实时测量核苷酸与完整功能性膜蛋白的结合

由于ATP是一种重要的细胞信使，我们开发了一种方法，使我们能够高精度地测量ATP与其受体的结合。在核苷酸衍生物和荧光标记蛋白之间使用FRET可以实时监测核苷酸与完整功能受体的结合，并具有出色的空间分辨率。我们使用这种方法来了解细胞代谢对ATP敏感钾通道的影响，这与某些形式的糖尿病有关。

要进行无顶膜实验，首先使用一对镊子从带有转染细胞的盖玻片上破碎一个小片段，并用PBS冲洗片段。如果盖玻片预先涂有聚赖氨酸，则将片段放在含有两毫升PBS的35毫米培养皿的底部，并将三毫米探针超声仪放在样品上方三到五毫米处，以50瓦和20至40%的振幅脉冲200至500毫秒以揭开细胞的顶部。如果盖玻片没有预涂，用PBS冲洗后，将片段浸入含有0.1%聚-L-赖氨酸的管中约30秒，然后如图所示进行短暂的超声处理。

将超声处理的片段转移到装有两毫升浴液的有盖玻璃底部35毫米培养皿中，并将培养皿安装到配备高数值孔径60倍水浸物镜的倒置显微镜上。检查显微镜的相机端口是否与高灵敏度CCD相机串联到光谱仪，并使用蠕动泵以每分钟0.5至1毫升缓冲液的流速向浴室注入缓冲液。要鉴定表达ANAP标记通道的无顶膜片段，请查看样品以定位具有荧光通道的膜。

在显微镜上的相机端口和光谱仪之间部分接合光谱仪掩模。蒙版的阴影将出现在相机图像上。获取无顶膜的明场和荧光图像，以便选择感兴趣的区域进行分析。

使微量灌注系统的尖端靠近无顶膜。要获得ANAP荧光的图像，请用385纳米LED通过390/18纳米带通激发滤光片和416纳米边缘二向色性激发膜，通过400纳米长波通发射滤光片收集发射光。接合光谱仪掩模并确保发射的光通过。

将感兴趣区域与光谱仪掩模的狭缝对齐。接合光谱仪光栅。光栅就位后，光谱仪衍射的光将被投射到CCD相机的芯片上，以产生光谱图像。

影像将在 Y 维度上保留空间信息。X 维度将替换为波长。在灌注无核苷酸缓冲溶液的同时，获得一次或多次0.1至10秒的暴露，以便对实验其余部分收集的数据进行下游校正和归一化。

接下来，在浴液中应用一系列TNP ATP浓度以建立浓度响应曲线，灌注每种溶液至少一分钟以确保达到稳定状态并获得每种浓度的暴露。每次浓缩后，在获取处理后曝光图像之前，用无核苷酸浴溶液冲洗TNP ATP至少一分钟。要进行膜片钳荧光实验，首先将贴片移液器从厚壁硼硅酸盐玻璃毛细管中拉出至1.5至2.5兆欧的电阻，当填充移液器溶液时。

接下来，将带有转染细胞的盖玻片转移到含有两毫升浴液的玻璃底部35毫米培养皿中，并将培养皿安装到倒置显微镜上。用浴液灌注浴室，并鉴定表达ANAP标记通道的细胞。对贴片移液器施加温和的正压，并将移液器放入浴室中。

将移液器压在细胞膜上并轻轻抽吸以达到千兆欧密封。要切除贴片，请迅速将移液器支架从贴片细胞上移开。将贴片移液器的尖端靠近灌注系统的尖端，并检查贴片是否在光谱仪面罩的狭缝内。

然后应用 TNP ATP 并收集图像光谱。在这些图像中，可以观察到来自HEK293T细胞的典型无顶膜片段，该细胞表达用橙色荧光蛋白标记的ATP敏感钾通道。在这张暴露于五微摩尔TNP ATP的HEK293T细胞的无顶膜中ANAP标记的ATP敏感钾通道的光谱图像中，可以观察到两个高强度区域，对应于ANAP和TNP ATP的峰值发射。

通过从平均感兴趣区域光谱中减去平均背景光谱，可以获得最终光谱。在这里，可以观察到多次曝光后ANAP峰值荧光的降低。在没有TNP ATP的情况下，多次暴露的峰值荧光拟合到单个指数衰减。

然后使用这些数据来纠正光漂白伪影。这里显示了来自在不存在和存在TNP ATP的情况下表达ANAP标记的ATP敏感钾通道的细胞获得的无顶膜的代表性光谱图像。观察校正后的发射光谱揭示了供体和受体荧光发射之间的明显分离。

在该图中，显示了来自典型膜片钳荧光测定实验的ANAP标记ATP敏感钾通道的代表性电流和光谱。对发射光谱进行背景和漂白校正，如无顶膜所示。小心使用对照，以验证荧光信号是否特定于您的受体。

确保您的大量内容快速、高效和完整，并保持尽可能短的曝光时间。该方法回答了有关受体占用及其与功能的关系的问题。与类似设置一起使用的其他FRET技术可以探测配体诱导的受体确认变化。