有条件 统计3 删除鼠标模型的骨骼表型分析
July 3rd, 2020
此协议描述了一种规范的方法，以了解控制体内骨质疏松活动的关键基因。该方法采用转基因小鼠模型和一些规范技术来分析骨骼表型。
基因工程小鼠模型是研究体内人类疾病机制的有力工具。分析小鼠的骨骼表型是骨骼研究的基础。该颗粒描述了一些分析骨骼表型的典型技术，这些技术对于刚接触骨骼组织研究的人来说可能会很有趣。
在尝试这种颗粒时，请记住动物实验需要时间，因此在每次实验中尽可能多地收集高质量的样本，即使您在短期内不需要它们。首先将安乐死的小鼠置于仰卧位，然后用手轻轻脱臼双侧髋关节。使用眼科剪刀垂直切下胫骨远端的皮肤，然后去除后肢的所有皮肤。
用剪刀剪断右髋关节和膝关节的关节韧带，将后肢分开。然后切开两端的骨头，将骨头完全浸入 4% PFA 中。切开转子和腓骨交界处。
将后肢浸入 4% PFA 中，保留右后肢进行石蜡切片。用剪刀剪断左髋关节和膝关节的关节韧带，轻轻去除软组织。将胫骨和股骨分开，分别浸入 75% 乙醇中。
保留股骨进行显微 CT 扫描，保留胫骨进行钙黄绿素和茜素红双重标记。制备石蜡切片时，用 PBS 轻轻洗涤固定的右后肢 3 次，每次洗涤 10 分钟。然后用超声波脱钙器在 15% EDTA 中脱钙 3 到 4 周，直到骨骼可以弯曲，每隔一天更换一次脱钙液。
脱钙后，用 PBS 洗涤标本 3 次，并将其浸入 4 摄氏度的 75% 乙醇中过夜。第二天，依次将标本浸入 95% 乙醇、100% 乙醇和二甲苯中各 1 小时。将样品浸入一半二甲苯和一半石蜡中 30 分钟，然后在 65 摄氏度的石蜡中过夜。
要包埋标本，请将其浸入石蜡中，将股骨和胫骨呈 90 度角放置。石蜡完全冷却后，从包埋槽中取出标本。编号并在零下 20 摄氏度下存放过夜。
将石蜡切片在 65 摄氏度下烘烤 30 分钟，然后将它们浸入二甲苯中 10 分钟进行脱蜡。每次用新鲜的二甲苯浸入切片 3 次。依次将切片浸入 100% 乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇和蒸馏水中各 5 分钟，以再水化。
使用 TRAP 染色试剂盒制备染色溶液，并将其加热至 37 摄氏度。向每个切片中加入 50 至 100 微升染色溶液，并在 37 摄氏度的潮湿室中孵育 20 至 30 分钟。在光学显微镜下每五分钟检查一次破骨细胞的染色状态，直到可以看到红色的多核破骨细胞。
然后用水结束反应。在苏木精溶液中对切片进行复染 30 秒，然后将它们浸入 1% 氨溶液中 1 分钟，形成稳定的蓝色。然后用缓慢流动的自来水冲洗它们。
使用带有中性香脂的盖玻片安装切片，并干燥过夜。用显微镜捕捉三到五个视野，用图像 J 分析小梁周长，使用直线工具测量比例尺的长度为 L1。然后使用分割线工具测量小梁周长为 L2。计算物理长度并计算具有三个以上细胞核的 TRAP 阳性细胞的数量。固定后，用 PBS 轻轻洗涤胫骨 3 次，然后依次将标本浸入 95% 乙醇、100% 乙醇和二甲苯中，每次 5 分钟。
将样品浸入丙酮中 12 小时，将半丙酮和半树脂浸入 2 小时，并在干燥箱中浸入纯树脂中过夜。将纯树脂添加到合适的硅胶包埋槽中，并将标本放入槽中，避免气泡。将树脂在 60 °C 的干燥箱中聚合 48 小时。
用旋转切片机将样品连续切成 5 微米厚的切片，并将其余样品与干燥剂一起在室温下储存。用镊子在 75% 乙醇滴中粘附切片，并使用中性香脂用盖玻片安装它们。用荧光显微镜捕获红色和绿色荧光标记。
生成破骨细胞特异性 Stat3 缺失小鼠以研究 Stat3 缺失对破骨细胞分化的影响。股骨重建和显微 CT 定量分析表明，与野生型小鼠相比，Stat3 Ctsk 小鼠的骨量增加。通过 H 和 E 染色检查野生型和 Stat3 Ctsk 小鼠股骨的组织形态。
使用 TRAP 染色检测破骨细胞活性。破骨细胞是具有多个细胞核的大 TRAP 阳性细胞。与野生型小鼠相比，Stat3 Ctsk 小鼠中 TRAP 阳性破骨细胞的数量较低，表明 Stat3 缺陷损害了破骨细胞的形成。
用钙黄绿素和茜素红双标记测量成骨。钙黄绿素和茜素红色荧光之间的区域代表新形成的骨骼。破骨细胞中缺失的 Stat3 不会影响骨合成代谢。
矢状石蜡切片，其中软骨后来是对称的，这表明这里使用了清晰的 M 形线。在这些研究中，我们将包括骨骼系统的更多特征，例如机械性能。
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概述
本研究利用基因工程小鼠模型探讨关键基因在破骨细胞活动中的作用。该协议概述了分析骨骼表型的技术，并强调了高质量生物样本的重要性。
关键研究组成部分
研究领域
- 骨生物学
- 破骨细胞分化
- 骨重塑的遗传调控
背景
- 破骨细胞在骨骼健康中的重要性
- 利用转基因小鼠模拟人类疾病
- 严格实验协议的必要性
使用的方法
- 使用各种组织学技术进行骨骼分析
- 转基因小鼠模型（Stat3 Ctsk 小鼠）
- TRAP染色、微CT扫描和双标记用于骨形成测量
主要结果
- Stat3缺乏减少了破骨细胞形成
- 与野生型相比，Stat3 Ctsk 小鼠的骨量增加
- 该研究验证了该基因在破骨细胞分化中的作用，并提出了骨量调节的机制
结论
- 本研究展示了基因调控如何影响破骨细胞行为和整体骨骼健康。
- 这些发现对于与骨量流失相关疾病的治疗方法具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding osteoclast-specific gene function enables mechanistic de-risking in bone-targeted therapeutic development. Conditional knockout models provide predictive confidence for target validation by isolating cellular contributions to bone remodeling. This approach supports preclinical assessment of anabolic versus catabolic pathway modulation in osteoporosis drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis regarding STAT3's role in osteoclast differentiation and bone resorption.
- Operational Value: Enables functional target validation through cell-specific genetic ablation in vivo.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by linking STAT3 loss to reduced osteoclast formation and increased bone mass.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (bone tissue) for downstream assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Generates quantitative outputs (TRAP+ cell count, bone area, microCT metrics) for reliable compound evaluation.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness through standardized histology and imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system continuity from genetic target modulation to skeletal phenotype.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring both resorption (TRAP) and formation (calcein/alizarin) endpoints.
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone mass regulation via osteoclast-specific pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of osteoclast-intrinsic gene function and pathway clarification in bone homeostasis.
- Discovery Biology: Explains how conditional deletion supports hypothesis testing of STAT3 in osteoclasts and biological de-risking of resorption targets.
- Screening: Describes assay readiness via standardized tissue preparation and quantitative histomorphometry for compound screening.
- Analytics: Highlights microCT, TRAP staining, and dual-labeling as quantitative readouts that enable cross-condition comparison of bone phenotype.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to preclinical continuity through integrated resorption and formation analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for validating osteoclast-specific targets in bone disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in osteoclast regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of skeletal phenotyping workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in bone therapeutics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on on-target mechanism validation.
Implementation Considerations
- Required expertise in mouse genetics, bone histology, and microCT analysis.
- Instrumentation needs include microtome, fluorescence and light microscopes, microCT scanner, and decalcification equipment.
- Cross-team standardization requires harmonized staining protocols and imaging analysis between histology and in vivo teams.
- Adaptation considerations across model systems include verifying Cre specificity and compensatory pathways in other osteoclast models.
- Practical limitations include time-intensive decalcification and sectioning, and potential developmental compensation in constitutive models.
