功能性与极化胆囊肿的生成与定量特征
May 16th, 2020
三维（3D）细胞系统是研究器官生成的相关模型。提出了一种基于水凝胶的胆囊肿产生及其表征方法。该协议通过一种简单可靠的方法来评估囊肿形成效率、尺寸并测试其功能，解开了 3D 表征的障碍。
这是生成胆道囊肿的第一个协议，提供系统分析，允许随着时间的推移评估囊肿的形成、效率和大小。此方法允许对上皮囊肿形成进行定量评估，并使得可以评估这一过程作为上皮细胞或水凝胶类型的函数。由于胆道疾病的治疗选择有限，该协议为标准化药物研究、确定正常的治疗靶点和了解疾病机制打开了大门。
简单的方法可以解决管状结构领域生物工程中新信息机制的重要问题。在开始实验之前，在4摄氏度下解冻适当的水凝胶溶液，并在零下20摄氏度的一夜之间解冻预冷移液器尖端和8井室滑动。第二天早上，将水凝胶和八井室滑轨放在冰上，在冷普通大鼠胆囊细胞完整介质中加入适当体积的水凝胶，获得500微升40%水凝胶溶液。
然后使用冷移液器尖端将 50 微升水凝胶溶液添加到腔室滑轨的每个井的中心，并使用移液器尖端将溶液尽可能均匀地铺在井底的整个表面上，而不会产生气泡。为准备实验细胞，当水凝胶聚合时，用预热的PBS清洗70%汇合正常大鼠胆血管细胞培养中的细胞，并在细胞培养培养箱中用5毫升新鲜预加热PBS孵育细胞20分钟。在孵育结束时，用一毫升预加热的 Trypsin-EDTA 更换PBS，将烧瓶返回细胞培养箱5至10分钟。
当细胞分离时，用四毫升预热完全正常的大鼠胆黄细胞介质中和反应，将细胞转移到15毫升管中离心。然后将颗粒重新悬浮在五毫升预热介质中，并通过 40 微米滤株将细胞过滤到 50 毫升管中进行计数。要产生囊肿，将适当体积的水凝胶加入冷完全正常大鼠胆囊细胞介质中，在1，600微升的介质中获得1，600微升的80%水凝胶溶液，并将细胞稀释至每毫升冷完全正常大鼠胆细胞介质浓度的5倍至第5个细胞。
立即混合细胞和水凝胶细胞溶液，并在水凝胶涂层室滑轨的每个井中加入400微升的细胞，注意避免气泡。为确保获得可重复和显著的结果，请务必小心处理水凝胶，并彻底混合初始细胞氢溶液，以获得均质溶液。当所有细胞都播种后，将幻灯片放在细胞培养箱中。
在培养两天后，从每一个井的一角取出250微升的介质，注意不要冲洗水凝胶，并慢慢用250微升的新鲜培养基取代废弃的下一杯。对于囊肿成像，在适当的培养日，在配备图像采集软件的相位对比度显微镜上选择 10 X 目标，打开白灯并选择亮场成像选项。选择播放以打开相机并聚焦囊肿领域。
设置曝光时间并打开自动捕获文件夹窗口，以允许自动保存图像。打开捕获 Z 系列窗口，重置默认位置，并使用 Z 形螺钉定义 Z 堆栈的顶部和底部平原，根据目标和分辨率级别调整 Z 步数。然后单击"立即运行"以启动采集。
映像后，打开斐济的 Z 堆栈。要复制堆栈，请单击图像、重复和复制堆栈。若要从重复的堆栈创建最小强度投影，请在图像菜单下选择堆栈和 Z 项目。
选择投影类型的最小强度，然后单击"确定"。要从投影中减去背景，请在过程菜单下选择减去背景并选择 500 像素的滚动球半径和浅色背景，以使囊肿比背景更对比度。要测量近似囊肿直径，请缩放目标囊肿，选择直线工具，然后按键盘上的 T 按钮。
在最终投影上绘制一条穿过每个囊肿直径的线。为每个囊肿创建的下一个感兴趣区域将添加到兴趣管理器区域。计算所有囊肿后，单击 Z 堆栈窗口以选择它，然后单击"全部显示"以查看计数囊肿。
沿 Z 堆栈移动光标，检查每个图像中是否计算了所有囊肿，并尽可能向兴趣管理器区域添加新囊肿。计算所有囊肿后，选择感兴趣区域集并单击更多并保存以保存数据。要确定每个囊肿的大小，在仍选择感兴趣区域时，请单击"度量"。
将显示一个窗口，列出每个囊肿及其估计大小。然后以 CSV 格式保存数据。如所证明，记录囊肿的数量和它们各自的大小随着时间的推移，可以分析囊肿的形成和生长的演变。
起始细胞组和10天大囊肿的可行性可以通过活体/死染色来评估。死亡细胞在第10天占细胞总数的不到3%，大多以分离细胞或小聚集物形式位于囊肿之外，尽管在一些大囊肿中观察到一些坏死细胞碎片堆积。与氟化物和霍奇斯特的孵化允许评估氟化物从基底到腹腔发光空间的形成和分泌。
值得注意的是，使用多药耐药抑制剂进行预处理抑制氟雷丝素的分泌，表明流明中荧光氟素的积累是由于通过耐多药的运输器分泌的，而不是从细胞间空间泄漏的。E-cadherin表达的染色显示，正常的大鼠胆血管细胞在水凝胶中保持其上皮表型至少10天。在准备供免疫荧光评估的囊肿时，在饱和期间将牛血清白蛋白保持在0.1%或更少是保持囊肿完整性的关键，因为较高的浓度会导致囊肿缩回和流明崩溃。
隔夜水凝胶、解冻、移液器尖端和腔室滑动记录、在冰上工作以及均匀地将同源细胞水凝胶混合物均匀地扩散到培养室滑轨上，都是实验成功的关键。此方法可用于产生来自其他上皮细胞或水凝胶的囊肿，从而可以比较，从而更好地了解上皮极化。这种定量方法可用于测试药物或基因突变对胆道功能和器官生成的影响。
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概述
本协议介绍了一种基于水凝胶的方法，用于生成胆管囊肿，便于在三维细胞系统中研究器官发生。它允许对囊肿形成、效率和尺寸随时间的变化进行系统分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物工程学
- 细胞生物学
背景
- 胆道疾病的治疗选择有限。
- 了解囊肿形成可以帮助识别治疗靶点。
- 三维细胞系统对于研究器官发生相关。
- 本协议解决了三维特征化中的障碍。
研究目的
- 标准化与胆管囊肿相关的药物研究。
- 评估囊肿形成与上皮细胞或水凝胶类型的关系。
- 了解与胆道疾病相关的疾病机制。
使用的方法
- 在4°C下解冻水凝胶溶液。
- 在-20°C下将移液器吸头和培养室幻灯片过夜预冷。
- 将水凝胶与胆管上皮细胞培养基结合，创建40%的水凝胶溶液。
- 随时间定量评估囊肿形成。
主要结果
- 使用水凝胶方法成功生成胆管囊肿。
- 定量评估囊肿形成效率和尺寸。
- 根据细胞类型和水凝胶获得囊肿功能性的洞见。
- 有潜力解决生物工程学中的重要问题。
结论
- 本协议提供了一种可靠的囊肿生成方法。
- 它为胆道疾病和治疗开发研究开辟了新途径。
- 方法标准化可以增强对疾病机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized, quantitative assessment of cyst formation efficiency and growth kinetics in 3D cholangiocyte cultures, addressing a critical gap in reproducible biliary organoid modeling. By capturing vertical heterogeneity and functional readouts over time, it supports mechanistic de-risking in biliary target validation and preclinical disease modeling. The method enhances predictive confidence for evaluating epithelial polarity and secretory function, facilitating cross-system comparisons in drug discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying cyst formation as a function of epithelial cell type or hydrogel composition.
- Operational Value: Provides reproducible kinetics data to support functional target validation and pathway clarification in biliary biology.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating comparable efficiency metrics across matrices and cell lines for de-risking mechanistic assumptions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized biological systems with quantifiable outputs for downstream compound screening in biliary disease models.
- Reproducibility: Uses Z-stack analysis to minimize heterogeneity from hydrogel polymerization, improving data consistency across experiments.
- Scalability: Compatible with multi-well chamber slides, enabling parallel testing of drug or genetic perturbations on cyst formation and size.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cholangiocyte polarization and secretory function, aligning with pathophysiological mechanisms in biliary disorders.
- Translational Continuity: Links discovery-stage cyst formation metrics to preclinical validation via functional assays like Fluorescein secretion and E-cadherin staining.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables evaluation of drug effects on biliary function and organogenesis, supporting go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, providing standardized 3D readouts for biliary epithelial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by quantifying cyst formation efficiency over a 10-day time course.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cyst populations with measurable size and polarity outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables comparison of cyst number, diameter, and secretory function across conditions using Z-stack imaging and minimum intensity projections.
- Translational Research: Connects in vitro cyst maturation to preclinical relevance through functional readouts like apical-basal Fluorescein transport.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for comparing epithelial cell behaviors across hydrogels, cell types, and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epithelial polarization and cyst formation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled hydrogel handling, Z-stack quantification, and optimized immunostaining protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage go/no-go decisions based on quantitative biliary organoid performance.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of biliary targets through comparable, time-resolved cyst formation and growth data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, hydrogel handling, and confocal or widefield microscopy with Z-stacking capability.
- Dependent on temperature-controlled equipment for hydrogel polymerization and pre-cooled tools to ensure uniformity.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters (Z-step, exposure, projection type) for consistent cyst quantification.
- Requires adaptation of immunostaining protocols, particularly limiting BSA to 0.1% or less to prevent cyst collapse during fluorescence labeling.
- Limited by the need for careful medium exchange to avoid hydrogel disruption during long-term culture.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:02
Chamber Slide Preparation
1:59
Normal Rat Cholangiocyte Preparation
3:05
Cyst Generation
4:29
Cyst Imaging
5:29
Image Processing
6:14
Cyst Quantification
7:20
Results: Representative Cyst Formation, Viability, Functionality, and Polarity Analyses
9:03
Conclusion
