帘覆盖肠道。按照图示准备好左肾后，夹住肾动脉和静脉，距肾一厘米，诱发左肾缺血。成功的缺血可以通过肾组织逐渐均匀变黑来目视确认。确认缺血后，将肠道组织回回腹腔，注意避免肠道扭曲，并暂时闭合并覆盖腹部皮肤。25至45分钟后，取下夹子，确认血流再灌注和肾脏颜色改善。确认肠道未扭曲后，腹腔内滴入PBS，用4-0尼龙缝合线将腹肌和皮肤分两层闭合。缺血性损伤诱导后 24 小时，重新打开中线切口，用 27 号针头从下腔静脉采集血液。在胸壁上做一个中线切口，然后将一根 23 号针头插入左心室。确认回流到针头后，在肝脏右叶切开一个切口，注射20毫升PBS。肝脏会变成红色变成粉红色，确认已经排出了足够的血液。使用镊子和剪刀取出左肾脏，并在一盘 PBS 中清洗切除的组织。然后用镊子在不使肾脏干燥的情况下切除肾筋膜，沿垂直中线将肾脏切成两半。对于microRNA纯化，将30毫克冷冻肾脏样品放入含有700微升苯基胍基裂解试剂的玻璃均质器中，并在冰上缓慢反复扭转杵以完全均质化样品。当组织完全解离后，将均质裂解物转移到两毫升收集管中的微型离心离心柱中的生物聚合物切碎系统，并通过离心将样品收集到管底部。将裂解物转移到含有 140 微升氯仿的新微量离心管中，并在盖子牢固拧紧的情况下倒置混合管 15 秒。在室温下孵育两到三分钟后，通过离心沉淀样品，并将上清液转移到含有100%乙醇体积1.5倍的新微量离心管中，而不会干扰沉淀。通过涡旋将样品混合五秒钟，然后将 700 微升样品转移到两毫升收集管中的硅胶膜离心柱中。短暂离心后，丢弃流通液，并在新的基于硅胶膜的离心柱中用 500 微升洗涤缓冲液 2 洗涤样品两次，每次洗涤以去除任何痕量盐。第二次洗涤后，再次离心基于硅胶膜的离心柱，丢弃流通后，将色谱柱转移到新的1.5毫升收集管中。向色谱柱中加入 25 微升不含 RNase 的水，并在室温下孵育样品 5 分钟，然后再次离心样品。然后将含有 25 微升 microRNA 的溶光石转移到新的微型离心管中。在这项研究中，研究了在急性肾损伤小鼠肾脏中上调的七种在人类中表达的 microRNA。如图所示，与模拟小鼠相比，缺血再灌注损伤小鼠的肾脏中六种microRNA的水平显着增加。血清尿素氮和肌酐水平以及急性肾小管坏死也显著上调。

IRI诊断和AKI特异性治疗的生物标志物仍不清楚。我希望microRNA研究能够推动AKI的诊断和治疗，并为其做出贡献。