Name: 脑膜炎奈瑟菌 诱导多能干细胞来源的脑内皮细胞的感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 了解利用诱导多能干细胞来源的脑内皮细胞研究血脑屏障宿主病原体相互作用的方法。该技术使用脑膜炎奈瑟菌感染模型，为中枢神经系统感染机制研究提供人源化平台。

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L.M.E. 受 A. S-U. 负责的德国研究基金会（DFG）研究培训项目 GRK2157“用于研究人类病原体微生物感染的三维组织模型”的资助。B.J.K. 受亚历山大·冯·洪堡基金会博士后奖学金资助。此外，我们感谢 Lena Wolter 在培养 iPSC-BECs 过程中提供的技术协助。

注意：所有培养基/试剂的配制、干细胞的维持以及分化步骤均改编自 Stebbins 等人22。
1. 准备iPSC培养和BEC分化所需的材料。
<ol>
	<li>用于 IMR90-4 诱导多能干细胞培养的组织培养（TC）塑料表面基质包被
	<ol>
		<li>将基底膜基质凝胶（例如 Matrigel）分装为每份 2.5 mg，于 -20 °C 保存。 
		注意：处理基质凝胶时需迅速操作，并在冰上进行分装，因其在高于 4 °C 时会形成凝胶，一旦凝固则无法分装。</li>
		<li>进行 TC 塑料包被时，迅速将一份基质凝胶加入含有 30 mL DMEM/F12 培养基的 50 mL 锥形管中。向冷冻的基质凝胶中加入 1 mL 培养基，反复吹打直至完全解冻，立即转移至含其余培养基的 50 mL 锥形管中。</li>
		<li>每孔 6 孔板使用 1 mL 基质凝胶包被液，每瓶 T75 培养瓶使用 12 mL。 
		注意：基质凝胶包被的 TC 塑料可在使用前两周内制备。但必须避免包被液干燥，必要时可定期向孔中补充 DMEM/F12 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在生物安全柜的无菌环境中，将 50 mL 的 50x 添加剂加入 450 mL 干细胞维持基础培养基中，配制干细胞维持培养基。 
	注意：其他干细胞维持培养基（如 mTeSR 和 E8）已在其他研究中使用13,14,15, 22,23,24,25。</li>
	<li>配制 500 mL 未条件化培养基（UM）：将 392.5 mL DMEM/F12 与 100 mL 无血清替代物（KOSR）、5 mL 非必需氨基酸、L-谷氨酰胺（终浓度为 1 mM）以及 3.5 µL β-巯基乙醇混合。过滤除菌后于 4 °C 保存，最长可保存 2 周。</li>
	<li>配制 200 mL 内皮细胞（EC）培养基并添加视黄酸（RA）和 bFGF：将 198 mL 人内皮细胞无血清培养基（hESFM）、2 mL 过滤除菌的血小板贫乏血清（PDS）以及终浓度为 20 ng/mL 的 bFGF 混合。过滤除菌后于 4 °C 保存，最长可保存 2 周。在加入细胞前，向 EC 培养基中添加 10 μM RA。 
	注意：由于 PDS 已停产，供应可能受限，本方案已成功使用 B27 替代 PDS15,23,26。</li>
	<li>配制 200 mL 不含 RA 和 bFGF 的 EC 培养基：将 198 mL hESFM 与 2 mL 过滤除菌的 PDS 混合，过滤除菌后于 4 °C 保存，最长可保存 4 周。</li>
</ol>
2. IMR90-4 细胞培养的维持
注意：此处我们以 IMR90-4 细胞系为例，但其他诱导性多能干细胞系，如 CC3、CD10、CD12、DF19-9-11T、83iCTR、00iCTR 和 CS03iCTRn2，也已成功用于分化为肝胆管上皮细胞（BECs）13,14,15,16,17,23,27,28。
<ol>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下培养诱导多能干细胞（iPSCs），通常以不同密度维持在 6 孔板中，每孔加入 2 mL 干细胞维持培养基。</li>
	<li>为维持 iPSC 培养，选择一个未达到汇合状态且菌落间存在空隙的单孔进行传代。
	<ol>
		<li>吸除培养基，加入 1 mL 非酶细胞解离试剂，于 37 °C 孵育 7 分钟。在孵育期间，将新 6 孔板中的基质胶溶液替换为每孔 2 mL 新鲜的干细胞维持培养基。</li>
		<li>小心吸除非酶细胞解离试剂，注意避免吸走仍附着在板上的细胞。</li>
		<li>加入 6 mL 干细胞维持培养基，轻轻冲洗孔底数次，直至所有细胞完全脱落。随后，以不同密度接种至新的 6 孔板中，常规传代通常采用 1:6 或 1:12 的传代比例。 
		注：采用上述比例时，细胞大约每周传代两次。</li>
		<li>将培养板放入培养箱，通过前后左右轻轻摇晃培养板，使接种的细胞均匀分布于各孔中，每次交替摇晃动作之间稍作停顿，直至培养基完全静置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 人诱导性多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞
<ol>
	<li>iPSCs 分化用铺板第-3天 分化方案的）
	<ol>
		<li>每使用一个用于诱导分化的IMR90-4维持培养孔，吸除培养基，每孔加入1 mL酶解细胞解离试剂，于37 °C孵育7 min。</li>
		<li>通过将1 mL解离后的细胞悬液转移至15 mL锥形管中，并加入至少2 mL新鲜干细胞维持培养基（每1 mL细胞悬液），以中和酶法细胞解离试剂的活性。在1,500 x g 5 分钟。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于1 mL干细胞维持培养基中（每孔IMR90-4细胞），并使用血细胞计数板对细胞进行计数。 
		注意：计数时，用0.4%台盼蓝按1:1比例稀释可能有助于区分活细胞与死细胞。根据iPSC的密度，一个6孔板中的单孔通常可获得1‒2 × 106 细胞</li>
		<li>在T75培养瓶中进行分化时，加入7.5 × 105 将细胞加入12 mL干细胞维持培养基和ROCK抑制剂（Y27632二盐酸盐），终浓度为10 µM。吸除基质凝胶包被液&#160;T75 培养瓶，并将细胞悬液转移至该培养瓶中。通过前后左右轻轻摇晃培养瓶使细胞均匀分布（参见步骤 2.2.4），于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2. 
		注意：此步骤中添加ROCK抑制剂对提高解离后的单个干细胞存活率至关重要25,29细胞应均匀分布在培养瓶中，呈单细胞状态，并因ROCK抑制剂处理而表现出铺展的间充质样形态22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开启 第-2天 和 第-1天更换为新鲜的干细胞维持培养基，每瓶T75加12 mL。</li>
	<li>开启 第0天，通过更换培养基为UM开始诱导分化；每T75培养瓶加入12 mL。</li>
	<li>每日更换UM第1天 – 第5天). 
	注意：细胞在UM培养基中通常经过2至3天即可达到汇合状态，肉眼或倒置明场显微镜下均可观察到。随着分化过程的推进，nestin+ “神经纤维束”在PECAM-1染色下变得可见+ 如先前所述的中间细胞13,14.</li>
	<li>通过更换为含20 ng/mL bFGF和10 µM视黄酸（RA）的内皮细胞培养基，选择性扩增内皮细胞群体第6天）并培养两天。含bFGF的EC培养基可提前两周配制。视黄酸（RA）在使用当天从冷冻储备液中添加（例如，每1 mL EC + bFGF中加入1 µL的10 mM RA储备液）。 
	注意：在第6天和第8天不添加视黄酸（RA）的情况下，也可实现成功的分化。然而，省略RA将导致胆管上皮细胞（BECs）的跨上皮电阻（TEER）降低12,13,14.</li>
	<li>用胶原蛋白IV和纤连蛋白包被细胞培养板和膜插件（例如Transwell）第7天），用于纯化BECs及后续实验。
	<ol>
		<li>用于膜插件的包被，将4份IV型胶原蛋白（1 mg/mL溶于0.5 mg/mL乙酸）、1份纤连蛋白（1 mg/mL）和5份无菌组织级水混合。包被细胞培养板时可将ECM溶液按1:5稀释（即4份IV型胶原蛋白、1份纤连蛋白、45份水）。加入包被液后，于37 °C孵育过夜。 
		注意：培养板和膜插件也可在纯化步骤当天，于传代前至少4小时进行包被。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将已分化细胞传代培养于包被有胶原蛋白IV和纤连蛋白的培养板或膜插件上，纯化脑微血管内皮细胞（BECs）第8天).
	<ol>
		<li>吸除内皮细胞培养基，加入消化细胞解离试剂（每T75培养瓶12 mL）。于37 °C孵育，直至90%的细胞从培养瓶脱落。 
		注意：细胞解离可能需要长达1小时。</li>
		<li>孵育期间，从先前准备好的培养板/小室中移除胶原蛋白IV/纤连蛋白包被液，并在无菌操作台中让其干燥。小室干燥约需20分钟。</li>
		<li>细胞脱落后，用10 mL移液管将细胞从培养瓶中冲洗下来。反复吹打以获得单细胞悬液。 
		注意：单细胞悬液对于可靠的细胞计数和形成致密的单层细胞至关重要。</li>
		<li>在50 mL锥形管中加入至少等体积的新鲜hESFM进行稀释，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
		<li>在1,500 x g下离心10分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>用新鲜配制的 EC + bFGF + RA 重悬细胞，调整体积以获得 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的悬液6 细胞/mL，用于膜插件上的接种。加入 500 µL（1 × 106 细胞）接种于12孔插件的上室，下室加入1.5 mL EC + bFGF + RA培养基。对于24孔和48孔板的接种，将细胞悬液按1:2稀释后，分别加入500 µL（5 × 10⁵）5 细胞）和 250 µL（2.5 × 105 每孔分别接种细胞，将细胞均匀分布于孔/插件中（参见步骤2.2.4），于37 °C、5% CO₂条件下培养。2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>更换培养板/Transwell中的培养基为EC 无 bFGF 或 RA（第9天).</li>
	<li>进行感染实验、TEER 测量和免疫荧光染色，具体步骤如下所述（第10天). 
	注意：成功分化并纯化的脑微血管内皮细胞（BECs）通常在第10天达到最高的经皮电阻（TEER）值，并表达脑内皮细胞的特征性标志物，如PECAM-1（CD31）和VE-钙黏蛋白、葡萄糖转运蛋白GLUT-1、外排转运蛋白（如P-糖蛋白）以及紧密连接成分ZO-1、Occludin和Claudin-5。&#160;13,14,16,17,19,22参见Lippmann等人、Stebbins等人及其他相关研究，以获取关于分化过程中细胞类型、形态特征及细胞类型特异性标志物表达的更多细节和图像13,14,15,16,17,19,22. IMR90-4细胞在BEC分化过程不同阶段的代表性图像可参见 补充图1.</li>
</ol>
4. 跨内皮电阻（TEER）作为屏障紧密性的测量指标
注意：通常在分化第9天和第10天对膜插件进行TEER检测，以确认成功生成具有屏障功能的iPSC-BECs（图1A）。
<ol>
	<li>将上皮细胞伏特-欧姆计（EVOM）置于生物安全柜的无菌环境中，并将电极连接至EVOM。</li>
	<li>将电极浸入70%乙醇中至少5分钟进行消毒，并使其完全干燥。 
	注意：如有需要，可延长在70%乙醇中的孵育时间，或使用5%次氯酸盐溶液对电极进行去污处理。</li>
	<li>从培养箱中取出膜插件上的iPSC-BECs，并测量跨上皮电阻（TEER）。 
	注意：从培养箱取出后应尽快读取TEER值，因为温度变化可能影响TEER测量结果。</li>
	<li>通过将电极浸入培养基中来读取TEER，使较短的电极置于插件上方，较长的电极伸入环绕插件的培养基中。 
	注意：确保“镊子”尖端的电极完全被液体覆盖。如有需要，可在将培养板放回测量前轻轻倾斜孔板以实现完全浸没。</li>
</ol>
5. 免疫荧光（IF）染色以验证胆管上皮细胞表型
注意：为了验证完全分化和纯化细胞的质量，在分化过程的第10天对iPSC-BEC单层细胞进行染色，以检测脑微血管内皮细胞的特征性标志物，方法如前所述（图1B‒G）13,14,15,16,17,19,22。
<ol>
	<li>吸去培养基，用 PBS 洗涤 1 次。</li>
	<li>用预冷的甲醇在室温（RT）下固定细胞 15 分钟。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 3 次，然后在室温下用含 10% 胎牛血清（FBS）的 PBS 封闭 1 小时。</li>
	<li>吸去封闭液，加入用封闭液稀释的一抗，于 4 °C 孵育过夜。 
	注意：有关抗体的来源和稀释比例信息，请参见材料表以及 Stebbins 等人的文献22。</li>
	<li>加入用封闭液稀释的二抗前，用 PBS 洗涤 3 次，在室温下孵育 1 小时。从此步骤开始注意避光。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 2 次，然后在 PBS 中按 1:5,000 稀释加入 DAPI，在室温下染色 15 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 1 次，保留 PBS，使用荧光显微镜进行成像。</li>
</ol>
6. 细菌的制备及iPSC-BECs的感染
<ol>
	<li>在感染实验前一天（分化第9天），从冻存菌种开始接种细菌过夜培养。对于脑膜炎奈瑟菌（Nm）感染，将细菌划线接种于含5%羊血的哥伦比亚琼脂平板（血琼脂平板）上。将细菌培养物置于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。</li>
	<li>次日（第10天），通过向蛋白酶肽胨培养基（PPM）中每10 mL添加50 µL 2 M MgCl2、50 µL 2 M NaHCO3以及100 µL Kellogg补充剂，配制新鲜的PPM+培养基。使用无菌棉签从过夜培养的平板上取Nm菌落，接种至50 mL锥形管中的10 mL PPM+培养基中。于37 °C、200 rpm振荡培养1.5小时（即至细菌处于对数生长期）。</li>
	<li>在细菌培养期间，将iPSC-BECs置于24孔板或膜插件中，通过将原有培养基更换为每孔/膜插件上室400 µL新鲜EC培养基（不含bFGF或RA），为感染做准备。</li>
	<li>将细菌培养物在4000 × g条件下离心10分钟，并吸除上清液。将菌体沉淀重悬于250 µL PBS中。</li>
	<li>取部分菌悬液加入4 mL新鲜PBS中，调节OD600至0.4（约1 × 108 CFU/mL）。</li>
	<li>随后，根据所需的感染复数（MOI），将细菌用细胞培养基（EC培养基）进行稀释。 
	注：例如，当在24孔板或膜插件中感染iPSC-BECs时，为达到MOI为10，分别按1:10或1:5稀释（24孔板中每单层细胞约1 × 105个细胞）。在Nm感染前的制备过程中不加入人血清，因为先前研究发现其会对iPSC-BEC屏障表型产生不利影响（通过TEER测定评估，数据未显示）30,31。然而，Nm与iPSC-BECs之间的相互作用在有无血清条件下均不受影响（数据未显示）。</li>
	<li>向每孔iPSC-BECs中加入100 µL制备好的细菌悬液进行感染，并在所需感染时间下孵育。 
	注：当iPSC-BECs被Nm感染后，多种促炎性细胞因子和趋化因子的表达水平升高，尤其在感染8小时后最为显著，如Martins-Gomes等先前所述（图2）19。</li>
</ol>
7. 通过定量 PCR 检测先天免疫激活
注意：采用优选的 RNA 提取、cDNA 合成和 qPCR 方案，收集样品并对选定的细胞因子进行 qPCR 检测。
<ol>
	<li>7.1. 在分化方案的第10天，使用市售RNA提取试剂盒中的试剂（参见材料表），收集感染后的BEC样本RNA。 
	&#8203;注意：为避免样本受到核酸酶污染，请在清洁且经过灭菌的环境中谨慎操作。
	<ol>
		<li>配制裂解缓冲液，并向每孔/iPSC-BEC单层细胞中加入350 µL。</li>
		<li>通过反复吹打（例如20次）收集样本，并将悬液转移至无菌微量离心管中。 
		注意：样本可在-80 °C下保存，直至进行RNA提取。</li>
		<li>按照RNA提取试剂盒提供的说明书，对培养细胞和组织样本进行RNA纯化。</li>
		<li>用无核酸酶水洗脱后，将RNA样本置于冰上，以尽量减少可能的RNase活性。</li>
		<li>使用分光光度计（例如Nanodrop）测定RNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用cDNA合成试剂盒（参见材料表）从所收集的RNA生成cDNA文库。
	<ol>
		<li>根据cDNA合成试剂盒说明书中的要求，设置反应体系，包含cDNA合成预混液、至少200 ng（理想为500 ng）的样本RNA以及无核酸酶水，总体积固定。</li>
		<li>在标准热循环仪上运行适合所用cDNA合成试剂盒试剂的程序。例如：25 °C孵育2分钟，55 °C孵育10分钟，95 °C孵育1分钟。</li>
		<li>cDNA合成完成后，用无核酸酶水将cDNA稀释至最多1:10，并将样本转移至4 °C短期保存或-20 °C长期保存。 
		注意：若RNA浓度较低（例如低于50 ng），可能需要更低的稀释倍数。稀释后的cDNA可在-20 °C下保存长达一年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对cDNA样本进行qPCR检测，靶向检测细胞因子和趋化因子等先天免疫应答基因的转录本，引物需经过精心设计和验证。 
	注意：由于引物设计对qPCR结果质量至关重要，应通过梯度稀释实验测试引物扩增效率，并通过DNA凝胶电泳确认无非特异性扩增产物。
	<ol>
		<li>每25 µL反应体系中，加入0.5 µL正向引物和0.5 µL反向引物（10 mM，溶于无核酸酶水中），1 µL cDNA，10.5 µL无核酸酶H2O，以及12.5 µL qPCR预混液。</li>
		<li>在qPCR仪上运行以下循环程序：(a) 4 °C孵育2分钟；(b) 95 °C预变性15分钟；(c) 95 °C变性15秒；(d) 60 °C退火/延伸1分钟；循环步骤(c)和(d)共45次；(e) 可选熔解曲线分析：30‒99 °C，每1 °C递增；最后25 °C孵育5分钟。</li>
		<li>数据分析时，采用ΔΔCT法将细胞因子和趋化因子的表达水平与参考看家基因（如18S或GAPDH）进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Alimonti, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+crosses+an+in+vitro+human+blood+brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model.</a> Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).</li>
<li>Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Models+for+Studying+the+Interaction+of+Neisseria+meningitidis+with+Human+Brain+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neisseria+meningitidis%3A+Methods+and+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).</li>
<li>Kim, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+induction+of+Snail1+contributes+to+blood-brain+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

建立BECs和BBB模型一直面临挑战，因为原代和永生化的人BECs， 体外，往往缺乏强健的屏障表型。人类的出现&#160;干细胞技术已经&#160;允许生成&#160;由iPSC衍生的类BEC细胞&#160;保留预期的标志性特征&#160;血脑屏障表型，例如&#160;内皮标志物，紧密&#160;连接表达，屏障&#160;性质，对其他因素的响应&#160;中枢神经系统细胞类型及功能&#160;外排转运蛋白12,13,14,15, 22, 24, 25这使得研究人员能够利用BECs 体外 高度模拟 体内 脑微血管内皮细胞（BE...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1 
Sarah F. Hathcock2 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

血脑屏障（BBB）和脑膜血液-脑脊液屏障（mBCSFB）是极为紧密的细胞屏障，可将循环系统与中枢神经系统（CNS）分隔开来，主要由高度特化的脑内皮细胞（BECs）构成1,2。BECs共同通过调控营养物质和代谢废物进出大脑来维持大脑正常的稳态，同时阻止多种毒素、药物和病原体进入1,2。当血源性细菌能够与BECs构成的屏障相互作用并穿透该屏障引发炎症时，就会发生细菌性脑膜炎。Neisseria meningitidis（Nm，脑膜炎奈瑟菌）是一种革兰氏阴性菌，可在10‒40%健康个体的鼻咽部定植，但在某些情况下可引起严重的全身性疾病3。在感染者体内，Nm可进入血流，导致暴发性紫癜，并可穿透BECs进入中枢神经系统，引发脑膜炎3。Nm是全球细菌性脑膜炎的主要致病菌之一，尽管已有疫苗投入使用，它仍是脑膜炎的主要病因之一4。现代医学干预手段（如抗生素治疗）已使这些疾病具备可治愈性，但罹患脑膜炎的患者往往遗留永久性神经功能损伤5,6。
先前的研究已鉴定出参与脑膜炎奈瑟菌与脑内皮细胞相互作用的细菌因子和宿主信号通路7,8,9,10,11已针对多种BEC模型开展了对黏附素和侵袭素（如Opc不透明蛋白、IV型菌毛）以及受体（如CD147）的研究。 体外，然而这些模型缺乏许多血脑屏障（BBB）的关键特性7,9,11,12对Nm-BEC相互作用的完全理解仍然不明确，部分原因在于无法利用 体内 模型、疫苗接种保护不完全以及缺乏可靠的人类支气管上皮细胞模型 体外.
模拟人脑内皮细胞 体外 由于脑微血管内皮细胞（BECs）具有独特的特性，研究其功能一直具有挑战性。与外周内皮细胞相比，BECs 具有多种表型特征，可增强其屏障功能，例如因复杂的紧密连接而表现出较高的跨内皮电阻（TEER）12一旦脱离脑微环境，脑微血管内皮细胞会迅速丧失其屏障特性，从而限制了原代或永生化细胞的应用价值 体外 仅形成弱屏障的模型12,13人类对脑膜炎奈瑟菌（Nm）感染的特异性，以及缺乏可靠的 体内 模型及人类BECs建模的挑战 体外 对Nm与BECs之间复杂的宿主-病原体相互作用需要更佳的模型来加以理解。最近利用人源性模型&#160;诱导性多能干细胞&#160;(iPSC) 技术 类BEC样&#160;细胞已从&#160;更接近脑内皮细胞的诱导多能干细胞&#160;体内12,13,14,15iPSC-BECs 具有人源性，易于扩增，且相较于原代或永生化细胞，表现出预期的胆管上皮细胞表型12,13,14,15此外，我们及其他研究者已证明，iPSC来源的BECs可用于模拟多种中枢神经系统疾病，例如宿主-病原体相互作用、亨廷顿病以及导致艾伦-赫恩登-达德利综合征的MCT8缺乏症。16,17,18,19,20,21在此，我们演示如何从可再生的iPSC来源衍生iPSC-BECs，以及利用Nm感染iPSC-BECs后引发的先天免疫反应激活过程。我们认为，该模型有助于研究在其他系统中难以重现的宿主-病原体相互作用 体外 模型，且在研究与人类特异性病原体（如脑膜炎奈瑟菌，Nm）的相互作用时尤为有用。

<table><tbody><tr><td>Accutase (1x)</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td>酶解细胞解离试剂</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>全反式维甲酸（RA）</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31（PECAM-1）</td><td>赛默飞世尔科技（Labvision）</td><td>RB-10333</td><td></td></tr><tr><td>抗紧密连接蛋白-5</td><td>Invitrogen</td><td>4C3C2</td><td></td></tr><tr><td>抗Glut-1</td><td>赛默飞世尔科技（Labvision）</td><td>SPM498（MA5-11315）</td><td></td></tr><tr><td>抗闭合蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>抗VE-钙黏蛋白</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52751</td><td></td></tr><tr><td>抗ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>33-9100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto蛋白胨</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>默克（Sigma-Aldrich）</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板和培养瓶</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机（Heraeus Megafuge 1.0R）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>Nuaire</td><td>NU-437-400E</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱（DHD Autoflow CO2 气套式培养箱）</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>哥伦比亚琼脂 + 5% 羊血</td><td>生物梅里埃</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell 聚酯膜小室（12 孔或 24 孔）</td><td>康宁</td><td>3460, 3470</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>默克（Sigma-Aldrich）</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>上皮细胞伏特-欧姆计（Millipore ERS-2）配STX电极</td><td>默克（密理博）</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>ROTH</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜（Eclipse Ti）</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（Neubauer）</td><td>A. Hartenstein</td><td>ZK06</td><td></td></tr><tr><td>人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>人内皮细胞无血清培养基（hESFM）</td><td>Gibco</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜（Wilovert）</td><td>洪德（Will Wetzlar）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 细胞</td><td>WiCell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kellogg's 补充剂</td><td></td><td></td><td>要配制 110 ml Kellogg 补充剂，需准备 100 ml 含 4 g/ml 葡萄糖、0.1 g/ml 谷氨酰胺和 0.2 mg/ml 硫胺素焦磷酸的溶液，以及 10 ml 5 mg/ml Fe(NO₃)₃ 溶液。&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 混合溶液，过滤除菌，分装后于 -20 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>敲除血清替代物（KOSR）</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（GlutaMAX）</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix 试剂盒</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>cDNA合成试剂盒</td></tr><tr><td>基质胶基质</td><td>康宁</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>ROTH</td><td>4627.5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ROTH</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器（Research Plus）</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>ROTH</td><td>6329</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA 提取试剂盒</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td>RNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>移液器助吸器（Accu-Jet Pro）</td><td>品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血小板贫乏血浆来源血清（PDS）</td><td>Fisher</td><td>50-443-029</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>应用生物系统公司</td><td>A25742</td><td>qPCR预混液</td></tr><tr><td>qPCR薄膜（MicroAmp光学粘性薄膜）</td><td>应用生物系统公司</td><td>4211971</td><td></td></tr><tr><td>qPCR板（MicroAmp Fast 96孔板）</td><td>应用生物系统公司</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂，Y27632二盐酸盐</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR扩增仪（StepOnePlus）</td><td>应用生物系统公司</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemFlex 基础培养基 + 50 倍 StemFlex 添加剂</td><td>Gibco</td><td>A3349401</td><td>干细胞维持培养基</td></tr><tr><td>水平转子（Heraeus #2704）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸硫胺素</td><td>Sigma</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-033</td><td>非酶解细胞解离试剂（EDTA）</td></tr></tbody></table>

neisseria meningitidis 感染诱导性多能干细胞来源的脑微血管内皮细胞

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

流行性脑脊髓膜炎是一种危及生命的感染性疾病，当脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，简称Nm）穿透高度特化的脑内皮细胞（BECs）进入中枢神经系统（CNS）时即可发生。由于Nm是仅感染人类的病原体，缺乏可靠的体内模型系统，使得研究Nm与BEC之间的宿主-病原体相互作用具有挑战性，因而迫切需要建立一种能够模拟天然BEC的人源模型。与外周内皮细胞相比，BEC具有更强的屏障特性，表现为复杂的紧密连接结构以及较高的跨内皮电阻（TEER）。然而，许多体外模型（如原代BEC和永生化BEC）在脱离天然神经微环境后，要么缺乏屏障特性，要么会迅速丧失这些特性。近年来人类干细胞技术的进步已开发出从诱导性多能干细胞（iPSCs）分化获得类脑内皮细胞的方法，相较于其他体外人源模型，该方法能更准确地模拟BEC的表型。利用iPSC来源的BEC（iPSC-BECs）来建模Nm与BEC的相互作用，其优势在于使用了具有BEC屏障特性的真正人类细胞，可用于研究屏障破坏、先天免疫激活以及细菌与细胞的相互作用。本文将展示如何从iPSCs分化获得iPSC-BECs，并介绍细菌制备、感染过程及样本采集分析的方法。

本文所述方案改编自 Stebbins 等人的研究，重点介绍将诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为具有血脑屏障（BBB）特性的类脑内皮细胞的方法，以及如何利用 iPSC-BECs 模型开展脑膜炎奈瑟菌（Nm）感染研究19,22。iPSC-BECs 在正确分化后，可形成紧密的屏障结构，其跨内皮电阻（TEER）通常高于 2000 Ω·cm2，并表达内皮细胞标志物，如 VE-钙黏蛋白和 CD31（PECAM）（图 1A‒C）。此外，它们还表达并定位紧密连接蛋白标志物 Claudin-5、Occludin 和 ZO-1（图 1D‒F），以及 Glut-1 等转运蛋白（图 1G）。在感染 Nm 后，iPSC-BECs 会通过上调中性粒细胞趋化性促炎细胞因子作出反应，q...

本文所述方案重点介绍了诱导多能干细胞分化为类脑内皮细胞的主要步骤、用于感染的脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）的制备，以及用于其他分子分析的样本采集。

Neisseria meningitidis 感染诱导性多能干细胞来源的脑微血管内皮细胞

流行性脑脊髓膜炎是一种危及生命的感染性疾病，当脑膜炎奈瑟菌（脑膜炎球菌，Nm）侵入中枢神经系统时即可发生……

本方案展示了利用iPSC衍生的类脑内皮细胞，在能够更真实地模拟体内脑内皮细胞的模型中，研究血脑屏障（如软脑膜血液-脑脊液屏障）处的宿主-病原体相互作用。由于建模存在局限性，体外检测脑内皮细胞屏障特性及其与人类特异性病原体的相互作用具有挑战性。iPSC衍生的脑内皮细胞在这些应用中尤为有用，因其具有更优越的屏障表型，且来源于人类。将诱导性多能干细胞（iPSCs）在六孔板中培养，置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下，每孔加入2毫升干细胞维持培养基。传代细胞时，吸去未达到完全汇合的孔中的培养基，加入1毫升非酶细胞解离试剂，然后将培养板在37摄氏度孵育7分钟。同时，将新的六孔板中每孔的基质凝胶溶液更换为两毫升新鲜的干细胞维持培养基。吸取细胞解离试剂时，注意不要吸走仍附着在培养板上的细胞。用六毫升干细胞维持培养基冲洗孔底，直至所有细胞完全脱离。将新六孔板以不同的密度接种，通常为1到6，或正常传代时为1到12。前后左右轻轻摇动培养板，交替摇动之间稍作停顿，直至培养基稳定。随后放入培养箱中。向每个孔中加入一毫升酶法细胞解离试剂，将培养板置于37摄氏度孵育七分钟。为灭活细胞解离试剂，将一毫升细胞悬液转移至含有至少两毫升新鲜干细胞维持培养基的15毫升离心管中。在1500 ×g 条件下离心五分钟，沉淀细胞悬液。然后将细胞沉淀重悬于1毫升干细胞维持培养基中，并用血细胞计数板计数细胞。将7.5 × 10⁵个细胞重悬于12毫升干细胞维持培养基和10 µM ROCK抑制剂中。吸出T75培养瓶中的基质，将细胞悬液转移至该培养瓶中。轻轻摇动培养瓶以分散细胞，然后将其放入培养箱中。在接下来的两天内每天更换培养基，以去除ROCK抑制剂并促进干细胞集落的生长。第三天，将培养基更换为未条件培养基，开始诱导分化。在接下来的五天内每天更换培养基。诱导分化开始六天后，更换为含20纳克/毫升bFGF和10微摩尔视黄酸的内皮细胞培养基（EC培养基），以选择性扩增内皮细胞群体。将细胞继续培养两天。根据文稿说明配制 IV 型胶原蛋白和纤连蛋白溶液，并用其包被细胞培养板和膜插件。吸除细胞的内皮细胞培养基，加入 12 毫升细胞解离试剂。将培养瓶在 37 摄氏度孵育，直至 90% 的细胞脱落。孵育期间，从先前准备好的培养板和插入式培养小室中移除包被液，并在无菌操作台中使其干燥。待细胞脱落后，使用10毫升移液管制备单细胞悬液。将细胞转移至50毫升离心管中，并加入等体积的人内皮细胞无血清培养基进行稀释。然后使用血细胞计数板对细胞进行计数。在1500 ×g条件下离心10分钟，收集细胞沉淀。随后将细胞重悬于新鲜配制的含bFGF和视黄酸的EC培养基中，调整细胞浓度至每毫升200万个细胞。向12孔插件的上室加入500微升细胞悬液，下室加入1.5毫升培养基。将细胞均匀分布于插件上，于37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养。次日，更换为不含

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

脑膜炎奈瑟菌 诱导多能干细胞来源的脑内皮细胞的感染

本方法描述了如何从小鼠脑组织中分离并永生化微血管内皮细胞。我们介绍了一套从脑组织匀浆、消化处理、细胞接种到细胞永生化的逐步实验方案。通常需要约五周时间获得均一的、可永生化的微血管内皮细胞系。...

建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为 体外 血脑屏障模型

本视频展示了一种诱导诱导性多能干细胞分化为脑内皮细胞的实验方案。...

由诱导性多能干细胞生成脑微血管内皮细胞

本视频展示了一种将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为脑微血管内皮细胞的多步骤过程。所获得的分化细胞在特性上高度模拟脑微血管内皮细胞，具有紧密连接结构，是研究脑部疾病的理想模型。...

将人诱导性多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞

来源：Parajuli, B., et.al. 通过无创经鼻途径将人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞移植到免疫活性小鼠脑内。 J. Vis. Exp.

经鼻移植人诱导性多能干细胞来源的小胶质细胞至小鼠脑内

本文介绍了我们已建立的利用仙台病毒将人类体细胞重编程为无外源基因的人类诱导多能干细胞的方法，该方法具有稳定的结果和更高的效率。...

利用仙台病毒高效制备人诱导性多能干细胞

关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

靶向脑内常驻细胞进行直接谱系重编程为脑修复提供了新的前景。本文介绍了一种从成人人类大脑皮层制备富含脑内常驻周细胞的培养物，并通过逆转录病毒介导的转录因子 Sox2 和 Ascl1...

将成年人大脑中周细胞来源的细胞进行谱系重编程转化为诱导性神经元

本文介绍了一种通过成年小鼠小脑延髓池途径感染以诱导脑膜炎奈瑟菌性脑膜炎的方法。我们提供了一个从接种物制备到小脑延髓池感染的脑膜炎奈瑟菌感染逐步实验方案；随后记录动物存活情况，并评估小鼠组织中的细菌载量。...

通过小脑池注射诱导小鼠C群脑膜炎球菌性脑膜炎

我们介绍一种采用针尖弯曲的颅池内注射技术，该针可固定于颅骨上，从而避免对下方实质组织造成损伤。该方法可用于软脑膜细胞的遗传谱系示踪和操作，以及脑脊液流动的追踪研究。...

通过小脑延髓池注射诱导软脑膜细胞修饰

本方案详细描述了一种改进的方法，用于诱导人诱导性多能干细胞分化，从而获取、扩增并冻存脑微血管内皮细胞，并用于研究血脑屏障特性的体外模型 离体...

从人诱导性多能干细胞中衍生、扩增、冷冻保存及表征脑微血管内皮细胞

本文介绍的实验方案允许通过鼻腔途径将诱导多能干细胞来源的人小胶质细胞（iPSMG）移植到免疫功能健全的小鼠脑内。文中展示了细胞的制备与鼻腔移植方法，以及为维持iPSMG存活而给予细胞因子混合物的操作步骤。...

通过无创经鼻途径在免疫功能健全小鼠脑内移植人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞

在此，我们介绍一种扩展的内皮细胞培养方法（EECM），该方法可诱导多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞（BMEC）样细胞。这些细胞表达内皮细胞黏附分子，因此可作为研究免疫细胞相互作用的人源血脑屏障模型。...

人诱导性多能干细胞向具有成熟免疫表型的脑微血管内皮样细胞的分化

了解利用诱导多能干细胞来源的脑内皮细胞研究血脑屏障宿主病原体相互作用的方法。该技术使用脑膜炎奈瑟菌感染模型，为中枢神经系统感染机制研究提供人源化平台。

Neisseria meningitidis 感染诱导性多能干细胞来源的脑微血管内皮细胞

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