Name: 创伤性出血挫伤和神经炎症的临床前受控皮质影响模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学习使用小鼠控制性皮质撞击模型研究创伤性出血挫伤和神经炎症。该方案通过立体定位技术和开颅手术，精确控制撞击速度等参数，实现可重复的局灶性皮质损伤，为探索脑损伤后免疫反应及潜在治疗方法提供可靠平台。

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感谢江丹野对稿件的编辑和富有见地的建议。感谢林志轩协助准备稿件。本研究由台湾科技部（MOST 107-2320-B-002-063-MY2）资助，项目负责人为 C.F.C。

本方案中描述的所有操作均在中国台湾大学医学院与振兴医院机构动物照护与使用委员会的批准下进行。本方案使用8至10周龄的雄性C57BL/6野生型小鼠。
1. 麻醉诱导
<ol>
	<li>将小鼠置于与异氟烷挥发罐相连的诱导室中，使用约4%异氟烷与室内空气混合，流速约为0.2 L/min，进行麻醉。</li>
	<li>确保小鼠呼吸节律平稳。通过检查动物是否丧失足趾夹捏反射来确认麻醉深度。</li>
</ol>
2. 术前准备
<ol>
	<li>使用电动剃毛器沿尾侧至头侧方向剃除小鼠头部毛发。不要修剪小鼠的胡须。 
	注意：胡须的缺失可能影响后续行为学实验结果的准确性。</li>
	<li>将小鼠固定于立体定位仪上。小心地将耳杆插入外耳道。确保小鼠头部被两侧耳杆均匀固定。</li>
	<li>连接鼻罩，并在整个手术过程中以1%–2%异氟烷维持麻醉。</li>
	<li>在双眼上涂抹眼用软膏&#160;，以防止手术期间角膜干燥。将动物置于加热垫上，维持体温在37 ˚C。</li>
	<li>使用无菌棉签，先用聚维酮碘对剃毛区域进行消毒，再用70%酒精消毒。重复三次。</li>
</ol>
3. CCI 手术
<ol>
	<li>在切口前，使用31 G胰岛素针头皮下注射100 µL布比卡因（0.25%）。轻轻按摩注射部位以促进吸收。 
	注意：该局部麻醉剂可在手术部位直接提供镇痛作用。</li>
	<li>使用手术刀或剪刀沿头皮正中线做一纵向切口（约1.5 cm）。用止血钳将皮肤向右侧牵开，使暴露的颅骨干燥1分钟。使用无菌棉签清除颅骨上残留的血液和组织。</li>
	<li>检查小鼠头部在水平面上是否保持水平。
	<ol>
		<li>识别解剖学标志点前囟（Bregma）和后囟（Lambda），并用无菌外科标记笔/铅笔标记这两个位置。</li>
		<li>确保动物头部在头尾方向上保持水平。通过使用连接在立体定位仪框架上的31 G胰岛素针头测量前囟和后囟的Z坐标来实现。 
		注意：如有必要，可垂直调整耳杆。</li>
		<li>通过沿中线及中线左右两侧两个对应位置检查Z坐标，并在必要时调整耳杆，完成动物头部的水平定位。 
		注意：动物头部的水平且稳定放置对于CCI模型的可重复性和可靠性至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用同一根31 G胰岛素针头确定颅骨切除部位。将XY坐标原点设为前囟，将针头向右侧横向移动3 mm。将此位置标记为颅骨切除部位，并用无菌外科标记笔/铅笔在颅骨上画一个直径为4 mm的圆圈。</li>
	<li>使用高速微型钻头配合环钻（直径4 mm）沿铅笔画出的圆圈进行钻孔，形成一个直径为4 mm的开放性孔洞。钻速设定为20,000 rpm。避免施加过大的压力。 
	注意：此步骤应迅速完成（通常在30秒至1分钟内），以防止对脑组织造成热损伤。钻孔时施加过大压力可能导致意外穿透，从而压迫并损伤脑表面。</li>
	<li>小心用镊子移除骨瓣，并暂时将其保存在冰冻的生理盐水中。在用棉签尖端轻压脑表面止血前，先用生理盐水轻轻冲洗孔洞。</li>
	<li>将CCI装置上直径为2.5 mm的圆头撞击器设置为22.5˚角。将撞击头归零至硬脑膜表面。在控制箱上设定撞击参数：速度为4 m/s，变形深度为2 mm。随后将金属头回缩。 
	注意：在撞击头处于完全伸出位置并静态轻微压在硬脑膜表面时进行归零，可提高零点的准确性以及损伤程度的可重复性。</li>
	<li>触发活塞，使脑组织受到撞击。将无菌棉签置于损伤区域以止血。</li>
	<li>将骨瓣放回小鼠脑部，并用牙科水泥固定。使用组织粘合剂（如3M Vetbond）闭合头皮。</li>
</ol>
4. 术后恢复
<ol>
	<li>将小鼠置于干净的恢复笼中，笼内铺有垫料，并放置于加热灯下直至完全恢复。</li>
	<li>术后连续两天提供湿润的颗粒饲料，并皮下注射酮洛芬（5 mg/kg）。</li>
	<li>对假手术对照组动物执行上述操作，但省略步骤 3.7 和 3.8。</li>
</ol>
5. 小鼠安乐死
<ol>
	<li>在研究当天，通过过量异氟烷麻醉后进行断头处死小鼠。 
	注意：在样本采集前，可采用多种策略对实验动物实施安乐死。</li>
	<li>采集脑组织样本用于组织学分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

CCI 协议可为脑挫伤研究提供高度可重复的脑部机械损伤。以下步骤对于利用该 CCI 协议在动物中产生一致的脑损伤至关重要。
首先，应将小鼠头部稳定地固定在立体定位仪框架上，并确保解剖学标志点前囟（Bregma）和后囟（Lambda）始终处于同一水平面。头部固定不稳或不平常常导致动物间损伤程度不一致。为确保动物头部安全固定，可用一对镊子轻轻从侧面推动小鼠头部。头部必须在侧向保持不动，任何移动均提示耳杆位置不正确。最后，轻轻提起小鼠尾巴将其身体略微悬空，以确认头部已牢固固定在立体定位仪框架上。
接下来，在颅骨钻孔时应避免损伤硬脑膜，需沿环形路径均匀施加压力，因为机械性损伤硬脑膜可能导致脑组织不必要的伤害。应格外小心，用精细镊子轻轻敲击骨窗以检查钻孔深度。此外，长时间钻孔过程中产生的热量也会引起皮层损伤。在本实验方案中，我们采用环钻而非大多数其他闭合性脑外伤（CCI）方案中常见的圆头钻头33,34，以缩短开颅时间。钻...

脑挫伤是一种创伤性脑损伤，在现代社会最致命的健康问题中位居前列1。其主要由交通事故等意外事件引起，导致外力将机械能作用于头部。创伤性脑损伤每年影响约350万人，占美国所有急性损伤相关死亡病例的30%2。脑挫伤幸存患者常伴有长期后遗症，包括局灶性运动无力、感觉功能障碍和精神疾病1。
脑挫伤的原发性损伤由机械因素引起，包括牵拉和撕裂力，导致脑实质结构立即发生变形以及局部中枢神经系统细胞死亡3。出血性挫伤是头部外伤部位因血管撕裂所致脑出血的统称4。具体而言，脑挫伤后立即发生脑内出血，进而导致迟发性血肿形成。在血肿内部，红细胞裂解释放的血红蛋白和游离铁可进一步引发与血液相关的毒性反应5,6，从而引起脑疝、脑水肿和颅内压升高5,6。血肿的占位效应还会损害神经元（轴突）、胶质细胞、血管和支持组织的协同功能7。此外，持续且弥散性的神经炎症伴随进行性神经退行性变可持续数月，造成脑组织的继发性损伤8。
小胶质细胞活化是脑挫伤的多种重要病理特征之一9,10。在感知受损组织中释放的损伤相关分子模式（DAMPs）和渗漏的血液后，活化的小胶质细胞会引发神经炎症，从而加剧继发性脑损伤11。此外，小胶质细胞释放的趋化因子可促进外周免疫细胞浸润至创伤区域，导致活性氧和促炎性细胞因子的产生。这会形成一种自我持续的促炎环境，引发进行性脑损伤9,12。与此同时，具有替代性活化表型的小胶质细胞可通过清除受损组织中的碎片，促进组织稳态恢复和脑组织修复13。通过减轻有害的小胶质细胞免疫反应来抑制继发性神经炎症，已被证明对促进脑挫伤后的脑功能恢复尤为有效3,9,10,12。
目前已开发出多种用于研究创伤性脑损伤的临床前模型，包括落重模型、侧向液体脉冲损伤模型和冲击波模型14,15。然而，这些模型各自存在局限性，例如操作过程中死亡率较高、组织学结果的可重复性较低，以及不同实验室之间造成的损伤变异性较大16,17。相比之下，控制性皮质撞击（CCI）模型由于具有精确的控制性和高度可重复性，更适合用于研究局灶性脑挫伤14,15,18,19。
此外，通过调控生物力学形变参数（如冲击速度和冲击深度），可以控制所诱导损伤的严重程度，从而产生不同强度的损伤，使研究人员能够模拟患者中常见的不同程度的功能障碍17。颅脑创伤的临床前模型（CCI）最早于1896年建立20。此后，CCI模型被广泛应用于灵长类动物21、猪22、绵羊23、大鼠24和小鼠25，成为适用范围最广的可改良模型。上述特点使CCI成为目前最适宜的实验性脑挫伤模型之一26。
本实验室采用一种 commercially available 气动 CCI 撞击系统，并测试了生物力学变形参数，以产生中重度局灶性脑挫伤，该损伤累及初级感觉和运动皮层区域，但不损伤海马体27,28。我们及其他研究者已证实，该 CCI 手术可用于研究人类脑挫伤的临床特征，包括脑组织丢失、神经元损伤、脑实质内出血、神经炎症以及感觉运动功能缺陷24,25,27,28,29,30。本文中，我们详细描述了一种执行小鼠 CCI 的标准方案，该方案可用于研究局灶性脑挫伤后诱导的髓鞘丢失、铁沉积、中枢神经系统炎症、出血毒性以及小胶质细胞/巨噬细胞的反应。

<table><tbody><tr><td>4mm 短柄环钻</td><td>Salvin Dental Specialties, Inc.</td><td>TREPH-SHORT-4</td><td></td></tr><tr><td>抗 Iba1 抗体</td><td>Wako chemicals</td><td>#019-19741</td><td></td></tr><tr><td>抗 Ly76 抗体</td><td>abcam</td><td>ab91113</td><td></td></tr><tr><td>羧酸盐水门汀</td><td>3M</td><td>70201136010</td><td></td></tr><tr><td>皮质挫伤撞击损伤仪</td><td>Custom Design &amp;amp; Fabrication, Inc.</td><td>S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3</td><td>CCI 设备 (S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3)</td></tr><tr><td>醋酸克雷斯紫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>DAB 染色试剂盒</td><td>Vector</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG 二抗，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 IgG 二抗，Alexa Fluor 594 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr><tr><td>梅耶氏苏木精</td><td>ScyTek</td><td>HMM500</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>fine science tools</td><td>11252-20 NO. 5</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Panion &amp;amp; BF Biotech Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25% 布比卡因</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62470</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪框架</td><td>stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>fine science tools</td><td>14068-12</td><td></td></tr><tr><td>溶剂蓝 38</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3382</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于创伤性出血性挫伤和神经炎症研究的临床前可控皮层冲击模型

A Preclinical Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Hemorrhage Contusion and Neuroinflammation

脑挫伤是一种严重的医学问题，每年影响全球数百万人。迫切需要深入了解其病理生理机制，并为这种破坏性的神经系统疾病开发有效的治疗策略。初始物理冲击所导致的脑实质内出血和创伤后炎症反应会加剧小胶质细胞/巨噬细胞的活化及神经炎症，进而加重脑组织病理改变。本文提供了一种可控性皮质冲击（controlled cortical impact, CCI）实验方案，利用气动冲击系统向硬脑膜表面施加可调控强度和速度的机械力，从而在小鼠中复制出实验性皮质挫伤。该临床前模型可使研究人员在小鼠中诱导出中重度局灶性脑挫伤，并广泛研究包括出血性挫伤、小胶质细胞/巨噬细胞活化、铁毒性、轴突损伤以及短期和长期神经行为功能缺陷在内的多种创伤后病理进程。本方案可用于探索脑挫伤的长期影响及潜在干预措施。

立体定位放置与开颅手术步骤示意图。
CCI 模型以其在产生从轻度到重度损伤方面的稳定性和可重复性而著称18。正确的立体定位技术和开颅手术操作是实现稳定且可重复的 CCI 诱导脑损伤的主要决定因素（图 1A、B）。理想的开颅手术操作应在假手术脑组织中引起最小的组织学损伤27,28，如（图 1C）所示。
CCI 会导致长期的脑损伤、血液相关毒性和神经炎症。
为评估由CCI诱导的脑损伤、轴突丢失、出血性病理改变以及小胶质细胞/巨噬细胞活化，我们对CCI损伤脑组织切片从急性期到慢性期进行了一系列组织...

脑实质内出血和神经炎症伴随脑挫伤可引发严重的继发性脑损伤。本方案详细介绍了小鼠可控性皮质冲击（CCI）模型，使研究人员能够研究出血性挫伤及创伤后免疫反应，并探索潜在的治疗方法。

脑挫裂伤是一种严重的医学问题，每年影响全球数百万人。迫切需要深入了解……

该模型可用于研究与脑挫伤相关的病理学变化，包括颅内出血、铁毒性、神经元死亡、轴突损伤、神经功能缺损以及神经炎症。该技术的主要优势在于，可通过调节CCI装置的生化参数（如撞击速度和冲击力度）来轻松控制脑损伤的严重程度。CCI诱导的局灶性皮质粉碎性损伤具有高度可重复性。正确的立体定位技术和开颅手术是产生稳定且可重复的CCI诱导性脑损伤的关键因素。通常，初次接触该操作的研究人员在将小鼠稳定于立体定位仪以及实施适当开颅手术方面会遇到困难。本操作将由本实验室的技术员林志善女士进行演示。首先确认动物对脚趾夹捏无反射，以确保其已充分麻醉。使用电推剪沿尾侧至头侧方向剃除小鼠头部毛发，但不要修剪其胡须。将小鼠置于立体定位仪上，小心地将耳杆插入耳道，确保小鼠头部被两侧耳杆均匀固定。手术期间维持1%至2%异氟烷麻醉。在双眼上涂抹凡士林，以防止手术过程中眼睛干燥。然后使用无菌棉签，先用碘伏擦拭剃净的头部皮肤，再用70%乙醇进行消毒。用31号胰岛素针头在皮下注射100微升0.25%布比卡因，并轻轻按摩注射部位以促进吸收。用手术刀或剪刀沿头皮正中线做一纵向切口。然后使用止血钳将皮肤拉向右侧。让暴露的颅骨干燥一分钟。接着用无菌棉签清除颅骨上残留的血液和组织。检查动物头部在水平面上是否平直，并确定解剖学标志点前囟（Bregma）和后囟（Lambda），用铅笔标记这两个位置。通过测量前囟（Bregma）和后囟（Lambda）的Z坐标，确保动物头部在头尾方向上保持水平。采用相同步骤对头部进行水平定位。使用31号胰岛素针头确定颅骨开窗位置。将XY轴原点设为前囟，将针头向右侧横向移动3毫米。标记此位置作为颅骨开窗部位，并用铅笔在颅骨上画出一个直径4毫米的圆圈。使用高速微型钻头沿铅笔勾勒的圆形轮廓切割，并用环钻制作一个直径四毫米的开放孔洞。用镊子取下骨瓣，并将其保存在冰冷的生理盐水中。在对脑表面施加压力以止血之前，先用生理盐水轻轻冲洗孔洞。在CCI装置上，将直径为2.5毫米的圆形撞击头调整至22.5度角。将撞击头与硬脑膜表面归零，并在控制箱上设置撞击参数：速度为4米/秒，变形深度为2毫米。随后回缩金属撞击头。释放活塞以对脑部产生撞击损伤。然后将无菌棉签置于受伤区域以止血。复位骨瓣并用牙科水泥固定。使用组织粘合剂闭合头皮。将小鼠置于清洁的恢复笼中，并在笼内放置垫料，置于加热灯下直至完全恢复。正确的立体定位技术及开颅手术操作是制备稳定且可重复的创伤性脑损伤（CCI）模型的关键因素。理想的开颅手术应在假手术脑组织中造成最小的组织学损伤。在闭合性颅脑损伤（CCI）后的第1、3、7和28天观察到脑损伤程度和胼胝体丢失的变化。此外，在CCI术后第28天，挫伤侧出现单侧脑萎缩。通过Iba1阳性激活的小胶质细胞和巨噬细胞在挫伤区域边缘的聚集，可观察到神经炎症。CCI术后第1至第7天，通过Ly76阳性染色也可检测到脑实质内出血。CCI术后第7天观察到形态破裂和完整的红细胞混合物，提示此阶段红细胞已发生裂解。这一现象与观察结果一致，即在创伤性脑损伤（CCI）后第7天至第28天，可在挫伤区域检测到三价铁的沉积。在CCI术后第3天至第28天，可在远离挫伤部位的纹状体中观察到活化的小胶质细胞和巨噬细胞，提示胼胝体和纹状体受损。该技术为研究者进一步探索脑出血诱导的神经炎症相互作用提供了途径，有助于理解出血性挫伤后免疫细胞（如小胶质细胞）的反应机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

创伤性出血挫伤和神经炎症的临床前受控皮质影响模型

本文演示了小鼠创伤性脑损伤的成熟模型——侧向液体脉冲冲击（LFP）。LFP...

侧向液体冲击：小鼠创伤性脑损伤模型

创伤性脑损伤（TBI）仍然是一个严重的健康问题。通过使用控制性皮质冲击手术模型，可以开展针对TBI的影响及潜在治疗方法的研究。...

创伤性脑损伤的可控皮层冲击模型

本方案展示了开颅小鼠创伤性脑损伤模型的建立方法，以及将体外培养的人诱导多能干细胞来源的细胞移植至损伤部位的技术。同时简要描述了对这些操作结果进行的行为学和组织学检测。...

小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源神经细胞的治疗性移植

神经递质改变是脑震荡后发生的神经功能障碍机制，并可能导致有时灾难性的长期后果。该大鼠模型结合了可实现活体神经递质定量的微透析技术，以及通过对头颈部施加快速加速和减速的落重技术，后者是人类颅脑创伤的重要因素。...

一种结合力与旋转的新型可转化脑震荡大鼠模型及活体脑部微透析技术

本文介绍了一种通过开放式颅脑控制性皮质冲击诱导小鼠创伤性脑损伤的实验方案。...

用于诱导创伤性脑损伤的可控皮层冲击小鼠模型

本方案介绍了用于表征轻度创伤性脑损伤后神经炎症和血流动力学反应的方法，并将这些数据整合到基于偏最小二乘回归的多变量系统分析中。...

创伤性脑损伤后神经炎症与血流动力学反应的系统分析

本方案描述了小鼠模型中的轻度创伤性脑损伤。具体而言，详细阐述了一步一步诱导轻度中线闭合性头部损伤的方法以及该动物模型的表征。...

小鼠轻度创伤性脑损伤的电磁控制闭合式头部模型

在此，展示了如何利用清醒状态下的闭合性头部损伤模型来研究重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）对海马突触可塑性的影响。该模型可复制r-mTBI患者的重要病理特征，并可与电生理记录、行为学检测及分子生物学分析等技术联合使用 体外...

利用清醒状态下闭合性头部损伤的轻度创伤性脑损伤模型评估突触可塑性的变化

本方案介绍了一种通过闭合性头部损伤（CHI）方法诱导的重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）小鼠改良模型。该方法采用颅骨变薄窗口结合液体打击技术，可减少因脑膜暴露所引起的常见炎症反应，同时提高了在啮齿类动物中建立rmTBI模型的可重复性和准确性。...

改良的小鼠重复性轻度创伤性脑损伤模型结合颅骨变薄窗与液体打击技术

简化的创伤性脑损伤（TBI）模型促进了治疗策略的开发。本方案概述了使用针头在小鼠大脑皮层制造刺伤损伤的方法，可用于分析出血和炎症反应。这种刺伤型TBI小鼠模型的优势在于无需特殊设备即可实施。...

用于研究创伤性脑损伤中出血与炎症的刺伤小鼠模型

学习使用小鼠控制性皮质撞击模型研究创伤性出血挫伤和神经炎症。该方案通过立体定位技术和开颅手术，精确控制撞击速度等参数，实现可重复的局灶性皮质损伤，为探索脑损伤后免疫反应及潜在治疗方法提供可靠平台。

一种用于创伤性出血性挫伤和神经炎症研究的临床前可控皮层冲击模型

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