Name: 恶性疟原虫 通过人工膜喂养进行配子体培养和蚊子感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习恶性疟原虫配子体培养与人工膜喂养技术，用于研究疟疾传播生物学和蚊子感染机制。本方法可生成感染性配子体，助力全球疟疾防控研究。

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作者感谢Bloomberg Philanthropies对约翰斯·霍普金斯大学疟疾研究所（JHMRI）提供的财政支持。本工作的完成离不开JHMRI昆虫学和寄生虫学核心设施所提供的专业技术支持。

以下所述的血液采集已获得约翰斯·霍普金斯大学机构审查委员会的批准。P. falciparum 在新鲜红细胞中于生物安全二级（BSL2）设施内无菌条件下培养，操作生物材料时需谨慎。每次接触血液或血液制品步骤后，所有塑料器皿或玻璃器皿均需在生物安全柜内用10%次氯酸钠溶液冲洗，然后妥善处理。
1. 试剂与准备
<ol>
	<li>使用疟原虫分离株 P. falciparum NF54（见材料表），该株在持续培养条件下可产生具有感染性的配子体，持续时间长达两个月。 
	注意：并非所有适应体外培养的疟原虫品系都能产生配子体，而低传代次数的NF54分离株表现最为稳定。</li>
	<li>O+ 红细胞：将全血与等体积的RPMI 1640培养基混合，于室温下在摆动转子离心机中以500 x g离心5分钟，减速设为0。小心移除上清液和白膜层（位于血浆与压积红细胞之间的白色条带，主要含有白细胞和血小板），再加入等体积的RPMI。重复洗涤两次，最后一次洗涤后加入相当于一个红细胞沉淀体积的RPMI，配制成50%血细胞比容的红细胞悬液，于4 °C保存。 
	注意：配子体成熟过程需约两周时间，因此使用新鲜红细胞起始培养至关重要，通常一周内采集的红细胞效果良好。</li>
	<li>O+ 人血清：至少混合6个单位的血清，以减少不同个体间血清成分正常变异的影响。使用0.2 µm滤器对混合人血清进行过滤除菌。根据需要分装成50 mL或更小体积，于-20 °C保存。 
	注意：红细胞和血清必须与P. falciparum培养所要求的血型相容。</li>
	<li>500倍次黄嘌呤溶液（100 mL）：将0.5 g次黄嘌呤溶解于100 mL的1 M NaOH中。过滤除菌后分装为5–10 mL小份保存。储存液可在-20 °C保存长达一年，在4 °C可保存两周。</li>
	<li>碳酸氢钠（可选）：将7.5 g碳酸氢钠溶解于100 mL去离子组织培养级水中，并用0.2 µm滤器过滤除菌。 
	注意：本实验方案采用蜡烛罐法为P. falciparum体外培养提供微需氧环境，无需添加碳酸氢钠。然而，若使用疟疾气体混合气（5% O2、5% CO2 和90% N2）进行培养，则必须在培养基中补充0.2%的碳酸氢钠。</li>
	<li>完全培养基：配制500 mL完全培养基时，向500 mL RPMI 1640中加入1 mL次黄嘌呤溶液和50 mL混合人血清。若使用疟疾气体混合气，则额外加入15 mL 7.5%碳酸氢钠溶液。完全培养基应保存于4 °C，一旦颜色由橙色变为粉红色即应弃用。为避免浪费，建议配制可供三日内使用的量。</li>
	<li>配子体出丝培养基（可选）：通过将200 mg NaHCO3、5 mg次黄嘌呤和100 µL黄尿酸（来自水中配制的100 mM储备液）溶解于100 mL不完全培养基（含谷氨酰胺和HEPES的RPMI 1640）中，制备配子体出丝或动合子培养基。 
	注意：出丝作用是指雌性按蚊吸食含有配子体的感染性血液后数分钟内，在其中肠内发生的雄性配子形成过程。疟原虫的雄性配子体经一次出丝事件可产生8个雄性配子。在体外条件下，当培养温度降至室温（RT）时，该过程可自发发生，并可在培养成熟的配子体中观察到。</li>
	<li>N-乙酰葡萄糖胺（可选）：将N-乙酰葡萄糖胺溶于水或不完全培养基中，配制成500 mM储备液，分装后于-20 °C保存。</li>
	<li>氯化钠溶液：将0.9 g、1.6 g和12 g NaCl分别溶于100 mL组织培养级去离子水中，配制成0.9%、1.6%和12%的NaCl溶液。使用0.22 µm滤器过滤除菌后，于4 °C保存。</li>
</ol>
2. P. falciparum 无性阶段培养
<ol>
	<li>开始寄生虫培养时，从液氮罐中取出一支低代次冻存的 P. falciparum NF54 冻存管，在 37 °C 水浴中迅速融化。</li>
	<li>将内容物（约 1 mL）转移至 50 mL 无菌离心管中，边轻轻振荡试管边逐滴加入预热的 12% NaCl 溶液，加入量为 0.2 倍体积，以确保充分混匀。室温孵育 5 分钟，期间间断轻柔振荡。</li>
	<li>继续边轻柔混匀边逐滴加入 9 倍体积的 1.6% NaCl 溶液。在室温下以 500 x g 离心 5 分钟，小心弃去上清液。再逐滴加入 9 倍体积的 0.9% NaCl 溶液，同时确保持续混匀寄生虫沉淀。再次在室温下以 500 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，将寄生虫重悬于 5 mL 完全培养基中。</li>
	<li>将悬液转移至 6 孔组织培养板的一个孔中，并加入 100–200 µL 压积红细胞（RBCs）。</li>
	<li>将寄生虫培养物置于 37 °C 条件下培养，可使用蜡烛缸，或在通入 5% O2、5% CO2 和 90% N2 混合气体的模块化培养室中进行。</li>
	<li>每天更换培养基，并在常规换液时吸除培养上清液后，从沉降的红细胞层中吸取少量微升液体，制备薄血涂片以监测寄生虫生长情况。</li>
	<li>使用无菌玻璃巴斯德吸管吸取培养物，轻敲吸管末端使一滴培养物滴落于载玻片中央。将另一张载玻片置于液滴前方，向后拉动使其接触红细胞，再迅速向前推动一次完成动作，形成单层红细胞的薄涂片。</li>
	<li>将载玻片水平放置于干燥架上，使其自然风干。通过在涂片上滴加无水甲醇固定血膜。待固定后的涂片完全干燥后，小心倾倒新配制的 10% 吉姆萨染液，直至完全覆盖血涂片，染色约 15 分钟。</li>
	<li>用洁净的自来水冲洗载玻片以去除多余染液，并将载玻片垂直放置晾干。</li>
	<li>在显微镜下使用油浸物镜（100×）观察薄血涂片，确定寄生虫血症率。计数至少 500 个红细胞中被感染的红细胞数量，计算寄生虫血症百分比。</li>
</ol>
3. P. falciparum 配子体培养
注意：配子体培养需要两周时间才能产生对蚊子具有感染性的成熟配子体。配子体培养的步骤如图1所示。P. falciparum 分离株在长期体外培养后通常会失去产生配子体的能力13。为确保配子体的质量，培养应起始于低代次的饲养培养物，且自解冻以来不超过2个月。将培养基预热至37 °C，并在设定为38 °C的载片加热器上进行所有操作。应尽量减少配子体培养物离开培养箱的时间，以避免温度波动。
<ol>
	<li>在第0天，使用混合的无性体阶段饲养培养物接种配子体培养物，寄生率控制在0.3-1%，红细胞压积为4%。</li>
	<li>为建立六孔板配子体培养体系，取5 mL饲养培养物，在室温下以500 x g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于30 mL完全培养基中。</li>
	<li>加入1.2 mL压紧的红细胞，混匀后，每孔加入5 mL培养液，置于烛缸中37 °C培养。 
	注：上述配子体培养体系的建立基于寄生率为5%的混合无性体阶段饲养培养物。</li>
	<li>在15-18天内每天更换培养基，不添加新鲜血液，小心吸出约70-80%的培养上清液，避免吸走血细胞。</li>
	<li>向每孔中加入5 mL新鲜完全培养基。换液时，使用移液管沿孔壁缓慢加入培养基，以避免扰动已沉降的红细胞层。 
	注：由于换液过程中会残留1-2 mL培养液，配子体培养第1天后总体积将在6-7 mL之间。在适应本方案时，建议每隔一天制作一次血涂片，以确保寄生虫状态良好。制作血涂片可能消耗较多细胞，为避免此问题，应仅吸取极少量培养物。</li>
	<li>为定量成熟配子体比例，在第15-18天制作血涂片，统计成熟配子体占总细胞数的比例。 
	注：成熟配子体具有典型的弯月形结构，末端光滑圆润，易于识别（图5B）。</li>
	<li>至少计数1,000个红细胞，计算其中被成熟配子体感染的红细胞百分比。</li>
	<li>为定量出丝现象，取200 µL配子体培养物，加入预热的离心管中，室温下以500 x g离心5分钟。将沉淀重悬于20 µL出丝培养基中，转移至载玻片并加盖盖玻片。</li>
	<li>室温孵育15分钟后，使用10倍物镜在相差显微镜下开始计数出丝中心。至少计数四个视野的出丝中心，以计算出丝事件数量。 
	注：Delves等10此前已详细描述出丝实验的方法。每个视野超过20个出丝事件即认为适合进行膜饲喂实验。</li>
	<li>配子体培养物中通常残留少量无性体阶段。若实验需要纯配子体，可用50 mM N-乙酰葡萄糖胺处理培养物。</li>
	<li>每孔（5 mL）加入0.5 mL来自10倍储存液的N-乙酰葡萄糖胺，在换液时持续处理至少3天，以清除残留的无性体阶段。 
	注：N-乙酰葡萄糖胺也可能抑制性成熟裂殖子的侵入，因此处理应在配子体培养第7天之后才开始。</li>
</ol>
4. 采用标准膜饲法（SMFA）感染蚊子
注意：体外培养的配子体可通过玻璃膜饲喂器喂食蚊虫。血液饲喂装置的组装如图所示。 图2如上所述，始终将配子细胞保持在 37 °C 以避免蚊子摄取前发生激活。预热用于配子体培养的塑料器皿、试剂和设备 37 °C.
<ol>
	<li>饥饿处理3至7日龄雌性 按蚊属 通过在膜饲喂前将蚊虫的糖水移除6.5小时或过夜，使其饥饿。</li>
	<li>使用电动或口控吸虫器将它们转移到覆盖有双层细网织物的纸杯中。或者，也可将蚊子置于低温房间或冰箱中使其麻痹后，再转移至纸杯中。 
	注意：一品脱大小的杯子最多可用于喂养100只蚊子。</li>
	<li>将洗涤后的血液在500 ×g离心 x g 室温下孵育5分钟，弃去上清液。加入等体积新鲜解冻的人血清以重建全血。将血液与血清混合物转移至设定好的水浴中 37 °C 30分钟</li>
	<li>将配子体培养物转移至预热的15 mL塑料管中，在600 ×g条件下离心 x g 5 分钟 37 °C小心吸除培养上清液，并按上述方法制备薄血涂片以确定成熟配子体血症率。</li>
	<li>为了制备最终的血液饲料，使用重悬的全血将配子体沉淀稀释至所需浓度。将血液饲料保持在 37 °C 直到蚊子和玻璃饲喂器准备就绪。 
	注意：成熟的配子体浓度在 0.02% 至 0.3% 之间可提供稳定的蚊虫感染性。然而，建议通过将不同浓度的配子体分别饲喂给不同杯的蚊虫来优化配子体血症水平。</li>
	<li>确保玻璃膜饲器有两个开口，上方的窄口用于移液加入感染血液，下方的开口用于固定膜。将石蜡膜切成方形，拉伸至厚度均匀，然后贴附在饲器开口上，以形成密封的血液饲喂腔室。</li>
	<li>通过在膜式饲喂器两侧连接管道，将其接入循环水浴装置，使温水可在膜式饲喂器周围的夹层中流通。 
	注意：可将多个玻璃饲喂器串联，以适应多种饲喂条件。</li>
	<li>将所有进液管连接至水浴后，打开水浴并检查是否存在任何泄漏。</li>
	<li>将饲喂器置于蚊杯网纱的中央，膜面朝下，并使用夹子或胶带固定饲喂器。确保饲喂器无任何倾斜，以保证血液均匀分布，并使饲喂器整个底部与蚊杯上的网纱紧密接触，从而使蚊子可从杯内接触到饲喂器。</li>
	<li>移液约200–1000 μL 血液注入膜饲喂器。 
	注意：血液喂食的体积需根据蚊虫数量和膜饲器大小进行调整。对于14 mm玻璃饲器和50只蚊虫，使用 200 μL 血液喂养</li>
	<li>确保加样操作正确，并且血液饲料已覆盖在石蜡膜上。</li>
	<li>让蚊子间歇性监测下吸血约30分钟。 
	注意：用嘴轻轻向蚊虫吹气以提供 CO₂2 从而促进更有效的吸血。</li>
	<li>在冷室中击倒未吸血的蚊虫以将其移除。通过肉眼检查蚊虫腹部是否存在膨隆和发红现象，以判断其是否摄取了新鲜血餐。或者，可使用口控吸管选择性移除未吸血的蚊虫。</li>
	<li>弃去未吸血的蚊虫，将其浸入70%乙醇中；将已吸血的蚊虫放回蚊虫饲养杯中。</li>
	<li>双笼蚊杯并转移至指定用于感染人类疟原虫蚊子的高防护培养箱 P. falciparum.</li>
	<li>将浸有10%蔗糖溶液的棉垫置于蚊子饲养杯中，为蚊子提供糖餐。每两天更换一次棉垫，直至蚊子被解剖。</li>
</ol>
5. 蚊子中肠解剖及卵囊载量定量
注意：中肠解剖的示意图见图3。
<ol>
	<li>末次吸血后7-8天，将蚊子杯置于4 °C环境中10分钟，使蚊子麻醉。</li>
	<li>用尖头镊子将待解剖的蚊子转移至置于冰上的培养皿中。</li>
	<li>将蚊子浸入70%乙醇中1-2分钟以处死。待所有蚊子处死后，向培养皿中加入PBS以洗去乙醇。 
	注意：在加入PBS前，需确认所有蚊子均已死亡。</li>
	<li>将载玻片置于解剖显微镜下，在中央滴加100 μL PBS。用镊子小心转移一只蚊子进入PBS中，其余蚊子仍保留在冰上的培养皿中。</li>
	<li>用尖头镊子夹住蚊子腹部从后端数第三个节段，另一把镊子夹住胸部与腹部连接处，轻轻拉出腹部，直至中肠完全暴露。</li>
	<li>弃去蚊子其余组织，将中肠转移至另一干净载玻片上，滴加数滴PBS。</li>
	<li>完成所需数量蚊子的解剖后，用移液器小心吸去PBS，并用0.2%汞红染色液对中肠染色2-5分钟。</li>
	<li>去除多余的汞红染色液，将中肠在载玻片上排列整齐，以便在光学显微镜下清晰观察。</li>
	<li>盖上盖玻片，在10倍物镜下计数每个中肠上的卵囊。卵囊呈粉红色，圆形（图6C）。</li>
</ol>
6. 蚊虫唾液腺解剖及子孢子载量定量
注：唾液腺解剖示意图如图所示 图 4.
<ol>
	<li>末次吸血后14-18天，将蚊子置于4 °C环境中10分钟。 
	注意：需等待蚊子完全停止活动。</li>
	<li>在等待蚊子停止活动期间，准备解剖所需工具。</li>
	<li>将玻璃板放置于解剖显微镜载物台上。准备两套带25 G针头的1 mL注射器、一支9”巴斯德吸管及橡胶球。在6孔板中分别加入70%乙醇和解剖介质（HBSS、L-15或PBS）。</li>
	<li>在低温室中，将麻醉后的蚊子转移至含有70%乙醇的6孔板中。用镊子轻轻搅动蚊子，确保所有蚊子均被浸透，随后用镊子将蚊子转移至解剖介质中以洗去70%乙醇。</li>
	<li>转移至解剖室，将蚊子置于解剖显微镜载物台上。</li>
	<li>去除蚊子表面多余的液体，根据需要在解剖过程中添加新的解剖介质。注意避免蚊子干燥，但液体过多也会增加解剖难度。</li>
	<li>使用两支带25 G针头的注射器，分别固定蚊子的胸部和头部，轻轻向上拉动头部，将唾液腺从胸部拉出。</li>
	<li>用针头将唾液腺与头部和胸部分离。</li>
	<li>暂时将唾液腺置于玻璃板上另一滴解剖介质中。</li>
	<li>解剖获得15-20对唾液腺后，使用巴斯德吸管将其收集至低吸附离心管中。 
	注意：一旦唾液腺进入巴斯德吸管较宽的部分，便会粘附在玻璃壁上，难以完全取出。</li>
	<li>通过小型台式离心机短暂离心沉淀唾液腺。小心去除解剖介质，避免扰动沉淀物，然后加入100 µL新鲜解剖介质。</li>
	<li>使用小型匀浆器研磨唾液腺1分钟，以释放子孢子。</li>
	<li>取10 µL含子孢子的解剖介质滴加至血细胞计数板上。 
	注意：根据唾液腺数量，可能需要将子孢子悬液用解剖介质稀释1:10至1:50后再进行计数。</li>
	<li>计数四个象限中的两个，计算每只蚊子所含子孢子数量：</li>
</ol>
<img alt="子孢子浓度计算公式；用于定量样品中每毫升子孢子数量的方法。" src="/files/ftp_upload/61426/61426equ01v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 1">
<img alt="稀释计算图示中用于细胞计数分析的子孢子浓度计算公式。" src="/files/ftp_upload/61426/61426equ02v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 2">
<img alt="子孢子数量计算公式，每只蚊子平均子孢子数的公式，科学分析。" src="/files/ftp_upload/61426/61426equ03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3">

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<li>Tao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-partitioning+of+the+Plasmodium+falciparum+stage+V+gametocyte+proteome+provides+insight+into+falciparum-specific+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).</li>
<li>Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+enhanced+chemiluminescent-ELISA+for+the+detection+of+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+antigen+in+midguts+of+Anopheles+stephensi+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).</li>
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<li>Espinosa, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+Cleavage+of+the+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+Is+a+Target+of+Protective+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).</li>
<li>Swearingen, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+Plasmodium+Sporozoite+Surface%3A+Identification+of+Surface-Exposed+Proteins+and+Demonstration+of+Glycosylation+on+CSP+and+TRAP+by+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606(2016).</li>
<li>Ifediba, T., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vitro+maturation+of+Plasmodium+falciparum+gametocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes.</a> Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inter-laboratory+comparison+of+standard+membrane-feeding+assays+for+evaluation+of+malaria+transmission-blocking+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines.</a> Malaria Journal. 15, 463(2016).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualification+of+Standard+Membrane-Feeding+Assay+with+Plasmodium+falciparum+Malaria+and+Potential+Improvements+for+Future+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays.</a> PLoS One. 8 (3), 57909(2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法已在约翰斯·霍普金斯大学疟疾研究所成功应用十余年15,16,17,18,19,20,21,22使用本方案产生的配子细胞已用于高通量抗配子细胞药物筛选实验22，用于蛋白质组学15以及转录组学研究23 研究。然而，开发这些方法的一个主要原因是利用成熟的配子体感染蚊子，以开展蚊体阶段及子孢子的相关研究23...

疟疾由疟原虫（Plasmodium）寄生虫引起，并通过雌性按蚊（Anopheles）的叮咬传播给脊椎动物宿主。根据世界卫生组织（WHO）2019年的报告，全球估计有2.28亿例疟疾病例，导致约40.5万人死亡1。大多数疟疾相关死亡集中在非洲地区，尤其是五岁以下儿童。尽管自2010年以来全球疟疾总体发病率有所下降，但近年来下降趋势已趋于平缓，迫切需要采取额外的防控策略以彻底消除该疾病。
疟原虫的周期性无性血液阶段导致疾病的发生，其中一小部分会分化为雌性和雄性配子体。Plasmodium falciparum&#160;配子体在自然界中具有独特性，其需要7-10天时间经历五个形态学上明显不同的阶段才能发育成熟。I至IV期的未成熟配子体被滞留在骨髓实质中，通常不会出现在外周血液循环中2,3,4,5。携带成熟V期配子体的红细胞被释放入血流，自由循环并可被蚊子摄取。一旦进入蚊子中肠，配子体通过温度变化及中肠环境的刺激被激活，转化为雌性和雄性配子，并启动蚊体内发育阶段，最终在蚊子唾液腺中形成具有感染能力的子孢子6,7。
自从 Trager 和 Jenson8 描述了一种培养 P. falciparum 的标准化方法以来，对无性血液阶段的研究取得了巨大进展。然而，由于缺乏可靠的有性阶段培养系统，对 P. falciparum 配子体、传播生物学以及蚊媒阶段的研究一直较为困难。近年来，已有多种方法被发表，帮助实验室建立了配子体培养体系9,10,11,12。本文描述了一种标准化且可靠的 P. falciparum 配子体培养方案，可为疟疾研究领域提供有价值的资源。该方法能够稳定地产生成熟且具有感染性的配子体，结合标准化的蚊子饲喂方案，可实现高度可靠的蚊子感染率。这些方法的建立旨在维持配子体及蚊媒阶段寄生虫的持续供应。在本文中，我们详细描述了完整的配子体培养流程（图 1）、玻璃膜饲器的制备及利用这些饲器感染蚊子的方法（图 2）、蚊子中肠（图 3）和唾液腺（图 4）的解剖操作，以及在中肠和唾液腺解剖后对蚊子感染程度的定量分析。

<table><tbody><tr><td>10% 糖溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 血清移液管</td><td>Falcon</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 血清移液管</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C 培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 血清移液管</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot; 玻璃移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Anopheles 蚊子</td><td>JHMRI, 昆虫饲养核心</td><td></td><td>我们使用 A. stephensi 或 A. gambiae (keele)</td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>循环水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细尖镊子</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>吉姆萨染液</td><td>Sigma</td><td>GS1L</td><td></td></tr><tr><td>玻璃干燥器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃膜饲器</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG183570</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>人血 O+</td><td>JHU</td><td></td><td>用 RPMI 洗涤红细胞三次，并以 50% 红细胞压积浓度冷藏</td></tr><tr><td>人血清 O+</td><td>Interstate 血库</td><td></td><td>混合至少来自不同供体的 6 份血清，并将分装样品在 -20&amp;deg;C 冻存</td></tr><tr><td>次黄嘌呤</td><td>Sigma</td><td>H9337</td><td>用 1 M NaOH 配制 500 倍浓缩液</td></tr><tr><td>汞溴红</td><td>Sigma</td><td>M7011</td><td>用 PBS 配制 1% 储存液，使用时可稀释至 0.1%</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>任何配备 10x、40x 和 100x 物镜的显微镜均可使用</td></tr><tr><td>蚊子饲养杯</td><td>Neptune 杯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰葡糖胺</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td>可选，仅在需要纯配子体时使用</td></tr><tr><td>网罩</td><td></td><td></td><td>确保其能够容纳蚊子并允许吸血</td></tr><tr><td>封口膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>249964</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液枪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Plasmodium falciparum&lt;/em&gt; NF54</td><td>BEI Resources</td><td>MRA-1000</td><td>冻存大量早期传代的培养物，以确保持续供应</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>CV-041-CV</td><td>培养基含有谷氨酰胺和 HEPES</td></tr><tr><td>玻片加热台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>培养基中可选，仅在培养期间使用疟疾气体混合物时添加</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>黄尿酸</td><td>Sigma</td><td>D120804</td><td>用于配子鞭毛形成培养基</td></tr></tbody></table>

plasmodium falciparum 配子体培养及通过人工膜饲喂感染蚊虫

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

疟疾仍然是最重要的公共卫生问题之一，导致显著的发病率和死亡率。疟疾是一种蚊媒疾病，通过受感染的雌性按蚊叮咬传播 按蚊属 蚊子。疟疾防控最终将依赖于多种方法，包括阻断疟原虫向蚊子、在蚊子体内以及从蚊子传播的途径。为了在实验室中研究疟原虫在蚊子体内的发育阶段，我们优化了一种培养高感染性疟原虫的方案。 恶性疟原虫 配子体，这是疟原虫从人类宿主传播至蚊媒所必需的寄生阶段。 P. falciparum 配子体经过五个形态学上不同的成熟阶段，大约需要1至2周时间。本方案所述的配子体培养周期为15天，培养至第15至18天时对蚊子具有感染性。这些方案旨在维持具有感染能力的配子体的连续传代，并持续提供疟原虫的蚊期阶段。本文介绍了配子体培养的方法，以及如何使用玻璃膜饲喂器（glass membrane feeders）将这些寄生虫感染蚊子。

本文展示了使用上述方案制备的P. falciparum NF54 配子体培养物进行的一系列膜饲实验的结果（见图5）。配子体培养于第0天开始，接种约0.5%混合发育阶段的无性体培养物，至第4天和第5天时寄生率峰值达到约15%。如图5A所示，在如此高的寄生率下，疟原虫处于应激状态，无性体阶段培养物随之崩溃。然而，这种应激状态同时诱导了配子体形成。早期配子体在第6天至第7天后出现，无性体寄生率逐渐下降，但仍维持在较低水平。无性体阶段疟原虫的存在不影响蚊虫饲喂实验。然而，若配子体需用于需要纯培养物的实验，例如药物敏感性检测或蛋白质组学、转录组学研究，则可通过50 mM N-乙酰葡糖胺处理去除残留的无性体阶段。大多数配子体在第15天发育至V期，此时已具有感染蚊虫的能力，可用于饲喂实验。图5B展示了配子体培养启动后不同时间点的吉姆萨染色血涂片代表性图像。
末次喂血后8至10天，解剖蚊虫以测定感染率和...

对疟原虫蚊期阶段进行详细研究，对于设计有效的阻断传播策略至关重要。本方案展示了如何有效培养具有感染性的配子体，并将这些配子体喂食给蚊子，以获得恶性疟原虫（P. falciparum）的蚊期阶段。

Plasmodium falciparum 配子体培养及通过人工膜饲喂感染蚊虫

疟疾仍然是最重要的公共卫生问题之一，导致显著的发病率和死亡率。疟疾是一种由蚊子传播的疾病……

配子体负责疟原虫的传播。在实验室中产生具有感染性的配子体，对于研究疟原虫在蚊体阶段的传播生物学以及制备用于后续实验的子孢子至关重要。这些方法简便易行，易于任何实验室采用，而通过可视化演示将有助于向全球疟疾研究群体推广这些技术流程。与我共同演示该实验步骤的是我的同事，来自约翰斯·霍普金斯大学疟疾研究所的高级研究助理 Godfree Mlambo 和博士后研究员 Sachie Kanatani。为建立配子体培养体系，先将 5 毫升饲养细胞培养物在离心机中离心，然后将沉淀重悬于 30 毫升完全培养基中。将 1.2 毫升压积红细胞与管内液体混合，再将 5 毫升该混合悬液加入六孔培养板的每一孔中。然后将培养板放入37摄氏度的烛缸中。在接下来的15至18天内，每天小心吸出每孔70%至80%的培养上清液，并用血清移液管沿每孔壁缓慢加入5毫升不含血细胞的新鲜培养基，以喂养培养物，同时避免扰动已沉降的红细胞层。为定量成熟配子体血症，在第15至18天制备血涂片，计数至少1000个红细胞中成熟配子体的数量，以计算感染成熟配子体的红细胞百分比。为了定量配子体出丝现象，将200微升配子体培养物在预热的离心管中离心，然后将沉淀重悬于20微升出丝培养基中。将配子体悬液转移至载玻片上并加盖盖玻片，在室温下孵育15分钟。孵育结束后，使用10倍物镜在相差模式下至少计数四个视野中的出丝中心，以计算出丝事件的数量。采用标准膜饲法感染蚊子时，将三至七日龄的雌性按蚊蚊笼中的糖水移除6.5至18小时，然后使用吸蚊器将最多100只蚊子转移至单个纸杯中，纸杯口覆盖双层细网织物。通过离心收集洗涤后的血液，并加入等体积新鲜解冻的人血清重悬血液。将重悬的血液在37摄氏度水浴中预热30分钟，将配子体培养物转移至预热的15毫升塑料离心管中进行离心，并对沉淀物制备薄血涂片，以确定成熟配子体血症水平，方法如所示。为了制备最终的血液饲料，使用重悬的全血将配子体沉淀稀释至适当的实验浓度，并将血液饲料置于37摄氏度直至蚊子和玻璃饲喂装置准备就绪。将一块方形石蜡膜均匀拉伸，并覆盖在饲喂器的顶部开口上，以形成一个密封的血液饲喂腔室。在两侧使用连接管将膜饲喂器与循环水浴连接，使温水能够流经饲喂器周围的夹层。当实验所需的所有饲喂装置连接完毕后，启动水浴并检查所有设备是否存在泄漏。将饲喂装置放置在蚊杯纱网中央，膜面朝下，并将饲喂装置固定在纱网上，保持直立状态。当所有饲喂装置均被优化定位后，向每个膜饲喂装置中加入 200 至 1000 微升血液饲料，并检查饲料是否已均匀覆盖于石蜡膜表面。经过约30分钟的间歇性监测喂食后，将蚊子置于低温房间中使其麻痹，并肉眼检查蚊虫腹部是否出现膨大和发红现象。将已喂食的蚊子放回蚊子饲养杯中，在杯口放置浸有10%蔗糖溶液的棉垫以提供糖分营养，随后将饲养杯进行双重套笼以确保感染蚊子的安全，然后将蚊子转移至专用于

plasmodium-falciparum-gametocyte-culture-mosquito-infection-through

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

恶性疟原虫 通过人工膜喂养进行配子体培养和蚊子感染

一旦某个基因被鉴定为可能对登革热病毒具有抗性，就必须评估其在蚊子体内预防病毒感染的作用。本实验方案展示了如何检测蚊子中登革热病毒感染的程度。文中演示了病毒在细胞培养中扩增、通过膜饲法使蚊子吸食人血以及检测蚊子中肠内病毒滴度的技术。...

埃及伊蚊（A. aegypti）登革病毒感染实验方案及感染表型测定

一旦某个基因被鉴定为可能具有抗疟疾特性，就必须评估其在蚊子体内抑制疟原虫感染的作用。本方案展示了如何检测疟原虫在蚊子体内的感染程度。文中演示了配子体培养的制备、通过膜饲法使蚊子吸食含人类血液的样本，以及检测蚊子中肠内病毒滴度的技术。...

恶性疟原虫蚊虫感染方案及感染表型测定

本视频展示了脑型疟疾小鼠实验模型的建立。从感染疟原虫的按蚊中分离出的子孢子被用于感染小鼠，以模拟人类脑型疟疾的病理过程。 疟原虫伯氏疟原虫将感染的雌性蚊子注入被固定的实验小鼠尾静脉，可导致血脑屏障破坏和脑部炎症，从而引发脑型疟疾。该感染小鼠模型为研究脑型疟疾提供了重要的工具 体内...

利用宿主蚊媒来源的子孢子建立小鼠实验性脑型疟疾模型

结核病和疟疾是人类中最常见的两种感染性疾病，也是热带地区贫困人群中发病和死亡的主要原因。我们建立了一个实验模型系统，用于研究小鼠经自然感染途径同时感染疟原虫和结核分枝杆菌后，疟疾-结核共感染的结果。...

一种用于研究结核病与疟疾共感染的实验模型——基于自然传播途径 结核分枝杆菌 和 疟原虫伯氏疟原虫

我们描述了一种实验性脑型疟疾的小鼠模型，并展示了如何追踪炎症和微血管病理变化 体内 使用磁共振成像。...

体内追踪实验性脑型疟疾模型中水肿发展及微血管病理变化的磁共振成像研究

由于啮齿类疟原虫在生命周期和生物学特性上与人类疟原虫具有显著相似性，啮齿类疟疾模型已成为疟疾研究不可或缺的工具。本文中，我们对野生型和转基因啮齿类疟原虫进行表型分析时所使用的一些最重要技术进行了标准化。...

啮齿类疟原虫无性与有性血液阶段及蚊期阶段的表型分析

标准膜饲法（SMFA）被认为是评估和鉴定潜在抗疟化合物的金标准。该人工饲喂系统用于感染蚊子，以进一步评价这些化合物对Plasmodium...

标准膜饲法检测 恶性疟原虫 感染 按蚊属 蚊媒

在此，我们介绍一种新方法，以帮助阐明细胞免疫的机制 疟原虫 感染的血液阶段。这是一个 体外...

体外检测细胞毒性淋巴细胞杀伤疟原虫感染红细胞的实验

疟疾通过子孢子阶段的接种传播 疟原虫 通过感染的蚊子传播。转基因 疟原虫 使我们能够更深入地理解疟疾的生物学特性，并直接推动了疟疾疫苗的研发工作。在此，我们描述了一种简化的转基因制备方法 疟原虫伯氏疟原虫...

生成基因修饰的Plasmodium berghei子孢子

化学遗传学涉及在靶位点处将看门残基替换为含有不同侧链的氨基酸。在此，我们构建了一种含有cdpk1功能低下等位基因的突变寄生虫，并鉴定了该突变背景下寄生虫所采用的补偿性通路。...

理解携带植物样激酶功能低下等位基因的突变疟原虫中补偿通路的发育

疟原虫的有性发育发生在蚊子的中肠内。靶向寄生虫的有性阶段是阻断传播的一种有前景的策略。我们开发了Ookluc，这是一种在合子形成后表达纳米荧光素酶的转基因P.

Ookluc：一种用于鉴定阻断传播化合物的Plasmodium berghei菌株

学习恶性疟原虫配子体培养与人工膜喂养技术，用于研究疟疾传播生物学和蚊子感染机制。本方法可生成感染性配子体，助力全球疟疾防控研究。

Plasmodium falciparum 配子体培养及通过人工膜饲喂感染蚊虫

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