功能性极化胆管上皮囊泡的生成与定量表征

这是首个用于生成胆道囊肿的实验方案，提供了系统性分析方法，可随时间评估囊肿的形成、效率及大小。该方法能够对上皮细胞囊肿的形成进行定量评估，并使得研究人员能够根据上皮细胞类型或水凝胶种类来评价这一过程。由于目前针对胆道疾病的有效治疗手段有限，本方案为标准化药物研究、识别正常治疗靶点以及理解疾病机制开辟了新的途径。

该简便方法有助于探讨生物工程管状结构领域中关于新信息机制的重要问题。实验开始前，将适量的水凝胶溶液在4摄氏度下解冻，并将八孔板和移液器吸头于负20摄氏度预冷过夜。次日早晨，将水凝胶和八孔板置于冰上，将适量水凝胶加入预冷的大鼠正常胆管上皮细胞完全培养基中，配制成终体积为500微升、浓度为40%的水凝胶溶液。

然后使用预冷的移液枪吸头向培养插片的每个孔中央加入 50 µL 水凝胶溶液，并用移液枪吸头将溶液尽可能均匀地铺展至孔底的整个表面，避免产生气泡。为准备实验用细胞，在水凝胶聚合的同时，用预热的 PBS 清洗一个 70% 汇合度的正常大鼠胆管上皮细胞培养物，并在细胞培养孵育箱中用 5 mL 新鲜预热的 PBS 孵育细胞 20 分钟。孵育结束后，将 PBS 替换为 1 mL 预热的胰蛋白酶-EDTA，然后将培养瓶放回细胞培养孵育箱中孵育 5 至 10 分钟。

当细胞脱落后，加入4毫升预热的完全正常大鼠胆管上皮细胞培养基以中和反应，并将细胞转移至15毫升离心管中进行离心。随后，将沉淀重悬于5毫升预热的培养基中，经40微米细胞筛过滤至50毫升离心管中，用于细胞计数。为生成类囊肿结构，将适量水凝胶加入冰上预冷的完全正常大鼠胆管上皮细胞培养基中，配制成终体积为1,600微升、浓度为80%的水凝胶溶液，并将细胞稀释至每毫升冷的完全正常大鼠胆管上皮细胞培养基中含有5×10⁵个细胞，总体积为1,600微升。

立即将细胞与水凝胶细胞溶液混合，并吸取400微升细胞悬液加入水凝胶包被的腔室载玻片的每个孔中，注意避免产生气泡。为确保获得可重复且具有显著性的结果，务必小心操作水凝胶，并充分混匀初始的细胞-水凝胶混合液，以获得均一的溶液。所有细胞接种完成后，将载玻片放入细胞培养孵箱中。

培养两天后，从每个孔的一角小心移除 250 微升培养基，注意不要将水凝胶冲出，然后缓慢加入 250 微升新鲜培养基以替换弃去的上清液。进行囊泡成像时，在适当的培养时间，选择配备图像采集软件的相差显微镜的 10 X 物镜，打开白光灯并选择明场成像模式。点击播放以启动相机，并对焦于一片囊泡区域。

设置曝光时间，并打开自动采集文件夹窗口以自动保存图像。打开Z序列采集窗口，重置默认位置，使用Z轴调节旋钮定义Z栈的顶部和底部平面，并根据物镜和所需分辨率调整Z步进间距。然后点击“立即运行”以开始采集。

成像后，在 Fiji 中打开 Z 轴层叠图像。要复制该层叠图像，请点击图像，选择“复制”，然后选择“复制层叠”。要从复制的层叠图像生成最小强度投影，请在图像菜单下选择“层叠”和“Z 投影”。

选择投影类型的最小强度，然后单击确定。若要从投影中减去背景，请在“处理”菜单下选择“减去背景”，并设置500像素的滚动球半径和亮背景，以使囊肿相对于背景具有更高的对比度。为测量囊肿的近似直径，需放大目标囊肿，选择直线工具，然后按下键盘上的 T 键。

在最终投影图上，沿每个囊肿的直径画一条线。为每个囊肿创建的下一个感兴趣区域将被添加到感兴趣区域管理器中。当所有囊肿计数完成后，单击Z-stack窗口以选中它，然后单击“显示全部”以查看已计数的囊肿。

沿Z轴堆栈移动光标，检查每幅图像中的所有囊肿是否均已计数，必要时向感兴趣区域管理器中添加新的囊肿。当所有囊肿均完成计数后，选择感兴趣区域集，点击“更多”并选择“保存”以保存数据。为确定每个囊肿的大小，在保持感兴趣区域选中的情况下，点击“测量”。

将出现一个列出每个囊肿及其估计大小的窗口。然后将数据保存为 CSV 格式。如示例所示，随时间记录囊肿数量及其各自大小，可对囊肿形成与生长的演变过程进行分析。

可通过活/死细胞染色评估起始细胞群体以及培养10天后囊泡的存活率。在第10天，死亡细胞占细胞群体的比例不到3%，主要位于囊泡外，呈单个细胞或小聚集体形式存在，尽管在一些较大的囊泡内部也可观察到少量坏死细胞碎片的积聚。通过与二乙酸荧光素（Fluorescein diacetate）和Hoechst共孵育，可评估荧光素从基底侧向顶侧管腔空间的形成与分泌情况。

值得注意的是，经多药耐药抑制剂预处理后，荧光素的分泌受到抑制，表明管腔内荧光素的积累是通过多药耐药转运体主动分泌所致，而非来自细胞间隙的渗漏。E-钙黏蛋白表达染色显示，正常大鼠胆管上皮细胞在水凝胶中至少可维持其上皮表型达10天。在制备囊泡用于免疫荧光检测时，封闭过程中牛血清白蛋白浓度保持在0.1%或以下，是维持囊泡完整性的关键，因为较高浓度会导致囊泡回缩和管腔塌陷。

过夜水凝胶制备、解冻、移液枪头和培养腔载玻片的记录、冰上操作，以及将均匀的细胞-水凝胶混合物均匀铺展到培养腔载玻片上，均对实验成功至关重要。该方法可用于由其他上皮细胞或水凝胶生成囊状结构，从而实现比较研究，以更深入理解上皮极化过程。该定量方法可用于检测药物或基因突变对胆道功能及器官发生的影响。