用于植物微RNA检测和定量的RNA斑点分析
2020年7月11日
此方法演示了利用北方杂交技术从总RNA提取物中检测miRNA。
嘿，你好。所以这是一个小的RNA北方协议。它是最初由拉希德·阿克贝吉诺夫博士优化的协议的衍生物。
在这种方法中，可以非常精确、非常高分辨率地检测长度在20-24核苷酸之间的小RNA。该协议基本上是一种传统的北方分析的修改形式，但在这里，丙烯酰胺的百分比相当高，是15%。当序列已知或可用于确认来自下一代测序数据集的小RNA丰度时，该北方可用于检测已知小RNA、微RNA或其他一组小RNA。
这种方法的优点是，人们不能只看微RNA丰度，还可以看前体的丰度，例如微RNA可能留下一种前体，大约30到几百核苷酸长，这也可以同时检测，以及微RNA。该协议非常简单，非常直截了当，但在执行一些在协议末尾列出的关键步骤时，必须非常谨慎。对于制备 10 mL 凝胶混合物，加入 4.8 克尿素、3.75 mL 的 40% 丙烯酰胺溶液和 1 mL 新鲜制备的 10X TBE、pH 8.2 并轻轻混合溶液。
完全溶解尿素，在水浴中加热混合物，直到溶液看起来清晰。将体积放大到 10 mL，使用无菌的 MilliQ 水，将凝胶混合物冷却至室温。用洗涤剂清洗所需的设备，轻轻擦洗，以去除残留的TBE和丙烯酰胺。
进一步用 MilliQ 水冲洗，让其干燥。将玻璃板组装在一起，确保两者处于同一水平。把它们牢牢地放在海绵上。
将 8 微升 TEMED 和 80 微升 10% 新鲜准备的 APS 添加到凝胶混合物中。轻轻混合，将凝胶混合物倒入组装的板中。确保凝胶不泄漏。
小心地放置梳子。让凝胶聚合约 45 分钟。凝胶聚合后，从组件中取下玻璃板。
用米利克水清洗玻璃板。把它们放在运行的盒式磁带。将运行盒放在油箱内。
倒新准备的 1X TBE，pH 8.2。小心拆下梳子。通过移液缓冲液彻底清洗凝胶的孔。
此步骤从井中去除尿素沉淀物，使 RNA 易于均匀地穿过凝胶。关闭设备盖，以 80 伏特预运行空凝胶 30 分钟，以检查是否有缓冲液泄漏。对于制备10 mL的装料染料，重5毫克的布罗莫酚蓝色，5毫克的二甲醇，并加入10 mL的去氧酰胺，并混合好。
等分染料，储存在4度，供进一步使用。将总RNA的10微克分成无菌的1.5 mL管。确保RNA的质量，即
260:230 比率大于或接近 2。将管子放在 speedVac 内，真空干燥样品。将干燥的RNA样品重新悬浮在8微升的装载染料中。
将样品加热98度两分钟。在室温下冷却一分钟。涡流冷却的RNA样品，以确保在装载染料中正确重新悬浮。
旋转管子。重复加热、冷却和涡流三次的步骤，获得自由流动的RNA。停止凝胶的预运行。
在装载样品之前，彻底清洗油井，以清除井内尿素的沉积物。将重新悬浮的RNA样品在98度加热一分钟。使用毛细管尖端将热装样品放入井中。
避免引入气泡。完成所有样品的装载并组装盖子。以 80 伏运行凝胶三小时，或直到布罗莫酚蓝色完全运行。
使用带正带的尼龙膜进行传输。切入玻璃板的尺寸。在右上角标记膜。
轻轻地将膜放在无菌 MilliQ 水的表面，确保将标签侧朝下，朝向水面。拿一个干净的托盘，并准备凝胶三明治进行电传输。放下盒式磁带的灰色面。
倒 1X TBE 略高于盒式磁带的水平。在 1X TBE 中预湿纤维垫，然后挤压它以去除气泡。将两块印迹纸切成纤维垫的大小。
在 1X TBE 中预润一张印迹纸，并放在纤维垫上。通过将塑料移液器滚动到纸张上，去除气泡。在 1X TBE 中预湿另一张印迹纸，然后放在盒式磁带上。
滚过来去除气泡。现在三明治设置已准备好进行电传输。电泳完成后，停止运行，从设备上取下盖子。
从设置中删除正在运行的盒式磁带。从运行盒中拿出玻璃板。小心地从组件中取下凝胶。
将它放在印迹纸上，使第一个加载的RNA样本朝向您的右侧。将预浸泡膜轻轻浸入 1X TBE 中，并放在凝胶上，朝向标记的一侧朝下。不要让膜和凝胶干燥。
轻轻翻滚以去除气泡。在1X TBE中浸入一张印迹纸，放在膜上。清除气泡。
放置另一张印迹纸并清除气泡。通过将纤维垫放在组件上来完成三明治。牢牢合上盒式磁带。
将跨印布盒放在模块中。向油箱加注 1X TBE，pH 8.2，高达印迹标记。关闭设备盖，在 4 度或冷室中以 10 伏电压通宵传输。
在完成电传输之前，请准备好 UV 交叉链接器并将其设置为 1200。传输完成后，从模块中卸下盒式磁带。将湿膜放在 A4 片上，将标记的侧面向上放置。
通过照射将RNA与膜交叉连接，以120毫焦耳照射254纳米紫外线。交链接的印迹可以储存在四度或用于杂交。设计一个完全与必须检测的小RNA完全互补的探针。
使用 PNK 酶将探针的五个素端标记，并如图所示组合其成分。在37度下孵育反应混合物30分钟。孵育30分钟后，使用G-25柱将未标记的探头与反应混合物分离。
为了改进探头的标签，请使用前准备 G-25 列。将污点、RNA 侧朝顶放在杂交瓶内。使用前大力混合杂交缓冲区。
在杂交炉内加入10 mL的杂交缓冲液，将杂交瓶放入杂交炉内，旋转保持35度。执行 20 到 30 分钟的预杂交。预杂交后，将瓶子从烤箱中取出。
轻轻地将标记的探针添加到杂交缓冲区中。确保未产生气泡。在35度下孵育烤箱内的污点，旋转12小时。
杂交后，从瓶子中取出杂交缓冲液。使用洗涤缓冲器-I快速清洗印迹。执行此步骤以从印迹中删除多余的杂交解决方案。
使用洗涤缓冲液-I，在35度下进一步孵育印迹30分钟。使用缓冲液-II在35度下再次进行洗涤30分钟。洗涤印迹后，将其放在杂交盖内，取出多余的缓冲液并密封。
将其放在盒式磁带内，将其暴露在无辐射磷成像器屏幕上 12 小时。使用台风生物分子成像器检测杂交信号，使用 ImageJ 软件分析结果。对于将印迹与其他探头混合，请执行如图所示的剥离步骤。
通过这项技术，可以估计微RNA的丰度，以及它的长度。从此图像中，可以在所有样品中检测到微RNA 397的表达。根据下一代测序数据，在这个印迹中，样本一的丰度大约是每百万次读取 5 次，这表明我们的技术也可以检测出不太丰富的微RNA。
此外，通过使用 ImageJ 定量软件，可以量化样本中微397的表达。在这里，我们使用U6和微RNA168作为负载控制。我将讨论一些关键步骤，在进行实验时必须考虑。
确保使用优质RNA进行样品制备。真空干燥样品时，避免过度干燥。在装载染料中重新悬浮RNA至关重要。
确保准备自由流动的样品。装载凝胶时必须小心。必须清洗凝胶的孔，样品必须用一条直线装入井内。
在电传输过程中，膜在水中扩散，在浸入1X TBE之前是必不可少的，它改善了传输。必须在 35 度下进行印迹的杂交。保持杂交炉的温度。
对于反复使用印迹，膜必须储存在4度。它们应在 2X SSE 中保持潮湿。与其他基于PCR的方法不同，此方法可确保表达式的量化，以及确定微RNA的大小。
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概述
此方法演示了使用北部杂交技术来检测总RNA提取物中的miRNAs。该协议允许精确检测长度从20-24个核苷酸的小RNA。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 分子生物学
背景
- 小RNA检测对于理解基因调控至关重要。
- MicroRNA在各种生物过程中扮演重要角色。
- 传统的北部杂交技术在分辨率上有局限性。
- 此方法改进了传统技术以提高准确性。
研究目的
- 提供一种可靠的方法来检测已知的小RNA。
- 确认下一代测序数据中的小RNA丰度。
- 提高小RNA检测的分辨率。
使用的方法
- 改进的北部杂交技术。
- 高百分比丙烯酰胺凝胶（15%）以提高分辨率。
- 检测20-24个核苷酸之间的小RNA。
- 利用已知序列进行准确识别。
主要结果
- 成功以高精度检测小RNA。
- 验证了测序数据中的小RNA序列。
- 与传统方法相比，分辨率得到了提高。
- 证明了对各种小RNA类型的适用性。
结论
- 此方法对小RNA检测有效。
- 它为研究基因调控的研究人员提供了一个有价值的工具。
- 未来的应用可能包括更广泛的RNA分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate detection and quantification of microRNAs are essential for target validation in plant-based therapeutic discovery and agricultural biotechnology. This northern blot method provides high-resolution, sensitive measurement of miRNA expression and precursor stability, enabling reliable biomarker assessment and mechanistic de-risking in early discovery workflows. The approach supports predictive confidence in target selection by validating sequencing-derived hypotheses with orthogonal, quantitative data.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by confirming miRNA abundance and precursor processing from plant tissue samples.
- Operational Value: Provides size-specific detection of miRNAs and precursors, clarifying functional RNA species for pathway analysis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by validating sequencing data with orthogonal quantification, reducing false-positive target advancement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, resolution-enhanced readouts for small RNA expression, enabling reliable assay standardization across experimental conditions.
- Operational Value: Uses a simple, reproducible protocol with defined loading controls (U6, miR-168) for consistent normalization in comparative studies.
- Scalability: Compatible with downstream workflows requiring validated RNA inputs for screening or functional validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Confirms miRNA stability and abundance, supporting biomarker alignment from discovery through preclinical evaluation.
- Mechanistic De-risking: Detects precursor molecules (30–several hundred nt) alongside mature miRNAs, clarifying biogenesis and reducing ambiguity in target mechanism.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables quantification of low-abundance miRNAs (e.g., ~5 reads per million), informing go/no-go decisions based on detectable expression thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing orthogonal validation of sequencing data and enabling reliable RNA-based assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by detecting known and predicted miRNAs with high precision, clarifying expression patterns in relevant plant systems.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs with size discrimination, enabling reliable compound or condition comparison in RNA-focused screens.
- Analytics: Provides direct quantification via ImageJ analysis, allowing comparison of miRNA levels across samples using defined signal intensity metrics.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by validating both mature miRNAs and precursors, supporting biomarker consistency across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized capability for RNA quantification that can be applied across projects requiring miRNA expression confirmation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through size-specific, quantitative miRNA detection.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized gel preparation, loading controls, and hybridization conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets based on validated expression data, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by confirming target-relevant miRNA expression and precursor stability before advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, gel electrophoresis, and hybridization techniques to ensure sample integrity and signal specificity.
- Dependent on instrumentation including vertical gel apparatus, electrotransfer module, UV cross-linker, hybridization oven, and phospho-imager for detection.
- Necessitates standardization of probe labeling, hybridization buffers, and wash conditions across teams to ensure reproducible results.
- Adaptation to different plant species or tissue types may require optimization of RNA extraction quality (260:230 ratio ≥2) and loading conditions.
- Practical limitations include the need for careful RNA handling to avoid degradation and strict temperature control during hybridization (35°C) for consistent signal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:27
Step 1: Preparation of a 15% Denaturing Polyacrylamide Gel
2:03
Step 2: Assembly of the Glass Plates and Electrophresis Unit
4:13
Step 3: Preparation of Loading Dye and Samples
5:38
Step 4: Gel Electrophresis
6:33
Step 5: Preparation for Electro-blotting
10:15
Step 6: Preparation of Radiolabeled Probe
10:50
Step 7: Hybridization of the Blot
12:36
Representative Results
13:24
Conclusion
