甲基化特异性多路复用液滴PCR，使用聚合物液滴发生器设备进行血液诊断
2020年6月29日
表观遗传标记用于白细胞（WBC）通过DNA甲基化模式的定量亚化。该协议提出了一种多路滴聚合酶链反应（mdPCR）方法，使用基于热塑性弹性体（TPE）的微流体器件进行液滴生成，从而实现WBC差分计数的精确和多路复用甲基化特异性目标定量。
该协议提供了一个灵活的多路复用液滴PCR工作流程，允许基于表观遗传甲基化标记的精确微分白细胞计数。这种灵活性可能有助于将 mdPCR 翻译至临床使用。该方法提供与使用免疫荧光染色方法获得的结果进行密切查询。
然而，与免疫荧光染色不同，这种方法不需要新鲜血液样本或昂贵的抗体。在血液学诊断中，差分白细胞可以作为一系列疾病的指标，包括感染、炎症、贫血和白血病，并被认为是早期预测癌症生物标志物。与阿卜杜勒拉赫曼·埃尔曼扎拉维一起演示手术的将是克里斯蒂娜·纳西夫，他是NRC医疗器械研究中心我们团队的技术官员。
首先将20微升蛋白质激酶K和400微升含磁珠的开结结合缓冲液与刚解冻的人类外周血单核细胞彻底混合在100微升PBS中。在室温下孵育五分钟后，将管子放在磁架上一至两分钟，然后取出上经液。将磁管从磁铁上拆下后，将DNA珠复合物重新悬浮在600微升的洗涤缓冲液中，以去除任何非具体绑定的珠子。
将管子放回磁铁上，以便去除上流液，然后像刚才演示的600微升洗涤缓冲液中清洗细胞。取出上流液后，让管子在磁铁上风干一分钟，然后通过彻底混合向管中加入 100 微升洗脱缓冲液。然后，将磁管放在磁架上一到两分钟，将磁珠与被暗示的DNA分离，然后将纯化的DNA溶液转移到新的管子上。
对于纯化DNA的二硫化转化，将20微升的暗示DNA样品转移到PCR管中，并将130微升的转化试剂加入管中。彻底混合后，短暂旋转管内，并在热循环器上放大DNA。在周期结束时，将600微升的结合缓冲液添加到放置在收集管中的离子色谱柱中，并将DNA添加到该柱中。
多次反转管混合，全速离心30秒。丢弃收集的流量，并将 100 微升洗涤缓冲液添加到列中。如所证明，将柱子离心并再次丢弃流经。
将 200 微升脱硫缓冲液添加到柱中，在室温下孵育 15 至 20 分钟，然后离心样品并丢弃流经，如所示。接下来，每次洗涤用 200 微升的洗涤缓冲液洗两次柱。第二次洗涤后，将柱转移到新的1.5毫升收集管中，并在柱膜上加入100微升PCR级水。
然后，通过全速离心一分钟来检测DNA。对于液滴生成，将一微升双硫酸盐转化的DNA与新制备的探针母体混合在PCR管中，然后通过短暂的离心收集样品。使用峰值接头将一次性流体管连接到两个 250 微升体积精密玻璃注射器。
预填充一个精密玻璃注射器，加注250微升含有5%面粉表面活性剂的载体油，预填充一个精密玻璃注射器，并预装50微升载波油。当两个注射器都装好了，将100微升的PCR混合物装入载油的注射器中，将一个液滴微流体装置放在装有高速摄像头的直立光显微镜的舞台上。为了实时观察和记录液滴形成，将预填充注射器放在可编程注射器泵上，并使用峰值接头将注射器的管子连接到液滴微流体装置各入口通道的管子上。
将油滴发生器出口到 0.5 毫升 PCR 管内侧，将注射器泵流量调整为每分钟两微升，使液滴尺寸在收集产生的乳液之前稳定下来。缓慢而仔细地从管顶部收集乳液，将溶液的 75 微升转移到 200 微升 PCR 管中，用于热循环。然后，确认PCR管中的含油量与分散相的体积紧密匹配，防止液滴在热循环过程中凝结，将200微升管放入热循环器中。
对于乳化样品的荧光成像，将 PCR 乳液转移到具有矩形轮廓的 50 微米深硅细管中，以便将液滴排列成紧密包装的单层进行成像。将毛细管固定并密封到显微镜幻灯片上后，将滑轨加载到倒置显微镜的舞台上。并在显微镜成像软件中，选择快速采集和实时拍摄，开始实时采集摄像机。
然后，观察在亮场和荧光显微镜下的样品。在液滴生成和热循环之后，液滴可以引入一毫米宽、50 微米高度的玻璃毛细管中。为了获得理想的荧光图像采集液滴的单层分布，可以记录每个波长的图像。
经过图像分析，可以绘制其各自荧光团中所有液滴的荧光强度，以确定正负液滴的阈值。在识别和计数后，可以计算每个液滴值的副本，并分别根据甲基化 CD3Z 和 FOXP3 拷贝确定 CD3+T 细胞和 CD4+25+ 调节 T 细胞的百分比，以及总细胞或无 C 基因每个液滴的拷贝。然后，可以使用适当的抗体将百分比值与通过免疫荧光成像获得的值进行比较。
我认为，从液滴生成到热循环和最终液滴成像步骤的乳化稳定性对于获得精确、可靠和可重复的定量结果至关重要。通过定制的 PCR 组合配方进行 MD PCR 定制，可用于多种应用，包括癌症研究、传染病诊断和单细胞级别的分析。
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概述
本协议提出了一种灵活的多重液滴PCR工作流程，能够基于表观遗传甲基化标记进行精确的白细胞差异计数。该方法提供的结果与免疫荧光染色方法获得的结果密切相关。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 血液学
- 表观遗传学
背景
- 表观遗传标记对于白细胞亚型分类至关重要。
- 白细胞差异计数是多种疾病的指标。
- 该方法不需要新鲜血液样本或昂贵的抗体。
- 它被认为是一种早期预测癌症的生物标记。
研究目的
- 开发一种用于精确白细胞差异计数的方法。
- 促进mdPCR向临床应用的转化。
- 提供一种成本效益高的免疫荧光染色替代方案。
使用的方法
- 多重液滴聚合酶链反应（mdPCR）。
- 使用热塑性弹性体（TPE）基微流控装置。
- 定量分析DNA甲基化模式。
- 由NRC医疗器械研究中心的技术官员进行演示。
主要结果
- mdPCR方法允许进行精确和多重的甲基化特异性目标定量。
- 结果与传统方法获得的结果密切匹配。
- 该方法适用于临床应用。
- 它可以作为多种血液病的可靠诊断工具。
结论
- mdPCR方法是一种用于白细胞差异计数的有前景的工具。
- 它比传统的免疫荧光染色具有优势。
- 这种方法可能会增强血液学诊断能力。
常见问题
Executive Industry Relevance
This multiplex droplet PCR workflow enables precise epigenetic-based white blood cell differential counting, offering a cost-effective alternative to immunofluorescent staining for hematological diagnostics. By quantifying DNA methylation patterns at CpG loci, the method supports prognostic biomarker discovery in diseases such as infection, inflammation, anemia, and leukemia. Its compatibility with archival samples and elimination of antibody dependence enhances translational potential for clinical laboratory implementation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epigenetic markers to validate WBC sub-population hypotheses in disease models.
- Operational Value: Provides quantitative, methylation-specific readouts that de-risk target engagement assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, multiplexed epigenetic data for assay reproducibility across compound screening campaigns.
- Operational Value: Facilitates high-throughput droplet generation with consistent sizing for reliable fluorescence-based detection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports biomarker-aligned WBC subtyping for translational continuity from discovery to preclinical validation.
- Operational Value: Enables parametric determination of immune cell populations using epigenetic signatures, reducing reliance on cell-surface markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing epigenetic quantification that informs target validation and lead identification decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune cell involvement through methylation pattern analysis of specific CpG loci.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative droplet PCR outputs enabling comparison of epigenetic responses across experimental conditions.
- Analytics: Generates copies-per-droplet measurements and threshold-based positive/negative droplet classification for precise cell population quantification.
- Translational Research: Aligns with prognostic biomarker development by correlating epigenetic WBC counts with clinical outcomes in hematological conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multiplex epigenetic analysis applicable across immunology, oncology, and infectious disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune cell subset quantification through epigenetic specificity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via thermoplastic elastomer microfluidic device and standardized droplet generation.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling early, antibody-free immune monitoring in preclinical models.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through objective, quantification-based immune profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bisulfite conversion, droplet PCR, and fluorescence imaging analysis.
- Dependent on precision glass syringes, programmable syringe pumps, and thermoplastic elastomer microfluidic devices.
- Necessitates standardization of probe master mix formulation and thermal cycling parameters across sites.
- Adaptation considerations include varying CpG target panels for different WBC sub-populations and disease contexts.
- Practical limitations include emulsion stability maintenance during thermal cycling and imaging steps to prevent coalescence.
