Name: 甲基化特异性多路复用液滴PCR，使用聚合物液滴发生器设备进行血液诊断 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学习甲基化特异性多路复用液滴PCR技术，利用热塑性弹性体微流控设备进行血液诊断，实现基于表观遗传标记的精确白细胞分类计数。该方法无需新鲜血样和昂贵抗体，为血液学和癌症早期诊断提供经济可靠的替代方案。

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作者感谢加拿大国家研究委员会提供的资金支持。

<ol><li>Teitell, M., Richardson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in the immune system.</a> Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).</li>
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<li>Roy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cellular+lysis+to+microarray+detection%2C+an+integrated+thermoplastic+elastomer+%28TPE%29+point+of+care+Lab+on+a+Disc%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc.</a> Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).</li>
<li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+subtyping+of+white+blood+cells+using+a+thermoplastic+elastomer-based+microfluidic+emulsification+device+for+multiplexed%2C+methylation-specific+digital+droplet+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR.</a> Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).</li>
<li>Malic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+microfluidic+chip+for+rapid+and+efficient+immunomagnetic+capture+and+release+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes.</a> Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).</li>
<li>Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-thermoplastic+nanoplasmonic+microfluidic+device+for+transmission+SPR+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing.</a> Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).</li>
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不存在任何利益冲突需要声明。

本文介绍的实验方案和方法可在实验室内部使用自制的TPE液滴发生器、热循环仪和荧光显微镜进行微滴式PCR（mdPCR）。通过软质TPE与TPE之间的键合所制备的装置具有均匀分布于所有通道壁的疏水表面特性，因此最终装置在后续用作液滴发生器时无需任何表面处理。该材料已常规应用于需要与高通量制造兼容的即时检测平台9,10,11,12,13。此外，该材料具有良好的光学透明性，并在可见光谱范围内表现出低荧光背景，这一特性有利于未来将mdPCR整合为完整的“样本进-结果出”工作流程。本文还以自配形式提供了PCR试剂配方，便于实现多重基因的定量检测，同时在整个热循环过程中保持试剂稳定性。因此，本研究所提出装置与方案的优势之一在于可根据特定应用灵活定制装置设计和所用试剂，而这一点在商业产品和专有配方中难以实现。此外，该方法还消除了实...

白细胞（WBC）分类分析是血液学诊断中最常进行的实验室检测项目之一。白细胞分类计数可作为多种疾病（包括感染、炎症、贫血和白血病）的指标，并正在被研究作为其他多种疾病的早期预后生物标志物。白细胞亚型分析的金标准包括免疫染色和/或流式细胞术，这两种方法均需要使用昂贵且稳定性差的荧光标记抗体，且通常高度依赖操作人员在样本制备方面的熟练程度。此外，该方法仅适用于新鲜血液样本，样本无法冷冻保存以用于运输或后续分析。
表观遗传标记最近已成为研究表型变异的有力分析工具。随后的研究表明，人类白细胞群体具有细胞谱系特异性的DNA甲基化模式，可用于精确鉴定白细胞亚群。基于表观遗传标记的分型提供了一种有前景的替代方法，该方法不依赖新鲜血液样本的采集或昂贵的抗体，且可作为疾病发生和易感性的生物标志物1,2,3,4,5。
已开展全基因组范围的研究，以广泛绘制白细胞亚型基因组中甲基化的富含CG的特定区域（CpG岛），从而鉴定出针对白细胞亚型的候选表观遗传标记。基于此目的，已开发出针对甲基化基因区域（如对应于CD3+ T细胞和CD4+ CD25+调节性T细胞（T-Regs）的CD3Z和FOXP3基因区域）的PCR方案。Wiencke等人已证明双重液滴PCR在T细胞表观遗传分型中的实用性，其结果与流式激活细胞分选（FACS）分析具有高度相关性6。这种定量遗传分析方法依赖于将模板核酸分子和PCR试剂分配至数千个离散的、体积确定的亚纳升级液滴中，每个液滴含有零个、一个或多个目标核酸拷贝，该过程通过微流控技术实现的水包油乳液完成7,8。PCR扩增在各个独立液滴中进行，并测量每个液滴的终点荧光强度，从而实现对样本中目标分子的绝对定量。研究表明，与标准qPCR相比，液滴PCR具有更高的精确性、准确性以及更简便的技术操作，使其成为T细胞临床评估中更具优势的基于DNA甲基化的检测方法。尽管多靶标分型技术正在迅速发展，但目前仍缺乏可同时检测多个甲基化CpG区域的多重表观遗传分析方法，而此类方法对于常规白细胞分类计数至关重要。
本文介绍并应用了一种热塑性弹性体（TPE）液滴微流控装置，用于甲基化特异性的多重液滴PCR（mdPCR）。该技术已用于根据细胞谱系DNA甲基化模式，即CD3Z和FOXP3 CpG区域的表观遗传变异，区分特定的白细胞亚型——CD3+ T细胞和CD4+ CD25+ T调节细胞（T-Regs）。文中详细描述了DNA提取、亚硫酸氢盐转化和mdPCR的操作流程，并结合介绍了TPE液滴生成装置的制备方法。同时，将该方法的代表性结果与免疫荧光染色结果进行了比较，突显了所提出方法的应用价值。

<table><tbody><tr><td>Bio-Rad，密西沙加，安大略省</td><td>TFI0201</td><td>PCR管</td><td></td></tr><tr><td>RAN Biotechnologies，贝弗利，马萨诸塞州</td><td>008-FluoroSurfactant</td><td>氟化表面活性剂</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Quest International，加利福尼亚州圣克拉拉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>英国牛津，Oxford Instruments公司</td><td></td><td>EMCCD相机</td><td></td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>MA5-16728</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>22-8425-71</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td></td><td>用于荧光图像分析</td><td></td></tr><tr><td>日本尼康</td><td></td><td>10倍物镜</td><td></td></tr><tr><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC），弗吉尼亚州马纳萨斯</td><td>PCS-800-011</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ram&amp;eacute;-Hart Instrument Co.（美国新泽西州内特康）</td><td>p/n 200-U1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>费舍尔，加拿大</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>美国新泽西州Vitrocom公司</td><td>5015 和 5010</td><td>硼硅酸盐毛细管</td><td></td></tr><tr><td>http://definetherain.org.uk/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>日本滨松</td><td>LC-L1V5</td><td>DEL 紫外光源</td><td></td></tr><tr><td>Dolomite</td><td>3200063</td><td>一次性流体管路</td><td></td></tr><tr><td>多孔石</td><td>3200302</td><td>一次性流体管路</td><td></td></tr><tr><td>IDT，爱荷华州科拉尔维尔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼康，纽约州梅尔维尔</td><td></td><td>直立式光学显微镜</td><td></td></tr><tr><td>Cytec Industries，伍德兰帕克，新泽西州</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EV Group, Sch&amp;auml;奥地利格拉茨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymo Research，加利福尼亚州尔湾市</td><td>D5030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photron，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDT，爱荷华州科拉尔维尔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gersteltec，普利，瑞士</td><td></td><td>SU-8 光刻胶</td><td></td></tr><tr><td>Fineline Imaging，科罗拉多斯普林斯，科罗拉多州</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen，德国希尔登</td><td>203603</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td></td><td>用于评估液滴直径</td><td></td></tr><tr><td>Anachemia，蒙特利尔，魁北克省</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excelitas，马萨诸塞州，美国</td><td></td><td>宽谱LED荧光灯</td><td></td></tr><tr><td>Galenvs Sciences Inc.，蒙特利尔，魁北克省</td><td>DE1010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hexpol TPE &amp;Aring;m&amp;aring;瑞典</td><td></td><td>热塑性弹性体（TPE）</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>13-400-518</td><td></td><td></td></tr><tr><td>日本尼康</td><td></td><td>用于图像采集</td><td></td></tr><tr><td>3M，明尼苏达州圣保罗</td><td></td><td>载体油</td><td></td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>R37605</td><td>蓝色荧光活细胞染料（DAPI）</td><td></td></tr><tr><td>IDEX Health &amp;amp; 科学，奥克港，华盛顿州</td><td>P-881</td><td>PEEK接头</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich，奥克维尔，安大略省</td><td>806552</td><td></td><td></td></tr><tr><td>道康宁，米德兰，密歇根州</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThinkyUSA，加利福尼亚州，美国</td><td>ARV 310</td><td></td><td></td></tr><tr><td>美国马里兰州Ihc世界</td><td>IW-125-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zinsser NA, Northridge CA</td><td>2607808</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cetoni GmbH，科堡森，德国</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich，奥克维尔，安大略省</td><td>484431</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad，密西沙加，安大略省</td><td>1861096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>日立高新技术公司，密西沙加，安大略省</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼康，纽约州梅尔维尔</td><td></td><td>倒置显微镜</td><td></td></tr><tr><td>日本尼康</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loctite</td><td>AA 352</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用聚合物微滴生成装置进行甲基化特异性多重微滴pcr用于血液学诊断

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR using Polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

本文介绍了一种用于确定基于表观遗传学的白细胞（WBC）分类计数的多重液滴PCR（mdPCR）工作流程及详细实验方案，并描述了一种基于热塑性弹性体（TPE）的微流控液滴生成装置。利用表观遗传标记对WBC&#160;进行亚型分型，该方法在多种疾病的预后评估中具有重要价值。该技术通过定量分析基因组中特定富含CG区域（CpG位点）的DNA甲基化模式来实现。在本研究中，将外周血单个核细胞（PBMCs）经亚硫酸氢盐处理后的DNA与mdPCR试剂共同包裹于液滴中，试剂包含针对与WBC亚群相关的CpG位点的特异性引物和水解型荧光探针。该多重检测方法可在单次反应中同时分析多个CpG位点，无需进行多个独立的mdPCR反应，从而通过甲基化位点的表观遗传分析更准确地实现对WBC亚群的参数化定量。这种精确的定量方法可拓展应用于多种场景，凸显了其在临床诊断及后续预后判断中的优势。

基于TPE的微流控液滴生成装置按照所述方案制备，如图1所示。在光刻过程中使用透明掩模以获得硅（Si）母模。通过软光刻技术制备Si母模的PDMS反向复制品，随后用于制备环氧树脂模具。将环氧前体倒入PDMS模具中并固化，使其交联并硬化。该模具与Si母模完全一致，具有更高的机械稳定性，适用于后续通过热压法对热塑性塑料进行热成型。获得环氧模具后，对热塑性弹性体进行压印。压印完成后，将TPE脱模并切割成器件。使用平整的TPE基底对器件进行密封。在顶盖上打孔，并将两个基底键合。最后，插入必要的管路以实现芯片与外部系统的连接，装置即可投入使用。所制备的母模、TPE材料及压印后器件的样品图像如图2所示。组装好的带管路连接的装置由一对独立可编程的注射泵驱动，用于生成适用于mdPCR的乳液。采用经亚硫酸氢盐处理的、从冷冻PBMCs中提取的DNA进行甲基化特异性mdPCR。将针对CD3Z、FOXP3和C-Less基因的特异性引物和水解探针加入PCR反应体系中用于乳化。在生成合适尺寸的液滴（直径约72 μm）后，将乳液进行热循环处理。最后，将...

通过定量DNA甲基化模式，表观遗传标记可用于白细胞（WBC）亚型分型。本方案介绍了一种基于热塑性弹性体（TPE）微流控装置的多重液滴聚合酶链式反应（mdPCR）方法，用于生成液滴，从而实现对白细胞分类计数中甲基化特异性靶标的精确定量和多重检测。

使用聚合物微滴生成装置进行甲基化特异性多重微滴PCR用于血液学诊断

一种用于测定基于表观遗传学的白细胞（WBC）分类计数的多重液滴PCR（mdPCR）工作流程及详细方案被描述，……

本方案介绍了一种灵活的多重液滴PCR工作流程，可根据表观遗传甲基化标志物实现精确的白细胞差异计数。这种灵活性可能促进甲基化差异PCR（mdPCR）向临床应用的转化。该方法所得结果与免疫荧光染色方法获得的结果高度一致。然而，与免疫荧光染色不同，该方法无需新鲜血液样本或昂贵的抗体。在血液学诊断中，白细胞分类计数可作为多种疾病的指征，包括感染、炎症、贫血和白血病，并且正被考虑作为癌症早期预后生物标志物。本次实验操作将由我们团队来自加拿大国家研究委员会医疗设备研究中心的技术专员 Christina Nassif 演示，共同演示者为 Abdelrahman Elmanzalawy。首先，将20 µL蛋白激酶K与含有磁珠的400 µL裂解结合缓冲液充分混合，并加入100 µL新鲜解冻的人外周血单个核细胞（PBMCs）中。室温孵育5分钟后，将离心管置于磁力架上1至2分钟，随后移除上清液。将离心管从磁力架上取下后，用600 µL洗涤缓冲液1重新悬浮DNA-磁珠复合物，以去除非特异性结合的磁珠。将离心管重新放回磁力架上，以去除上清液，随后用600 µL洗涤缓冲液二洗涤细胞，操作方法如前所述。去除上清液后，将离心管在磁力架上静置空气干燥1分钟，然后向管中加入100 µL洗脱缓冲液，并充分混匀。接着，将离心管置于磁力架上1至2分钟，使磁珠与目标DNA分离，随后将纯化的DNA溶液转移至新的离心管中。对于纯化后DNA的亚硫酸氢盐转化，将20微升上述DNA样本转移至PCR管中，并向管内加入130微升转化试剂。充分混匀后，短暂离心收集管内液体，然后在热循环仪中扩增DNA。循环结束后，向置于收集管中的离子层析柱加入600微升结合缓冲液，再将DNA样品加入层析柱中。将离心管颠倒数次以混匀，然后以最大速度离心30秒。弃去收集的流出液，向吸附柱中加入100 µL洗涤缓冲液。再次离心吸附柱，并按所示方法弃去流出液。向柱中加入 200 微升脱磺化缓冲液，在室温下孵育 15 至 20 分钟，然后离心样品并弃去穿流液，操作如图所示。接着，每次用 200 微升洗涤缓冲液，共洗涤柱两次。第二次洗涤后，将柱转移至新的 1.5 毫升收集管中，并向柱的膜上加入 100 微升 PCR 级水。然后，通过将离心柱在最大转速下离心一分钟来洗脱DNA。进行液滴生成时，在PCR管中将1微升经亚硫酸氢盐转化的DNA与 freshly prepared探针主混合液混合，并通过短暂离心收集样品。使用接头将一次性流体管路连接至两个250微升体积的精密玻璃注射器。用一支精密玻璃注射器预先装入含有5%氟化表面活性剂的250微升载油，再用另一支精密玻璃注射器装入50微升载油。当两支注射器均完成装载后，将100微升PCR反应混合液注入载油注射器中，并将液滴微流控装置放置在配备高速相机的直立光学显微镜载物台上。为实时观察和记录液滴的形成过程，将预装好的注射器安装到可编程注射泵上，并使用带接头的三通连接件，将注射器管路与液滴微流控装置各入口通道的管路连接起来。将液滴发生器出口端的管路放入0.5毫升PCR管内，调节注射泵流速至2微升/分钟，使液滴大小在收集乳液前达到稳定。缓慢而小心地从管子顶部收集乳液，并将75微升溶液转移至200微升PCR管中用于热循环。随后，确认PCR管中的油相体积与分散相体积接近，以防止热循环过程中液滴发生聚并，然后将200微升PCR管放入热循环仪中。对于乳化样品的荧光成像，将PCR乳液转移至深度为50微米、横截面为矩形的硼硅酸盐毛细管中，以使液滴排列成紧密堆积的单层，便于成像。将毛细管固定并密封在显微镜载玻片上后，将载玻片置于倒置显微镜的载物台上。在显微镜成像软件中选择“采集”和“实时快速”模式，以启动实时相机采集。然后，在明场和荧光显微镜下观察样品。在液滴生成和热循环完成后，可将液滴引入横截面为一毫米宽、50微米高的玻璃毛细管中。为了获得适合荧光图像采集的单层液滴分布，可针对每个波长记录图像。图像分析后，可绘制各液滴在其相应荧光染料中的荧光强度，以确定阳性与阴性液滴的阈值。经识别与计数后，可计算每个液滴的拷贝数，并根据甲基化的 CD3Z 和 FOXP3 拷贝数相对于总细胞或 C 缺失基因的每液滴拷贝数，确定 CD3+ T 细胞和 CD4+25+ 调节性 T 细胞的百分比。随后可将这些百分比数值与使用相应抗体通过免疫荧光成像获得的结果进行比较。我认为，从液滴生成到热循环以及最终液滴成像的整个过程中，乳液的稳定性对于获得精确、可靠且可重复的定量结果至关重要。通过定制化的PCR反应体系配制，微滴数字PCR可用于多种应用，包括癌症研究、传染病诊断以及单细胞水平的分析。

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甲基化特异性多路复用液滴PCR，使用聚合物液滴发生器设备进行血液诊断

在本视频中，我们介绍了一种逐步生成乳化纳米液滴的实验方法，用于通过数字聚合酶链式反应（dPCR）检测目标核酸。...

微滴数字聚合酶链式反应：一种生成纳米微滴PCR反应以检测稀有肿瘤突变的方法

在本视频中，我们演示双通道数字PCR（ddPCR）技术——这是传统PCR技术的一种改进方法，可用于同时检测两种不同的遗传标志物。单个PCR反应被分割成纳升级大小的乳化液滴，每个液滴独立进行扩增，通过检测部分液滴中不同颜色的荧光扩增信号，计算出目标序列的初始浓度。...

双重数字PCR同时定量双基因标志物

本视频展示了多重液滴式聚合酶链式反应技术，用于同时定量不同白细胞群体中的甲基化DNA区域，作为临床诊断和预后的早期生物标志物。...

多重液滴聚合酶链式反应检测白细胞DNA甲基化

本文介绍了一种利用染料化学法和液滴数字PCR技术对无细胞microRNA进行高灵敏度和高准确度定量的检测方法。...

利用DNA结合染料化学法和液滴数字PCR定量循环微小RNA

本研究展示了一种在气动液滴操控平台上检测多位点核苷酸多态性的简单且可视化的方 法。利用该方法，整个实验过程（包括液滴操控和多位点核苷酸多态性检测）均可在接近23 °C的条件下完成，无需借助复杂的仪器设备。...

基于气动液滴操控平台的多位点核苷酸多态性可视化比色检测

本研究提供了一种用于制备基于液滴的微流控平台的方法，并应用聚丙烯酰胺微球进行微球-PCR扩增。微球-PCR方法能够在无需分离双链DNA的情况下获得单链DNA扩增产物。...

基于液滴的微流控方法与微球PCR扩增用于单链DNA扩增子

本文介绍一种利用液滴式数字PCR（drop-off...

单液滴数字聚合酶链式反应用于热点区域突变的全面同步检测

数字聚合酶链式反应（PCR）是一种用于高灵敏度检测单核苷酸变异和DNA拷贝数变异的有效工具。本文以管中芯片格式的数字PCR为例，展示利用该技术检测人类基因组中稀有变异时需考虑的关键因素。...

采用管中芯片格式对散发性家族性腺瘤性息肉病患者进行遗传变异数字聚合酶链式反应检测

本文介绍了一种检测患者生物流体（生物液体）中循环DNA内肿瘤体细胞突变的实验方案。我们基于微滴数字聚合酶链式反应（dPCR）的方法可定量检测肿瘤突变的等位基因频率（MAF），为肿瘤的诊断以及对肿瘤治疗反应的时序性监测提供一种微创的补充手段。...

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

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使用数字微滴聚合酶链式反应测量单细胞线粒体DNA拷贝数与异质性

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