由人诱导性多能干细胞体外诱导生成神经肌肉接头

该人类神经肌肉接头诱导系统可用于诱导突触前和突触后组分的形成，包括运动神经元、骨骼肌和施万细胞。不仅可以在单个培养皿中由单一初始细胞群体获得成熟且复杂的神经肌肉接头（NMJ）结构，而且所形成的神经肌肉接头还具有收缩能力。该方法在研究神经肌肉疾病（如脊髓性肌萎缩症）以及药物化合物筛选方面具有潜在应用价值。

已分化的神经肌肉接头是一种非常厚且复杂的组织，难以观察。通过演示该操作步骤，我们可以指导读者如何识别特定结构。在向培养皿中加入一毫升细胞解离液之前，先用三毫升磷酸盐缓冲液洗涤细胞。

在37摄氏度孵育10分钟后，向每个孔中加入3毫升灵长类胚胎干细胞培养基，轻轻吹打3次，使细胞从盖玻片上解离。接着，将含有解离干细胞的上清液收集至一个50毫升锥形管中，离心后用3毫升新鲜的灵长类胚胎干细胞培养基重悬干细胞沉淀，该培养基中添加有10微摩尔/升Y-27632 ROCK抑制剂，用于细胞计数。然后将细胞稀释至每毫升培养基（含ROCK抑制剂）中含2×10⁵个细胞的浓度，并将2毫升细胞悬液重新接种至每孔含有细胞外基质包被的六孔板中的每个盖玻片上。

24 小时后，将每孔中的上清液更换为 2 毫升新鲜的灵长类胚胎干细胞培养基，其中添加 1 微克/毫升多西环素，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养 24 小时。培养结束后，将各孔上清液更换为 2 毫升含多西环素的分化培养基，每孔均添加，然后将培养板放回细胞培养箱中继续培养 10 天。培养结束后，将各孔上清液更换为 2 毫升含多西环素的成肌分化培养基，每孔均添加，并将培养板放回细胞培养箱中再继续培养额外 10 天。

孵育结束后，将每孔上清液更换为两毫升神经肌肉接头培养基，将培养板放回细胞培养箱中继续培养30天。孵育结束后，通过倒置显微镜观察已分化的神经肌肉接头。为诱导肌管收缩，向每孔已分化的神经肌肉接头细胞中加入25毫摩尔的氯化钙。

处理后一到两分钟内，将培养板置于倒置显微镜的载物台上。利用活细胞显微成像技术，记录肌管收缩过程的20秒视频。录制结束后，在培养基中加入300纳克/毫升的筒箭毒碱，再记录20秒的视频，随后将视频文件导入适当的动力学矢量分析软件进行分析。

可通过神经丝突触结构和乙酰胆碱受体的免疫荧光染色来鉴定神经元。运动神经元可通过TUJ 1和Islet 1染色进行鉴定，而突触后肌管则可通过肌球蛋白重链染色进行鉴定。施万细胞可用S-100抗体进行标记。

在这些扫描电镜图像中，可以清晰地观察到成熟神经肌肉接头的形态，包括扩张的轴突末梢、轴突和肌纤维。透射电镜可用于观察神经肌肉组分的成熟超微结构，包括含有突触小泡的突触前轴突末梢以及由突触间隙分隔的突触后区域。连接皱褶标志着神经元与肌纤维之间的连接处。

此处显示的是含有突触小泡的成熟轴突末梢。综合这些形态学特征表明，神经-肌肉组分得到了良好诱导并已成熟。对细胞的功能评估显示，氯化钙可诱导出显著的神经-肌肉接头运动信号，且这些收缩可被筒箭毒碱阻断，证实运动神经元信号通过神经-肌肉接头传递，从而触发肌肉收缩。

细胞接种密度会影响神经肌肉接头形成的效率，可根据实验目的对本方案中的接种密度进行调整。该神经肌肉接头培养体系包含多种细胞类型，可用于研究这些细胞在神经肌肉接头发育过程中或在特定疾病病理条件下的相互作用。