小鼠单侧输尿管梗阻模型中microRNA表达的定量实时PCR分析

该方法可实现对患有多种病理状况（如肾纤维化）小鼠肾脏中microRNA表达的检测。该技术的主要优势在于，通过一个简单的过程即可实现高准确性和高灵敏度的microRNA表达谱分析，节省时间并避免技术误差。进行假手术时，使用手术剪和镊子在腹部皮肤做切口，并从膀胱至左侧肋骨下缘剪开肌肉和腹膜。

用 PBS 润湿两根棉签，小心地将肠道推向一侧。放置湿润的棉签以识别左侧肾脏和输尿管。用 4-0 尼龙线缝合腹膜膜，然后缝合切口。

为了进行单侧输尿管梗阻（UUO）操作，先在腹部皮肤上做一切口，并剪开肌肉和腹膜，操作方法与假手术所示相同。将一支2.5毫升的注射器置于小鼠下方。用PBS润湿两根棉签，然后用镊子小心地将肠道拨至一侧，并放置棉签以辨认左侧输尿管。

用镊子提起左侧肾脏。使用4-0丝线在相距约一厘米的两个位置结扎左侧输尿管。在两处结扎线的中间位置剪断输尿管，然后使用4-0尼龙缝线缝合腹膜和切口。

剪开腹膜后，如前所述，用镊子提起腹膜，使用手术剪在上缘做一横向切口，然后沿肋骨最低边缘继续切开。辨认左肾，并用 PBS 反复灌注，直至肾脏变为黄白色。用手术剪剪断左肾动脉和静脉，将肾脏取下并置于培养皿中，然后用 PBS 小心冲洗。

用手术剪和镊子将肾脏切成约10毫克的组织样本，每块样本放入一个1.5毫升的微量离心管中，并盖紧管盖。将一份肾脏样本放入硅胶匀浆器中，加入700微升基于苯酚/胍的裂解试剂。缓慢按压并旋转匀浆器的研杵，对肾脏样本进行匀浆处理。

重复按压和扭转，直至样品完全溶解于裂解试剂中。为进一步均质化样品，将均质后的裂解液转移至生物聚合物离心柱中，在14,000 ×g条件下离心3分钟，然后将沉淀的裂解液转移至一个新的1.5毫升微量离心管中。向管中的裂解液加入140 µL氯仿，并 tightly 封紧管盖。

为混合裂解液和氯仿，将离心管颠倒15次。样品在室温下孵育2至3分钟，然后在4°C下以12,000 × g离心15分钟。小心不要扰动沉淀物，将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，并加入1.5倍体积的100%乙醇。

将混合物涡旋振荡5秒。取700 µL样品加入置于2 mL收集管中的膜固定式离心柱中。盖紧柱子的盖子，在15,000 ×g条件下离心15秒，然后弃去收集管中的沉淀裂解物。

向2毫升收集管中的膜固定式离心柱加入700微升洗涤缓冲液一，彻底清洗样本。然后重复离心，并弃去收集管。每次用500微升洗涤缓冲液二洗涤，重复洗涤两次。

最后一次洗涤后，将膜结合的离心柱放入2毫升收集管中，在15,000 × g条件下离心1分钟，弃去沉淀的裂解液。将膜结合的离心柱转移至新的1.5毫升离心管中。加入30 µL无RNase的水溶解总RNA，盖紧离心柱盖子，在室温下静置5分钟。

然后在4℃下以15,000 × g离心1分钟。将含有总RNA的样品转移至冰上预冷的新微量离心管中，并通过分光光度法测定总RNA的浓度。根据文章所述方法配制主混合液，每管八联管中加入8 µL。

调整总RNA浓度后，将12微升总RNA等分试样加入每个试管中并盖紧管盖。离心试管15秒。将试管放入热循环仪中，在37摄氏度下孵育60分钟。

完成后，立即在95摄氏度下孵育5分钟以合成cDNA。将cDNA转移至新的1.5毫升微量离心管中，并用蒸馏水稀释10倍。涡旋振荡并离心5秒，随后按照文本稿件中的描述进行定量实时PCR。

本方案用于通过结扎8周龄雄性小鼠（体重20至25克）的左侧输尿管，建立单侧尿道梗阻小鼠模型。使用4-0丝线进行双重结扎，完全阻塞输尿管。术后第8天采集肾脏组织。

microRNA 的 qRT-PCR 数据表明，与对照组相比，UUO 小鼠肾脏中 microRNA 3070-3p 的水平显著升高，而 microRNA 7218-5p 和 microRNA 7219-5p 的水平则降低。在实施本方案时，请务必反复旋转肾脏样本，直至其完全溶解于苯酚/胍类裂解试剂中，以获得良好的 RNA 提取效果。