Name: 功能性与极化胆囊肿的生成与定量特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 了解利用水凝胶方法生成功能性胆囊肿并进行定量分析的技术。该方案通过三维细胞系统研究胆管上皮细胞极化与器官发生机制，为胆管疾病治疗靶点识别和药物研究标准化提供可靠平台。

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我们感谢美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所的 Nicholas LaRusso 博士，他慷慨提供了 NRC 细胞系。
本工作获得了iLite RHU项目（资助号ANR-16-RHUS-0005）和DHU Hepatinov的经费支持。
感谢 Isabelle Garcin 和巴黎萨克雷细胞成像网络在成像方面提供的支持。

1. 包囊的制备
注意：如果凝胶化过程允许细胞包埋，则本方案可适用于任何类型的水凝胶。
<ol>
	<li>水凝胶涂层 
	注意：正确地将水凝胶涂覆于腔室载玻片是避免在孔底部形成二维细胞层的关键步骤，否则可能干扰后续的囊肿成像，并影响囊肿形成效率的计算。
	<ol>
		<li>为确保凝胶溶液的均匀性，将水凝胶解冻 4 °C 过夜（O/N）</li>
		<li>将移液器吸头预冷于冰上或在 -20 °C -8 孔板20 °C 过夜</li>
		<li>将水凝胶和8孔腔室载玻片置于装有冰块的冰桶中。</li>
		<li>在15 mL锥形管中，用冷的NRC完全培养基配制含40%水凝胶（V/V）的溶液（参见 材料列表并将试管置于冰上。</li>
		<li>使用预冷的移液器吸头，向腔室载玻片中加入 50 μL 在每个孔的中心加入水凝胶溶液，并用移液器吸头在将腔室载玻片置于冰上的同时将溶液铺展至整个表面（图1A). 
		注意：将水凝胶溶液尽可能均匀地铺展，避免产生气泡。</li>
		<li>为使水凝胶聚合，将腔室载玻片置于至少15分钟的孵育环境中 37 °C，5% CO₂2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞制备
	<ol>
		<li>预热 NRC 完全培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA）至水浴锅设定温度 37 °C.</li>
		<li>在水凝胶聚合的同时，确保神经视网膜细胞（NRCs）在T-25 cm²培养瓶中生长至70%汇合度。2 胶原蛋白包被培养瓶21用预热的1×PBS洗涤细胞一次。  </li>
		<li>将NRCs与5 mL预热的1x PBS孵育（适用于T-25 cm²培养瓶）2 烧瓶）中孵育 20 分钟 37 °C，5% CO₂2. 
		注意：此步骤通过缩短细胞与胰蛋白酶-EDTA的孵育时间，对维持细胞的自组织特性至关重要。</li>
		<li>弃去 PBS，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA，于 5-10 分钟内孵育 37 °C，5% CO₂2.</li>
		<li>用4 mL预热的完全NRC培养基中和。收集细胞悬液并转移至15 mL锥形管中，于150 × g离心 x g 4 分钟。</li>
		<li>弃去培养基，将细胞沉淀重悬于5 mL预热的培养基中。</li>
		<li>使用一个 40 μm 细胞筛，将细胞溶液过滤至50 mL离心管中并计数细胞。 
		注意：将细胞通过滤网过滤是获得可重复定量结果的关键步骤，即确保形成大小几乎相同的细胞聚集体以便包埋。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞悬液包埋于水凝胶溶液中
	<ol>
		<li>配制溶液 1,600 µL 80%水凝胶（V/V）加入冷的完全NRC培养基中（管1）；冰上保存。稀释5 x 105 细胞/mL 在 1,600 µL 加入预冷的完全NRC培养基（2号管），并置于冰上。 
		注意：此步骤必须迅速完成，以避免水凝胶在与细胞悬液混合过程中发生聚合，同时维持细胞活性。</li>
		<li>制备2.5 × 10⁵个细胞/mL的接种液5 细胞/mL，加入40%水凝胶（V/V），混合管1与管2。添加 400 μL 将细胞悬液加入各孔水凝胶包被的腔室载玻片中，避免产生气泡（图1B).</li>
		<li>将培养皿置于培养箱中孵育 37 °C 含5% CO2 直至更换培养基。</li>
		<li>培养2天后，移除 250 μL 从每个孔的角落吸出培养基，注意不要吸出水凝胶。然后，缓慢加入 250 μL 更换培养基，每2天一次。 
		注意：在囊肿启动期间，应尽量减少腔室载玻片的移动。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 包囊定量
<ol>
	<li>囊肿成像 
	注意：如果显微镜未配备用于控制 CO 的加热腔室，此步骤应迅速完成，以免影响细胞活力2 以及温度。为确保对整个水凝胶体积内囊肿分布情况进行一致且具有代表性的定量分析，需在不同时间点采用预设参数，通过相差显微镜和连续成像（Z轴层扫）对囊肿进行成像。
	<ol>
		<li>针对每个时间点，沿水凝胶的深度方向采集Z轴层扫图像图1C，D在此示例中，于第1、2、4、7和10天采集Z轴层扫图像。 
		注意：检查水凝胶中初始细胞分布是否均匀，以确保该方法的适用性。
		<ol>
			<li>使用配备图像采集软件的相差显微镜，在手动物镜转盘窗口中选择10倍物镜放大倍数（图2B(1)).</li>
			<li>打开白光灯并选择明场成像模式。</li>
			<li>打开相机，方法是选择“播放”按钮位于工具栏的子菜单中。聚焦于囊肿区域，并设置曝光时间（图2B(2)）。打开 自动捕获文件夹 用于自动保存图像的窗口（图2B(3)).</li>
			<li>打开Z序列采集窗口，使用Z轴旋钮定义Z层扫描的顶部和底部平面（相同的XY坐标但不同的Z层面）。根据物镜和所需分辨率调整Z步进距离，然后按下“立即运行”以启动数据采集（图2B(4)). 
			注意：在此示例中，囊肿分布在水凝胶的厚度范围内 520 µm沿水凝胶深度方向采集26幅图像 20 µm Z步进间隔。根据所使用的物镜，应调整Z步进间隔，以确保不遗漏任何囊肿，并能够检测到单个细胞和细胞聚集体。</li>
			<li>每孔至少采集3个无重叠的Z轴层扫图像。 
			注意：当囊肿由于水凝胶聚合不均而在凝胶内部比边缘更为密集时（如此例所示），此取样步骤是必要的。</li>
			<li>为获得具有代表性的数据集，总共对3个孔重复执行步骤2.1.1.5。 
			注意：囊肿的异质性分布取决于水凝胶的类型、其聚合方式以及细胞系。每次实验每孔取三个Z轴层扫描图像，每组实验设三个孔，每次时间点至少对九个Z轴层扫描图像中的200个囊肿进行成像，以表征囊肿的形成与生长情况。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像处理 
	注意：在水凝胶中，NRCs 可以单细胞、囊泡或细胞团的形式存在。囊泡的特征是具有一个包围着腔隙的圆形且薄的、对比明显的细胞壳，而细胞团则呈不规则形状，且无腔隙。细胞团和单细胞均呈现致密且对比明显的形态（图3B(4)).
	<ol>
		<li>打开 Fiji 软件，打开 Z-stack，进入 Fiji 菜单并点击 文件 | 打开 (补充图1）。选择要分析的Z-stack。如有需要，选择“虚拟堆栈” 选项并单击 “是”用于开启（图3A(1)).</li>
		<li>通过复制堆栈 图像 | 复制 单击“框”重复堆栈”并点击“好的” (补充图2). 
		注意：本示例中，Z轴层扫图像为以16位编码的.nd2文件格式。</li>
		<li>从复制的图像栈创建最小强度投影。前往 图像 菜单 | 堆栈 | Z 投影选择投影类型“最小强度”并点击“好的” (图3A(2)) (补充图3).</li>
		<li>从投影中减去背景。前往 流程菜单 | 减去背景. 输入500.0像素的滚动球半径，然后单击“浅色背景”以使包囊比背景更具对比度（图3A(3)) (补充图4). 
		注意：滚动球半径定义了进行背景减除操作的区域大小。该参数必须设置为待识别最大物体的尺寸。</li>
		<li>如果需要对比增强，请前往 图像菜单 | 调整 | 亮度/对比度 | 自动 | 应用Fiji 将自动优化亮度和对比度。在（图3A(3)），下限和上限灰度值分别设置为49702和65452（补充图5). 
		注意：如果投影未校准，请前往 分析菜单 | 设置比例尺 并输入相应的校准值 µm/pixel 比值（补充图6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>囊肿计数与囊肿大小测量
	<ol>
		<li>为测量囊肿的大致直径，选择 直线 Fiji 菜单中的工具，在每个囊肿的最终投影上沿其直径画一条线（图3B(4)）。将为每个囊肿创建的新感兴趣区域（ROI）添加到ROI管理器：按下“t” 快捷键以加快计数和打开 ROI 管理器。点击“显示 全部”以观察计数的囊肿（补充图7)</li>
		<li>通过将投影中的设定好的ROI叠加到Z-stack上，检查是否遗漏了未计数的囊肿。操作方法是单击 Z轴层扫窗口 选择它。在 ROI 管理器中，点击“显示全部”并沿Z轴堆栈移动光标，逐幅图像检查，确保所有囊肿均已计数（补充图8).</li>
		<li>在完成步骤 2.3.1 中新囊肿的计数并添加感兴趣区域（ROI）后，选择该 ROI 集合，并通过点击 ROI 管理器窗口中的保存按钮将其保存 更多 | 保存 (补充图9).</li>
		<li>在 ROI Manager 中选择所有 ROI，然后点击“测量”以获取每个囊肿的大小。这将打开一个名为“测量结果”的新窗口结果”对每个囊肿编号并估计其大小，然后通过点击“结果”窗口以及菜单： 文件 | 另存为 (补充图10). 
		注意：可创建一个宏来半自动处理图像序列，从投影中估算囊肿数量/大小，并存储数据以加快计数过程。为此，请选择“工具”记录” 在菜单栏中，通过点击 插件 | 宏 | 记录.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>囊泡形成效率的定量分析
	<ol>
		<li>在第 Y 天计数囊肿数量， <img alt="静力平衡公式 Σ（第 Y 天的囊肿数）；用于教学的数学方程图像。" src="/files/ftp_upload/61404/61404eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 在投影上（Y=1, 2, 4, 7 或 10）。</li>
		<li>在第 Y 天计算 1000 个细胞的成囊效率时，将该时间点计数的囊泡数量除以第 0 天根据水凝胶体积推算的接种细胞数，再乘以 1000（图3C, 图4). 
		<img alt="囊泡形成效率方程；生物学研究中随时间计算单位细胞囊泡数。" src="/files/ftp_upload/61404/61404eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞活力
<ol>
	<li>通过将 5 mg FDA 溶解于 1 mL 丙酮中，配制浓度为 5 mg/mL 的荧光素二乙酸酯（FDA）储备液，并于 -20 °C 保存。</li>
	<li>通过将碘化丙啶（PI）溶解于去离子水（dH2O）中，配制浓度为 2 mg/mL 的 PI 储备液，并于 4 °C 保存。</li>
	<li>配制不含胎牛血清（FCS）的 NRC 培养基。</li>
	<li>为配制 FDA/PI 染色液，向 2.5 mL 不含 FCS 的 NRC 培养基中加入 4 μL FDA 储备液（终浓度为 8 µg/mL）和 25 μL PI 储备液（终浓度为 20 µg/mL）。</li>
	<li>从腔室载玻片中移除培养基，向每个孔中加入 250 μL 染色液，在 37 °C、5% CO2 条件下避光孵育 4–5 分钟。小心吸出染色液，并用 250 μL 1× PBS 洗涤一次。</li>
	<li>向每个孔中小心加入 250 μL 完全 NRC 培养基，使用配备 Texas red 和异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片的倒置荧光显微镜拍摄图像。活细胞呈绿色，死细胞呈红色（图 5A）。 
	注意：为定量活/死细胞比例，可在完成步骤 2 后对水凝胶体积进行 Z 轴层扫成像，并调整荧光图像的图像处理方法。</li>
</ol>
4. 分泌活性
注意：通过胆管上皮细胞顶膜的分泌活性可通过管腔内荧光素的分泌情况进行评估。可通过使用多药耐药（MDR）转运蛋白抑制剂维拉帕米进行相同实验，以评价其特异性24。
<ol>
	<li>配制 Hoechst 33258 染色溶液 5 µg/mL，添加 0.83 μL Hoechst 储存液（15 mg/mL 储存浓度，溶于 dH₂O）2O) 加入不含FCS的2.5 mL NRC培养基中。</li>
	<li>添加 250 μL 每孔加入 Hoechst 溶液，并于 37 °C，5% CO₂2 15分钟。</li>
	<li>移除 Hoechst 溶液并加入 250 µL FDA溶液8 µg/mL 每孔中终浓度）。在4-5分钟内孵育 37 °C，5% CO₂2. 
	注意：细胞一旦接触FDA染色液，可立即开始追踪荧光素分泌动力学，以校准包囊分泌所需时间。为此，可通过延时成像每分钟拍摄一次，持续1小时。在此示例中，观察到NRC分泌包囊在水凝胶中分泌所需时间约为15–20分钟。</li>
	<li>5 分钟后用不含 FCS 的培养基冲洗，然后使用倒置荧光显微镜拍摄图像。使用 DAPI 和 FITC 滤光片观察细胞核标记及管腔内荧光素的积累情况图6A）为了定量分泌囊泡的数量，按照步骤2采集Z轴层扫图像，并调整图像处理步骤以适用于荧光图像。 
	注意：进行维拉帕米（Verapamil）测试时，需在前述步骤（4.3 至 4.4）之前，按照以下条件加入维拉帕米孵育：</li>
	<li>配制10 mM维拉帕米（Verapamil）的二甲基亚砜（DMSO）储备液。配制方法如下： 10 µM 工作液，混合 2.5 μL 将维拉帕米储备液与2.5 mL不含FCS的培养基混合。</li>
	<li>为了评估管腔中的荧光是否源于MDR分泌，另取一张载玻片并加入 250 µL 每孔加入维拉帕米工作液，并在37℃孵育20分钟 37° C，5% CO₂2 </li>
	<li>移除溶液并加入 250 µL FDA溶液的8 µg/mL 终浓度）加入每个孔中。在避光条件下孵育 4-5 分钟 37 °C，5% CO₂2。然后，用 250 μL 加入1×PBS，成像前处理（图6B, C).</li>
</ol>
5. 通过免疫荧光评估上皮细胞极性
<ol>
	<li>配制固定液：将4%甲醛与5%蔗糖溶于1×PBS（pH 7.4）中，并在预热至37 °C的水浴中孵育。</li>
	<li>固定细胞时，轻柔地用移液器吸出孔中的培养基，避免损伤基质。沿孔壁缓慢加入400 µL固定液，在室温（RT）孵育20分钟。 
	注意：始终保留25 µL液体覆盖在基质上方，以防止基质受损。</li>
	<li>轻柔吸除固定液，用400 μL 1×PBS在室温（RT）洗涤3次。</li>
	<li>吸除PBS，加入400 µL透化液（含0.5% Triton X-100的1×PBS），室温孵育10分钟。</li>
	<li>轻柔移除透化液，随后用400 μL 1×PBS快速洗涤3次，并在室温进行一次长达30分钟的长时间洗涤。 
	注意：此步骤后，载玻片可在4 °C保存2天。若需保存，请用石蜡膜密封载玻片，防止蒸发和基质干燥。</li>
	<li>吸除PBS，加入400 µL封闭液（含0.1%牛血清白蛋白（BSA）和10%山羊血清的1×PBS），室温孵育60分钟。 
	警告：若BSA浓度高于0.1%，将导致管腔回缩及后续囊肿塌陷（见代表性结果部分）（图7A）。</li>
	<li>用移液器吸除封闭液，加入400 µL PBS/0.05% Tween 20洗涤一次，弃去洗涤液。</li>
	<li>加入150 µL抗体溶液，例如E-cadherin抗体（1:400稀释）和Phalloidin 568（终浓度16.2 nM），溶于1×PBS中，室温孵育90分钟。 
	注意：该E-cadherin抗体稀释比例与标准二维免疫荧光实验方案中所用相同。</li>
	<li>用400 µL PBS/0.05% Tween 20洗涤样品3次，每次在室温孵育10分钟。</li>
	<li>加入150 µL二抗（山羊抗兔IgG Alexa Fluor Plus 647），按1:500比例溶于1×PBS中，室温孵育60分钟。</li>
	<li>用400 µL PBS/0.05% Tween 20洗涤3次，每次在室温孵育10分钟。</li>
	<li>用400 µL 1×PBS洗涤3次，每次在室温孵育10分钟。</li>
	<li>弃去最后一次PBS洗涤液，按照以下两种方式之一准备腔室载玻片，以便共聚焦显微镜观察。
	<ol>
		<li>每孔加入400 μL 1×PBS和50 μL DAPI。样品可通过孔底直接观察，无需加盖盖玻片（图7B）。</li>
		<li>每孔加入100 µL含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，于室温过夜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Spirlì, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+polarity+of+Na%2B%2FH%2B+and+Cl-%2FHCO3-+exchangers+in+a+rat+cholangiocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line.</a> American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了研究器官发生以及三维细胞结构的维持，研究人员已利用不同的细胞来源以及包括合成水凝胶在内的多种类型细胞外基质对各种组织进行了建模8,9,10,21。然而，由于缺乏可用于在类器官形成或功能方面对不同方法进行比较的三维定量分析技术7,8,9,10,15,18，水凝胶或药物筛选的进一步标准化仍难以实现。
为解决这些不足，我们提出一种基于水凝胶...

在过去三十年中，体外研究领域已逐步发展为三维（3D）培养体系。目前已涌现出多种三维细胞培养方案，可用于形成类球体或细胞聚集体，培养方式包括使用或不使用支架/基质、液滴培养、振荡培养、微流控装置培养或悬浮培养1。与二维（2D）培养相比，三维培养方法已显示出其显著优势，尤其对于上皮细胞而言，这些细胞可在三维环境中自组织形成被称为囊泡或腺泡的结构。在此情况下，细胞形成单层结构，围绕一个管腔排列，并获得完整的上皮表型，其生理特异性功能也得到增强2。
大量研究推动了在天然基质中形成这些上皮类器官方法的发展。这使得体内细胞间以及细胞与微环境之间的相互作用得以重现，从而建立并维持上皮表型的稳定性3,4,5,6,7。近年来，特别是为了开发可用于移植的类器官，并解析微环境在调控上皮程序中的必要性，研究人员已开发出合成水凝胶以促进上皮腺泡的形成8,9,10。然而，这些研究仅报告了定性数据，或采用内部参照的计算方法，例如在二维平面上囊状结构与非囊状结构的比值8,9,10。这使得不同研究之间在上皮类器官的形成效率、稳定性以及形态学和生理学特征方面无法进行比较。
利用微流控装置将上皮细胞微囊化成珠状，可获得更为真实可靠的定量与比较结果。通过该技术，已基于不同三维细胞结构的形态特征，形成并分化出多种细胞类型的类器官11,12。然而，该技术操作难度较高，且需要在洁净室环境中制备微流控装置。目前该技术仅适用于少数几种水凝胶，若要应用于其他类型的水凝胶，则需进行技术上的调整，从而限制了其通用性。因此，大多数旨在开发上皮类器官的研究仍依赖于将上皮细胞包埋于块状水凝胶中。在这些方法中，整个三维培养体系内凝胶结构和细胞分布的高度异质性常被忽视。因此，大多数分析仅基于单张二维图像，而这些图像仅能粗略反映各类细胞结构在整个三维空间中的分布情况。
影响胆管的疾病，如胆管癌、胆道闭锁、原发性硬化性胆管炎等，是导致死亡率和发病率升高的重要原因。除肝移植外，目前尚无有效疗法可治疗这些疾病13。对胆管形成机制、病因及疾病进展的研究将有助于开发新的治疗手段14。
已开发出使用正常或患者来源的、分化的或前体细胞来源的胆管上皮细胞系构建胆道类器官模型，包括囊状、球状或管状结构15,16,17,18,19,20。多项研究成功重现了胆管上皮细胞的极性、胆管上皮细胞标志物的表达、纤毛的存在、胆管上皮细胞的分泌与重吸收能力，以及管腔形成与阻塞等特征；这些均代表了胆管上皮细胞表型、形态和功能的重要特性15,17,19。另有研究报道可长期维持患者来源的胆道类器官20。近期，我们研究了生化与生物物理信号对胆道囊肿类器官发生的调控作用21。重要的是，胆道闭锁的发病机制已在胆道球状体和管状结构中得到研究7,22。此外，利用胆道球状体已成功研究了原发性硬化性胆管炎的关键特征，如胆管上皮细胞衰老、促炎性细胞因子的分泌以及巨噬细胞的募集15,20。然而，目前仍缺乏可重复的、体外三维定量模型，以生理相关的方式调控胆管上皮细胞的表型、生理功能及微环境，从而系统回答上述科学问题。此外，仅有少数文献报道了囊肿形成效率21,23，而这一点在研究类器官发生、疾病成因以及药物反应与胆管上皮细胞功能和极性之间相关性时尤为关键。另外，由于不同实验方案所使用的支架/基质存在差异，导致不同系统之间的结果难以比较。为解决这些问题，我们提出了一种定量、可靠且通用的方法，用于构建模拟管腔形成、胆管上皮细胞极性建立以及胆管上皮细胞分泌功能的胆道囊肿模型。重要的是，我们在评估囊肿随时间变化的形成效率、大小、活力、极性及功能时，进行了沿Z轴贯穿三维凝胶的系统性分析。此外，本方案以天然水凝胶和正常大鼠胆管上皮细胞（NRCs）为例进行演示，但其他天然或合成水凝胶以及上皮细胞亦可用于构建三维囊状结构。

<table><tbody><tr><td>10 &amp;micro;l- 移液器 Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000020</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;l - 移液器 Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000046</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;l - 移液器 Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l - 移液器 Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 3.4 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>VWR</td><td>20104-298</td><td>终浓度0.02N</td></tr><tr><td>气溶胶屏障移液器吸头 10 &amp;micro;l (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2707439</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶屏障移液器吸头 1000 &amp;micro;l (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2707404</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶屏障移液器吸头 200 &amp;micro;l (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2707430</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释</td></tr><tr><td>牛垂体提取物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13028-014</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 30 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>化学成分明确的脂质浓缩液 (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11905-031</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释</td></tr><tr><td>高浓度胶原蛋白，大鼠尾部来源</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>354249</td><td>终浓度 50 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 0.393 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331-020</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 1X</td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白 兔抗人、大鼠 多克隆抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32178</td><td>1:400 稀释</td></tr><tr><td>Eclipse TE300 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>成像</td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 0.32 mM</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 5:100 稀释</td></tr><tr><td>含DAPI的Fluoroshield（封片剂）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 16% (W/V)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28906</td><td>4% (W/V)</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210-064</td><td>1:10 稀释</td></tr><tr><td>Hamamatsu相机（数字相机 C11440 ORCA - flash 4.OLT）</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>成像</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1155</td><td>终浓度 5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>IgG (H+L) 高度交叉吸附 山羊抗兔 Alexa Fluor Plus 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32733</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>ImageJ 版本 2.0.0-rc-69/1.52n</td><td></td><td></td><td>开源图像处理软件</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒 (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51300-044</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释</td></tr><tr><td>Matrigel GFR（储存浓度 9.7 mg/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>356231</td><td>4:10 稀释</td></tr><tr><td>NIS Elements 软件版本 4.50.00</td><td>Nikon</td><td></td><td>图像采集与显示</td></tr><tr><td>非必需氨基酸溶液 (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释</td></tr><tr><td>物镜 Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&amp;infin;/1.2 WD 15.2)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶 (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>终浓度 20 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>罗丹明鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R415</td><td>终浓度 16.2 nM</td></tr><tr><td>Sir-Actin / Verapamil 试剂盒</td><td>Spirochrome</td><td>SC001</td><td>终浓度 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 50 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>无菌细胞筛 40 &amp;micro;m (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>无菌移液管 10 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>无菌移液管 5 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>无菌离心管 1.5 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>无菌离心管 15 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7200886</td><td></td></tr><tr><td>无菌离心管 50 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>553913</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>5:100 稀释</td></tr><tr><td>组织培养处理过的培养瓶 25cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;(Falcon)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>5:10000 稀释</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%) 含酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>1X</td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>5:1000 稀释</td></tr><tr><td>维生素 (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-037</td><td>NRC完全培养基终浓度 = 1:100 稀释</td></tr><tr><td>&amp;mu;-Slide 8 孔 ibiTreat, Ibidi</td><td>Clinisciences</td><td>80826</td><td></td></tr></tbody></table>

功能性极化胆管上皮囊泡的生成与定量表征

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

胆管上皮细胞（cholangiocytes）是排列在肝脏胆管内壁的上皮细胞，负责胆汁的生成与修饰。在过去二十年中，针对肝脏疾病的研究背景下，基于胆管上皮细胞的三维（3D）模型逐渐发展起来，例如囊肿、球状体或管状结构，用于模拟组织拓扑结构，以开展器官发生、疾病建模和药物筛选研究。这些结构主要通过将胆管上皮细胞包埋于水凝胶中获得。其主要目的是通过研究上皮极性、功能特性及形态学特征，探讨细胞的自组织能力。然而，极少有研究关注囊肿形成效率。即使涉及该指标，效率通常也仅通过单层图像进行量化。功能检测与结构分析往往未反映因水凝胶聚合不均及副作用所导致的囊肿分布潜在异质性。因此，现有的定量分析方法难以在不同研究之间进行比较。此外，该方法也无法比较不同基质或细胞类型在三维生长潜能上的差异。同时，目前尚无文献提及囊肿免疫染色实验中的问题排查方法。本文提供了一种可靠且通用的方法，证明初始细胞分布与囊肿在水凝胶垂直方向上的异质性分布密切相关。我们对包埋于水凝胶中的胆管上皮细胞进行为期10天的时间序列观察，并利用Z轴层扫分析贯穿水凝胶深度的细胞动态变化。通过该方法，可获得稳健的囊肿形成效率及生长动力学数据。我们还介绍了评估囊肿极性与分泌功能的方法。最后，提供了优化免疫染色方案的额外建议，以减少成像过程中囊肿塌陷的问题。该策略可推广应用于其他三维细胞培养研究，从而为不同系统间的比较提供了可能。

囊泡的形成与表征 
三维细胞培养系统是研究器官发生和疾病建模的重要工具25。然而，大多数现有方法均为定性分析，或仅通过单平面内囊泡与非囊泡数量的内部量化进行比较，且常在体积不一致且未明确说明的条件下进行，导致不同研究之间无法对囊泡形成效率进行有效比较7,8,9,10,15,18,23。本实验方案所提出的方法通过记录实验期间全部囊泡的数量及其各自大小，可实现对囊泡形成与生长动态演变的分析（图4）。
<p class="jove...

三维（3D）细胞系统是研究器官发生的相关模型。本文提出一种基于水凝胶的胆管囊泡生成及其表征方法。该方案克服了三维结构表征的障碍，提供了一种简单且可靠的方法，用于评估囊泡形成效率、尺寸大小及其功能特性。

胆管上皮细胞是排列在肝脏胆管内壁的上皮细胞，负责胆汁的形成与修饰。在过去的二十年中，……

这是首个用于生成胆道囊肿的实验方案，提供了系统性分析方法，可随时间评估囊肿的形成、效率及大小。该方法能够对上皮细胞囊肿的形成进行定量评估，并使得研究人员能够根据上皮细胞类型或水凝胶种类来评价这一过程。由于目前针对胆道疾病的有效治疗手段有限，本方案为标准化药物研究、识别正常治疗靶点以及理解疾病机制开辟了新的途径。该简便方法有助于探讨生物工程管状结构领域中关于新信息机制的重要问题。实验开始前，将适量的水凝胶溶液在4摄氏度下解冻，并将八孔板和移液器吸头于负20摄氏度预冷过夜。次日早晨，将水凝胶和八孔板置于冰上，将适量水凝胶加入预冷的大鼠正常胆管上皮细胞完全培养基中，配制成终体积为500微升、浓度为40%的水凝胶溶液。然后使用预冷的移液枪吸头向培养插片的每个孔中央加入 50 µL 水凝胶溶液，并用移液枪吸头将溶液尽可能均匀地铺展至孔底的整个表面，避免产生气泡。为准备实验用细胞，在水凝胶聚合的同时，用预热的 PBS 清洗一个 70% 汇合度的正常大鼠胆管上皮细胞培养物，并在细胞培养孵育箱中用 5 mL 新鲜预热的 PBS 孵育细胞 20 分钟。孵育结束后，将 PBS 替换为 1 mL 预热的胰蛋白酶-EDTA，然后将培养瓶放回细胞培养孵育箱中孵育 5 至 10 分钟。当细胞脱落后，加入4毫升预热的完全正常大鼠胆管上皮细胞培养基以中和反应，并将细胞转移至15毫升离心管中进行离心。随后，将沉淀重悬于5毫升预热的培养基中，经40微米细胞筛过滤至50毫升离心管中，用于细胞计数。为生成类囊肿结构，将适量水凝胶加入冰上预冷的完全正常大鼠胆管上皮细胞培养基中，配制成终体积为1,600微升、浓度为80%的水凝胶溶液，并将细胞稀释至每毫升冷的完全正常大鼠胆管上皮细胞培养基中含有5×10⁵个细胞，总体积为1,600微升。立即将细胞与水凝胶细胞溶液混合，并吸取400微升细胞悬液加入水凝胶包被的腔室载玻片的每个孔中，注意避免产生气泡。为确保获得可重复且具有显著性的结果，务必小心操作水凝胶，并充分混匀初始的细胞-水凝胶混合液，以获得均一的溶液。所有细胞接种完成后，将载玻片放入细胞培养孵箱中。培养两天后，从每个孔的一角小心移除 250 微升培养基，注意不要将水凝胶冲出，然后缓慢加入 250 微升新鲜培养基以替换弃去的上清液。进行囊泡成像时，在适当的培养时间，选择配备图像采集软件的相差显微镜的 10 X 物镜，打开白光灯并选择明场成像模式。点击播放以启动相机，并对焦于一片囊泡区域。设置曝光时间，并打开自动采集文件夹窗口以自动保存图像。打开Z序列采集窗口，重置默认位置，使用Z轴调节旋钮定义Z栈的顶部和底部平面，并根据物镜和所需分辨率调整Z步进间距。然后点击“立即运行”以开始采集。成像后，在 Fiji 中打开 Z 轴层叠图像。要复制该层叠图像，请点击图像，选择“复制”，然后选择“复制层叠”。要从复制的层叠图像生成最小强度投影，请在图像菜单下选择“层叠”和“Z 投影”。选择投影类型的最小强度，然后单击确定。若要从投影中减去背景，请在“处理”菜单下选择“减去背景”，并设置500像素的滚动球半径和亮背景，以使囊肿相对于背景具有更高的对比度。为测量囊肿的近似直径，需放大目标囊肿，选择直线工具，然后按下键盘上的 T 键。在最终投影图上，沿每个囊肿的直径画一条线。为每个囊肿创建的下一个感兴趣区域将被添加到感兴趣区域管理器中。当所有囊肿计数完成后，单击Z-stack窗口以选中它，然后单击“显示全部”以查看已计数的囊肿。沿Z轴堆栈移动光标，检查每幅图像中的所有囊肿是否均已计数，必要时向感兴趣区域管理器中添加新的囊肿。当所有囊肿均完成计数后，选择感兴趣区域集，点击“更多”并选择“保存”以保存数据。为确定每个囊肿的大小，在保持感兴趣区域选中的情况下，点击“测量”。将出现一个列出每个囊肿及其估计大小的窗口。然后将数据保存为 CSV 格式。如示例所示，随时间记录囊肿数量及其各自大小，可对囊肿形成与生长的演变过程进行分析。可通过活/死细胞染色评估起始细胞群体以及培养10天后囊泡的存活率。在第10天，死亡细胞占细胞群体的比例不到3%，主要位于囊泡外，呈单个细胞或小聚集体形式存在，尽管在一些较大的囊泡内部也可观察到少量坏死细胞碎片的积聚。通过与二乙酸荧光素（Fluorescein diacetate）和Hoechst共孵育，可评估荧光素从基底侧向顶侧管腔空间的形成与分泌情况。值得注意的是，经多药耐药抑制剂预处理后，荧光素的分泌受到抑制，表明管腔内荧光素的积累是通过多药耐药转运体主动分泌所致，而非来自细胞间隙的渗漏。E-钙黏蛋白表达染色显示，正常大鼠胆管上皮细胞在水凝胶中至少可维持其上皮表型达10天。在制备囊泡用于免疫荧光检测时，封闭过程中牛血清白蛋白浓度保持在0.1%或以下，是维持囊泡完整性的关键，因为较高浓度会导致囊泡回缩和管腔塌陷。过夜水凝胶制备、解冻、移液枪头和培养腔载玻片的记录、冰上操作，以及将均匀的细胞-水凝胶混合物均匀铺展到培养腔载玻片上，均对实验成功至关重要。该方法可用于由其他上皮细胞或水凝胶生成囊状结构，从而实现比较研究，以更深入理解上皮极化过程。该定量方法可用于检测药物或基因突变对胆道功能及器官发生的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

功能性与极化胆囊肿的生成与定量特征

本文介绍了一种从新生小鼠肝外胆管中分离胆管上皮细胞的技术。通过精细解剖获取胆管组织，随后利用厚胶原凝胶中的细胞爬出法分离细胞。该方法为研究肝外胆管的发育过程及病理机制提供了一个有效的工具。...

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本文介绍一种建立人鼻腔上皮细胞三维球状体培养的方法。通过刺激球状体，诱导其产生囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）依赖性的离子和液体分泌，并以球状体管腔大小的变化作为CFTR功能的指标进行定量分析。...

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本方案描述了小鼠肝外胆管三维类器官系统的构建方法。这些胆管类器官可在体外培养中维持生长，用于研究胆管上皮细胞的生物学特性。胆管类器官表达胆管前体细胞和成熟胆管细胞的标志物，并由具有极性的上皮细胞组成。...

从小鼠肝外胆管生成类器官

我们介绍一种相对简单且灵敏的方法，用于精确量化小鼠肝脏中的胆管密度。该方法有助于评估遗传和环境因素的影响，以及潜在疗法在胆道疾病小鼠模型中的有效性。...

测定小鼠肝脏中胆管密度

本方案提供了一种简单且可靠的方法，用于制备来自小鼠的具有活性的精准切割肝组织片。这些离体组织样本可在实验室组织培养条件下维持数天，为研究肝脏病理生物学提供了一个灵活的模型。...

小鼠精准切割肝片作为肝脏生物学的离体研究模型

为了观察小鼠新生仔鼠的胆管异常，需要保持胆管的完整性和高效的制备方法。因此，我们成功建立了一种新的方法，可在维持胆管完整性的前提下，分离出小鼠新生仔鼠的整个肝外胆管系统。...

九日龄小鼠幼崽的肝外胆管和胆囊解剖

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。...

通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

抑制性G蛋白偶联受体的持续激活会导致腺苷酸环化酶信号通路的敏化。为了鉴定关键的分子通路，必须采用无偏倚的研究方法；然而，该策略需要建立一种可扩展的基于细胞的cAMP敏化检测方法。本文中，我们描述了一种用于小分子和siRNA筛选的敏化检测方法。...

药物诱导的腺苷酸环化酶敏感化：小分子与siRNA筛选应用中的检测方法优化与微型化

了解利用水凝胶方法生成功能性胆囊肿并进行定量分析的技术。该方案通过三维细胞系统研究胆管上皮细胞极化与器官发生机制，为胆管疾病治疗靶点识别和药物研究标准化提供可靠平台。

功能性极化胆管上皮囊泡的生成与定量表征

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