从人类诱导多能干细胞诱导的体外神经肌肉结点

在这里，我们提供一个协议，从人类诱导多能干细胞（iPSCs）生成体外NMJ。该方法在1个月内可以诱导形态成熟、功能良好的NMJs。由此产生的NMJs可能用于模拟相关疾病、研究病理机制或筛选药物化合物以进行治疗。

这种人类神经肌肉结诱导系统可用于诱导突触前和后突触成分的形成，包括运动神经元、骨骼肌和施万细胞。不仅一个成熟、复杂的NMJ结构可以从单个起始细胞群体中获得单一培养皿，而且由此产生的NMJ还具有收缩能力。这种方法具有研究神经肌肉疾病的潜力，如脊髓肌肉萎缩，以及治疗性化合物筛查。

分化的NMJ是一种非常厚，复杂的组织，很难可视化。通过演示该过程，我们可以指导读者如何识别特定的结构。在将一毫升细胞分离溶液添加到培养皿中之前，用三毫升PBS清洗细胞。

在37摄氏度下10分钟后，将三毫升灵长类胚胎干细胞培养器加入到每个井中，轻轻移液三次，使细胞与盖玻片分离。接下来，将分离的含有干细胞的超级纳酸液汇集到50毫升锥形管中，用于离心，并在三毫升新鲜灵长类胚胎干细胞培养基中重新吸收干细胞颗粒，并辅以10微摩尔Y-27632 ROCK抑制剂进行计数。然后稀释细胞到两乘10至五细胞每毫升的介质补充 ROCK 抑制剂浓度，并返回两毫升细胞到每个井的细胞外基质涂层六井板的每个盖玻利落。

24小时后，用两毫升新鲜灵长类胚胎干细胞培养基，每毫升多氧环素补充一微克，将细胞培养箱返回细胞培养箱24小时。在孵化结束时，用两毫升的分化介质代替超级钠，每井辅以多氧环素，将板回细胞培养箱10天。在孵化结束时，用两毫升的致原分化介质代替超级钠，每井辅以多氧环素，将板回细胞培养箱再增加10天。

在孵育结束时，每井用两毫升神经肌肉结培养基代替超级钠，将板回细胞培养箱30天。在孵化结束时，通过倒置显微镜可视化分化的神经肌肉结。要触发 myotube 收缩，在分化神经肌肉结细胞的每个井中加入 25 毫摩尔氯化钙。

在治疗后一到两分钟内，将板放在倒置显微镜的舞台上。使用实时细胞显微镜，录制20秒的 myotube 收缩电影。在录制结束时，向培养介质中每毫升 curare 添加 300 毫微克，并在适当的运动矢量分析软件程序中打开影片文件以进行分析之前，再录制 20 秒。

神经丝合成血管和乙酰胆碱受体的免疫荧光染色可以进行，以确定神经元。运动神经元可以通过TUJ 1和岛1染色来识别，而突触后 myotube 可以通过染色来识别 myosin 重链。施万细胞可以标有S-100抗体。

在这些扫描电子显微镜图像中，通过清晰的轴孔端子、轴角和肌肉纤维的可视化，可以观察到成熟神经肌肉结的形态。透射电子显微镜可用于可视化神经肌肉成分的成熟超结构，包括带突触囊泡的预突触轴突终端和由突触裂口分离的突触后区域。交汇点褶皱标记神经元和肌肉纤维之间的交汇点。

在这里，显示包含突触囊泡的成熟轴突终端。综合起来，这些形态特征表明神经肌肉成分是诱导和成熟的。细胞的功能评估显示，突出的神经肌肉结运动信号可由氯化钙诱导，这些收缩可以通过库拉雷确认运动神经元信号通过神经肌肉结传输，以触发肌肉收缩。

细胞播种密度影响NMJ形成的效率。根据实验目的，可以修改以适应协议。这种神经肌肉结培养含有多种细胞类型，这些成分可用于研究这些细胞在神经肌肉结发育期间或针对特定疾病病理的反应之间的相互作用。