有条件 统计3 删除鼠标模型的骨骼表型分析

基因工程小鼠模型是研究体内人类疾病机制的有力工具。分析小鼠的骨骼表型是骨骼研究的基础。该颗粒描述了一些分析骨骼表型的典型技术，这些技术对于刚接触骨骼组织研究的人来说可能会很有趣。

在尝试这种颗粒时，请记住动物实验需要时间，因此在每次实验中尽可能多地收集高质量的样本，即使您在短期内不需要它们。首先将安乐死的小鼠置于仰卧位，然后用手轻轻脱臼双侧髋关节。使用眼科剪刀垂直切下胫骨远端的皮肤，然后去除后肢的所有皮肤。

用剪刀剪断右髋关节和膝关节的关节韧带，将后肢分开。然后切开两端的骨头，将骨头完全浸入 4% PFA 中。切开转子和腓骨交界处。

将后肢浸入 4% PFA 中，保留右后肢进行石蜡切片。用剪刀剪断左髋关节和膝关节的关节韧带，轻轻去除软组织。将胫骨和股骨分开，分别浸入 75% 乙醇中。

保留股骨进行显微 CT 扫描，保留胫骨进行钙黄绿素和茜素红双重标记。制备石蜡切片时，用 PBS 轻轻洗涤固定的右后肢 3 次，每次洗涤 10 分钟。然后用超声波脱钙器在 15% EDTA 中脱钙 3 到 4 周，直到骨骼可以弯曲，每隔一天更换一次脱钙液。

脱钙后，用 PBS 洗涤标本 3 次，并将其浸入 4 摄氏度的 75% 乙醇中过夜。第二天，依次将标本浸入 95% 乙醇、100% 乙醇和二甲苯中各 1 小时。将样品浸入一半二甲苯和一半石蜡中 30 分钟，然后在 65 摄氏度的石蜡中过夜。

要包埋标本，请将其浸入石蜡中，将股骨和胫骨呈 90 度角放置。石蜡完全冷却后，从包埋槽中取出标本。编号并在零下 20 摄氏度下存放过夜。

将石蜡切片在 65 摄氏度下烘烤 30 分钟，然后将它们浸入二甲苯中 10 分钟进行脱蜡。每次用新鲜的二甲苯浸入切片 3 次。依次将切片浸入 100% 乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇和蒸馏水中各 5 分钟，以再水化。

使用 TRAP 染色试剂盒制备染色溶液，并将其加热至 37 摄氏度。向每个切片中加入 50 至 100 微升染色溶液，并在 37 摄氏度的潮湿室中孵育 20 至 30 分钟。在光学显微镜下每五分钟检查一次破骨细胞的染色状态，直到可以看到红色的多核破骨细胞。

然后用水结束反应。在苏木精溶液中对切片进行复染 30 秒，然后将它们浸入 1% 氨溶液中 1 分钟，形成稳定的蓝色。然后用缓慢流动的自来水冲洗它们。

使用带有中性香脂的盖玻片安装切片，并干燥过夜。用显微镜捕捉三到五个视野，用图像 J 分析小梁周长，使用直线工具测量比例尺的长度为 L1。然后使用分割线工具测量小梁周长为 L2。计算物理长度并计算具有三个以上细胞核的 TRAP 阳性细胞的数量。固定后，用 PBS 轻轻洗涤胫骨 3 次，然后依次将标本浸入 95% 乙醇、100% 乙醇和二甲苯中，每次 5 分钟。

将样品浸入丙酮中 12 小时，将半丙酮和半树脂浸入 2 小时，并在干燥箱中浸入纯树脂中过夜。将纯树脂添加到合适的硅胶包埋槽中，并将标本放入槽中，避免气泡。将树脂在 60 °C 的干燥箱中聚合 48 小时。

用旋转切片机将样品连续切成 5 微米厚的切片，并将其余样品与干燥剂一起在室温下储存。用镊子在 75% 乙醇滴中粘附切片，并使用中性香脂用盖玻片安装它们。用荧光显微镜捕获红色和绿色荧光标记。

生成破骨细胞特异性 Stat3 缺失小鼠以研究 Stat3 缺失对破骨细胞分化的影响。股骨重建和显微 CT 定量分析表明，与野生型小鼠相比，Stat3 Ctsk 小鼠的骨量增加。通过 H 和 E 染色检查野生型和 Stat3 Ctsk 小鼠股骨的组织形态。

使用 TRAP 染色检测破骨细胞活性。破骨细胞是具有多个细胞核的大 TRAP 阳性细胞。与野生型小鼠相比，Stat3 Ctsk 小鼠中 TRAP 阳性破骨细胞的数量较低，表明 Stat3 缺陷损害了破骨细胞的形成。

用钙黄绿素和茜素红双标记测量成骨。钙黄绿素和茜素红色荧光之间的区域代表新形成的骨骼。破骨细胞中缺失的 Stat3 不会影响骨合成代谢。

矢状石蜡切片，其中软骨后来是对称的，这表明这里使用了清晰的 M 形线。在这些研究中，我们将包括骨骼系统的更多特征，例如机械性能。