Name: 近同步激光扫描在活细胞上的共和和原子力显微镜（康波卡尔） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 了解Conpokal技术，该技术将近同步激光扫描共聚焦显微镜与原子力显微镜相结合，用于活细胞的荧光共定位与机械特性表征。此方法为机械生物学研究提供了详细的细胞力学分析方案。

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我们承认美国国立卫生研究院（NIH）COBRE项目编号P20GM130456提供的资助。感谢肯塔基大学光镜核心设施（UK Light Microscopy Core）在本研究中提供的协助，该设施由研究副校长办公室支持。本研究中所使用的变形链球菌（S. mutans）和粪肠球菌（E. faecalis）菌株由Natalia Korotkova博士提供。&#160;将共聚焦显微镜与原子力显微镜结合的技术描述为“Conpokal”这一文字游戏的首次提出，归功于肯塔基大学化学与材料工程系的Brad Berron博士，在与通讯作者Martha Grady博士讨论迎接2017年秋季加入该校化学与材料工程系的讲座嘉宾Jonathan Pham博士时提出。

1. 仪器、培养基和培养皿的准备
<ol>
	<li>打开共聚焦显微镜和原子力显微镜以及在 Conpokal 实验过程中使用的所有其他相关仪器或设备的电源。在开始测量前，留出足够的时间让仪器达到热平衡并稳定。通常，1 小时足够。</li>
	<li>准备一个洁净且系统认可的玻璃底培养皿，加入磷酸盐缓冲液（PBS）或其他类似的透明液体，液量约为培养皿一半，但不得超过三分之二。该培养皿（称为“校准皿”）与样品皿分开，用于定位和校准原子力显微镜（AFM）的悬臂梁。 
	注意：液体应保持透明且自发荧光较低，以避免对荧光光谱造成干扰。推荐使用 PBS，因其可模拟生物环境。</li>
	<li>准备实验样品皿，使其中的液体至少填充至培养皿一半。若样品具有荧光性，应将其覆盖或置于暗处，直至使用。使用镜头清洁剂和镜头纸清洁所有玻璃培养皿的底部。</li>
	<li>在计算机硬盘上分别为共聚焦显微镜和原子力显微镜创建数据存储文件夹。</li>
</ol>
2. 细胞或微生物的选择
<ol>
	<li>为制备细菌储备液，接种 Streptococcus mutans 细菌，使用接种环，在15 mL Todd Hewitt酵母培养基（THY）中于5% CO₂条件下过夜培养（用于指数生长期）2 培养箱</li>
	<li>在过夜孵育结束前1小时，向实验用样品皿中加入1 mL多聚-L-赖氨酸溶液，或足量覆盖玻底皿的玻璃区域，置于生物安全柜中孵育1小时。孵育结束后，吸除多聚-L-赖氨酸溶液，并用PBS洗涤皿内表面3次。</li>
	<li>细菌孵育18–24小时后，取1 mL细菌悬液接种于THY培养基中，直至达到0.6–0.7的光密度（通常接种量为每皿3 mL THY加入1 mL细菌悬液）。向每个聚-L-赖氨酸包被的培养皿中加入1 mL新鲜细菌溶液，孵育1小时。在最后10分钟内，向其中加入1 mL绿色荧光膜染料（浓度为1 &#181;M）加入每个培养皿中。</li>
	<li>每个培养皿用 PBS 洗涤 3 次。在生物安全柜中，室温下加入约 1 mL 4% 多聚甲醛溶液轻柔固定细菌 15 分钟。固定后，每个培养皿再用 PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>将人胚胎肾（HEK）293细胞保存于液氮中，在37℃下快速解冻 &#730;C 水浴中预热后接种。</li>
	<li>向每个细胞样品中加入1 mL含细胞培养基的基底膜基质溶液&#160;培养皿并置于5% CO₂条件下培养2) 在 37 &#730;C 下孵育 1 小时。吸除溶液，并用细胞培养基洗涤培养皿。接种所需数量的 HEK 293 细胞（例如，每35 mm培养皿接种100,000个细胞）并加入2 mL细胞培养基。随后，在5% CO₂条件下培养237℃下培养细胞 &#730;C，48 小时。</li>
	<li>48小时后，加入2 &#181;向每个细胞样品皿中加入 L 的荧光微管细胞骨架染料（浓度为 1x），孵育 30 分钟。吸除含染料的溶液，用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后加入 2 mL 细胞培养基。</li>
	<li>加入1 &#181;L 血浆膜染料（浓度为 10 &#181;M）加入样品皿中，孵育30分钟。用PBS洗涤含染料的溶液3次，然后加入2 mL细胞培养基。</li>
	<li>通过添加1对细胞核进行复染 &#181;核酸染料（浓度为10）的L &#181;将 M) 溶液加入样品皿中，孵育 30 分钟。用 PBS 洗涤含染料的溶液 3 次，然后加入 2 mL 培养基。</li>
</ol>
3. 原子力显微镜操作步骤
<ol>
	<li>单击计算机上的软件图标，打开原子力显微镜（AFM）操作软件。</li>
	<li>旋转至或插入低倍空气物镜（推荐10倍或20倍）。在探针下降和校准过程中，5 mm或更长的工作距离将更为有利。</li>
	<li>若尚未安装，先安装选定的细胞样品台。对于活体样品，使用培养皿加热器以维持样品在所需温度。</li>
	<li>将装有半满 PBS（步骤 1.2 中制备）或类似透明液体的洁净且经系统认可的培养皿（校准皿）放入载物台。如果样品台配有内置夹具，则使用这些夹具固定；否则，使用真空脂固定样品。</li>
	<li>选择适合所需数据采集的原子力显微镜悬臂梁，并按照以下步骤进行安装。
	<ol>
		<li>使用手套，利用原子力显微镜（AFM）探针芯片安装台、镊子和小螺丝刀将AFM探针芯片安装到玻璃基块上。小心地将AFM探针芯片放置在玻璃基块上，并调整方向使其居中。悬臂及AFM探针芯片的一小部分应位于安装基块的透明可视区域内。</li>
		<li>使用螺丝刀拧紧螺丝，将芯片牢固地固定在玻璃块上。利用体视显微镜或手持放大镜检查原子力显微镜（AFM）悬臂是否正确朝向，必要时进行调整。确认方向正确后，将玻璃块按正确方向放入AFM探头中，并固定到位。 
		注意：AFM芯片在玻璃块中的方向至关重要，以确保系统激光正确瞄准悬臂背面并反射到光电探测器上。安装过程中切勿过度拧紧螺丝，以免导致AFM芯片、悬臂或探针损坏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用共聚焦显微镜的明场模式，通过调焦旋钮找到校准皿的底部。记录此 z 高度值，作为相对于显微镜物镜位置的皿底位置值。</li>
	<li>使用计算机上控制z轴步进电机的AFM系统电机控制面板，将AFM悬臂向上移动，远离样品2000 &#181;m</li>
	<li>用双手轻轻将带有AFM芯片的AFM探头放置到样品台上，确保AFM探头上的每个垂直定位点均牢固地嵌入AFM台对应的凹槽中。AFM探头就位后，目视观察悬臂支架与培养皿之间的距离。若发现间距过小，即AFM探头已接触或距离样品皿顶部不足1 mm，应在将AFM针尖向下移动至样品前，先使用z轴步进电机将探头后撤。</li>
	<li>使用明场照明，通过原子力显微镜（AFM）软件上的 z 轴步进电机控制面板，缓慢将 AFM 芯片降至玻璃培养皿底部。找到位于仪器平台上用于控制 AFM 探头在 x-y 平面内移动的手动微调旋钮。当悬臂进入视野时，通过调整 AFM 探头的位置，使 AFM 悬臂位于视野范围内。
	<ol>
		<li>由于此时相对于培养皿底部的位置未知，应以100–200为步长逐步降低 &#181;m，以避免AFM针尖撞击到培养皿。通常，针尖需要下降800 – 2000 &#181;m. 当探针下降时，观察显微镜软件视野中是否出现阴影，该阴影表明原子力显微镜探针正接近培养皿底部。</li>
		<li>将增量减小至 20 – 50 &#181;m. 当探针逐渐下降进入培养皿时，务必通过共聚焦软件中的LUTs面板调整相机图像的查找表（LUTs）。继续以微小步进降低原子力显微镜（AFM）探针，直至其基本处于焦平面内。</li>
		<li>确保针尖足够暗，以便能够看清其整体形状并将其居中于视野中。同时确保针尖呈现模糊状态，以确认其尚未接触到培养皿底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调节显微镜焦距，使探针尖端处于焦点位置，同时注意物镜的工作距离。在切换至更高倍率的物镜之前，通过共聚焦软件中的测量工具面板，使用显微镜测量功能获取原子力显微镜（AFM）悬臂梁的宽度和长度，并记录这些测量值。 
	注意：切勿使物镜撞击样品皿底部，否则可能导致样品皿移位或损坏&#160;与原子力显微镜针尖接触，可能会对其造成损坏。</li>
	<li>若存在激光滤光片，请将其移除，并确保原子力显微镜（AFM）激光已开启，以便在光学系统中可见激光光斑。
	<ol>
		<li>使用激光对准旋钮，将激光移入视野并靠近原子力显微镜（AFM）针尖。激光到达该位置后，重新安装激光滤光片。</li>
		<li>使用激光对准旋钮，将激光对准悬臂上原子力显微镜（AFM）针尖位置的背面。此时，激光对准面板应显示大于0.0 V的和信号。若未获得和信号，需通过手动控制的镜片调节旋钮调整镜片，直至屏幕上显示大于0.0 V的和信号。</li>
		<li>在原子力显微镜悬臂上，将激光在各个方向上微调，直至获得最大总信号，同时确保光斑位于原子力显微镜针尖处。激光位置确定后，通过手动控制的偏转调节旋钮将垂直和横向偏转归零。</li>
		<li>在AFM软件的激光对准面板上观察，并通过调节AFM探头上的垂直和横向偏转旋钮，调整探测器位置，使目标居中（红点位于十字线中心），且无垂直或横向偏转。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在AFM软件中打开校准窗口，输入所有与实验相关的具体信息。校准前，关闭共聚焦显微镜光源，并在适用情况下关闭AFM的封闭装置，以减少来自环境光或房间振动的潜在噪声。随后按下校准按钮，系统将自动进行探针校准。校准完成后，校准面板将显示悬臂梁的刚度（N/m）及其灵敏度（nm/V）。请记录这些参数以供后续分析使用。</li>
	<li>将原子力显微镜悬臂至少缩回2000 &#181;使用步进电机将物镜移动到位。取下原子力显微镜（AFM）探头，移除校准皿。旋转至所需物镜或插入所需物镜。如果系统已编程为在不同物镜之间保持相同的焦平面，则将物镜回缩其工作距离的10%。若使用油镜，则在物镜前端滴加一滴浸油。 
	注意：物镜的缩回可降低在放置过程中物镜接触样品皿的可能性。</li>
	<li>使用棉签在样品台内的样品环边缘涂抹少量真空脂，或使用样品夹，以确保样品皿固定牢固。小心将样品皿装入样品台中。</li>
	<li>样品放置好后，旋转数次，以确保通过油脂使培养皿与样品台之间形成良好密封。将物镜抬升至培养皿底部，直至镜油刚好浸润物镜前端。</li>
	<li>使用显微镜（不带原子力显微镜探头）对载物台上的样品进行成像系统调焦，使样品清晰对焦。记录此z轴高度作为参考。</li>
	<li>小心地将原子力显微镜探头放回平台。</li>
	<li>使用 z 轴步进电机将探针尖端向样品方向降低。在降低原子力显微镜（AFM）探针尖端的过程中，根据需要调整明场图像中的查找表（LUTs）。将探针降低至接近尖锐位置。通过手动操作的 AFM 探针位置微米调节装置，移动 AFM 探头，使 AFM 探针尖端位于视野中心或偏左中心位置。 
	注意：由于在步骤 3.6 中已记录原子力显微镜（AFM）的 z 高度，因此可采用较大步长降低 AFM 探针，但由于培养皿底部已添加润滑脂，物镜上可能也已添加油，因此该数值仅作参考。建议以 50 – 100 &#181;m 步骤，并在探针尖端对焦时进一步调小</li>
	<li>使用AFM探头上的手动微调旋钮重新调整激光位置。如有需要，通过调节相应的旋钮将垂直和横向偏转归零，并在样品皿中重新校准AFM悬臂。 
	注意：如果悬臂梁在与样品不同的介质中进行了校准，则必须在扫描介质中重新校准，以补偿折射率可能发生变化的影响。此外，由于噪声或温度变化，激光可能会偏离悬臂梁背面。若需调整，仅在使用非接触式校准时，于样品皿中玻璃基底上方重新调节激光并重新校准；若采用接触式校准，则应在校准皿内使用样品介质进行重新校准。</li>
	<li>为获得高质量的共聚焦显微镜图像，需将当前的衰减光滤光片更换为可阻断所有原子力显微镜（AFM）激光光的滤光片。该滤光片可确保原子力显微镜激光的强光不产生干扰。</li>
	<li>使用自动进针命令按钮（通常用向下的箭头表示），将探针降至样品皿底部。在成像控制面板上设置扫描尺寸/面积、分辨率、设定点、z轴长度和像素时间（或使用已校准/传播的参数值），然后开始扫描。</li>
	<li>扫描完成后，将原子力显微镜芯片抬升50 – 100 &#181;在移动至样品皿中的新测量位置之前，先将探针抬升 m。找到新位置后，接近玻璃表面，并按照步骤 3.21 和 3.22 重新开始扫描。</li>
	<li>选择 自动保存 选项，或通过点击每次单独扫描生成的文件手动保存每个文件 保存.</li>
</ol>
4. 共聚焦显微操作步骤
<ol>
	<li>打开共聚焦显微镜操作软件。确保所有相关外设、光源和控制器均已开启并正常运行。</li>
	<li>旋转或插入低倍物镜（10x 或 20x）以观察样品。确保物镜与样品皿放置位置之间保持安全的工作距离，必要时后移物镜，以避免物镜与样品发生碰撞。使用棉签，在样品皿环边缘涂抹一圈真空脂。若使用油镜，则在物镜前透镜表面滴加一滴浸油。</li>
	<li>将所需样品置于样品台中。旋转样品数次，以确保真空脂已在样品台插件上形成紧密粘合，或使用样品夹固定样品。若使用油镜，将物镜抬升至培养皿底部，使油刚好浸润玻底。为避免过度漂白，请尽量减少环境光照。</li>
	<li>使用明场或落射荧光模式，通过相机或目镜观察样品，并利用调焦旋钮对包含多个细胞或单个细胞的兴趣区域进行聚焦。通常情况下，光学显微镜下的视野范围会大于原子力显微镜（AFM）系统的x-y扫描窗口（100 × 100） &#956;m) 使用AFM软件中的电机控制面板调整AFM在共聚焦视野范围内的位置，使AFM扫描区域与共聚焦光学成像区域对应相同的特征结构。 
	注意：在视野范围内通常只有少数几个细胞，因此更容易确定需要探测的细胞。进行原子力显微镜（AFM）检测时，细胞会在AFM软件中显现，用户可据此精确定位待探测的特定区域。</li>
	<li>根据样本的标记情况，如有需要，可使用相机或共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）模式，通过显微镜软件中的调焦旋钮和图像采集按钮，采集明场或落射荧光图像。</li>
	<li>使用显微镜软件，选择相应选项或打开面板以启用共聚焦功能（例如，激光及其后续参数）。该选项通常以激光线波长值表示。</li>
	<li>选择适合样本染色所用染料的激光线。开启一个或多个激光线以激发并成像样本中的相应结构。</li>
	<li>将增益设置为一个既能优化样品荧光信号又能限制噪声水平的值。通常起始值为70。</li>
	<li>调节激光功率，以避免像素饱和并最大化动态范围。激光功率的典型起始范围为 1 – 3 %。</li>
	<li>将针孔尺寸设置为1艾里单位，以最大限度提高光学切片的分辨率。如果样品较暗且激光功率已较高，则可扩大针孔以增强信号，但会降低z轴分辨率。</li>
	<li>设置像素驻留时间（即，扫描速度）。首先以2 &#181;s 停留时间，如有需要，可调整以反映样品亮度。通过点击仪器的奈奎斯特（Nyquist）选项按钮，并根据所选图像的像素数量，由仪器自动计算所选物镜对应的像素大小/扫描尺寸。 
	注意：在较厚的样品中，较长的停留时间可能导致采集z堆栈时发生过度漂白。</li>
	<li>选择&#160;扫描 在仪器软件中选择相应选项并开始数据采集。 
	注意：如果仪器配备多个激光器，可分别对每个激光器进行优化，然后同时运行以获取多荧光图像。</li>
	<li>使用调焦旋钮放大或缩小，以在样品中找到最佳视野。</li>
	<li>使用系统捕获图像 捕获 单击按钮，并将样本所有必要的文件格式保存至计算机硬盘或本地外接硬盘的指定位置/文件夹。</li>
	<li>继续相应地调整增益、激光功率、针孔大小、采样速率及其他参数以优化图像。可启用像素饱和指数来检查像素是否过饱和。若存在过饱和现象，可重新调整增益和激光功率以消除饱和像素。使用LUTs作为指导进行特定调整。</li>
	<li>如有可能，使用系统显示在软件面板或按钮上的奈奎斯特采样率，以确保图像以可达到的最高分辨率进行采集。</li>
	<li>启动共聚焦系统的 z 轴层扫或图像体采集工具。采用从底部到顶部的模式，仅使用一条激光线，即能够最清晰地照亮样品中特征的那条激光线，设定待测体积的起始和终止平面。</li>
	<li>使用建议的z轴层间间距，该间距根据仪器和所用激光线所能达到的最佳轴向分辨率，按奈奎斯特采样标准计算得出。</li>
	<li>当使用多个激光线时，应采用最短波长来计算间距。采集完成后，将文件保存至相应文件夹。</li>
	<li>或者，如果 先验的 若已知样品的厚度，可通过选择最亮且最清晰的中间层面来定义体积。在此情况下，将顶部设为中间层面以上样品厚度的一半，底部设为中间层面以下样品厚度的一半。</li>
	<li>在完成该视野下的样品采集或样品发生漂白后，使用电动或手动控制的载物台寻找样品上其他感兴趣的区域，并重复图像采集步骤。</li>
</ol>
5. 清理步骤
<ol>
	<li>确保将共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和原子力显微镜（AFM）的所有数据文件保存至正确位置。</li>
	<li>使用Z轴步进电机将AFM探针芯片回撤至少2000 µm，或回撤至此前到达样品表面时所移动的距离。将AFM探头从载物台上取下，并小心放置于其存放位置。</li>
	<li>回撤显微镜物镜，使其远离样品。若使用了油镜，则应将物镜回撤至其与样品基底之间不再接触的位置。</li>
	<li>佩戴手套取下样品，并擦去样品皿底部的油脂及（如有使用的）油渍。取一个新的洁净空培养皿，加入70%乙醇溶液至半满至四分之三满。将其放入样品 holder 中，并重新安装AFM探头，使AFM芯片浸入乙醇溶液中浸泡5分钟。</li>
	<li>在AFM芯片浸泡期间，建议开始将实验数据复制到外部硬盘驱动器上。AFM芯片在乙醇溶液中浸泡至少5分钟后，取下AFM探头并放回其存放位置。</li>
	<li>佩戴手套取下AFM芯片 holder，并将其放入安装站。使用带橡胶夹头的镊子小心取下AFM芯片。将已使用的探针尖端放回其原始包装盒中的对应位置，并将其倾斜放置以标明已使用。为便于后续参考，请记录本实验中所使用的探针编号。</li>
	<li>将装有乙醇溶液的培养皿从系统中取出，处理掉液体和培养皿。佩戴手套，按照标准操作规程使用镜头清洁剂和镜头纸轻轻擦拭物镜上的油渍。通过清除所有残留油脂来清洁样品 holder。根据生物安全规程处理所有废弃物，并将工具归还至指定位置。</li>
	<li>完成计算机上的数据采集工作，并关闭计算机。关闭实验中使用的所有仪器、附件、外设及其他设备的电源。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

Conpokal 是一种先进的高效技术，可用于采集高质量图像 原位 在液体环境中对活体生物材料的机械性能进行表征。该技术能够同时获取优异的形态学与表面形貌图像以及活体样品的机械性能信息，突破了传统电子显微镜和光学显微镜的局限。单独使用共聚焦显微镜时，可提供明场、落射荧光和激光扫描共聚焦成像功能，从而获得高质量、高细节的荧光图像。原子力显微镜（AFM）可用于机械性能表征，但若缺乏辅助光学系统，则难以对样品进行准确定位。将两种系统联用后，用户可在实验过程中对同一个细胞同步采集图像与机械性能数据，相较于使用两套独立仪器具有显著优势。本文旨在介绍并指导用户充分掌握联用型共聚焦-原子力显微系统（Conpokal系统）的功能，推动其在未来生物学、工程学与健康领域的应用。本实验方案包括仪器准备、培养基配制、培养皿选择、微生物筛选、原子力显微镜操作流程、共聚焦显微镜操作流程以及实验后清洗步骤。成功开展活体溶液中Conpokal实验最关键的步骤包括样品固定、探针的合理选择以及活体染色的实施。本文的讨论部分将详细阐述培养条件建议、常见问题排查与操作规范，以及Conpokal技术未来的发展方向。培养建议涵盖样品培养、固定与染色的操作指导；原子力显微镜、共聚焦显微镜及Conpokal系统的操作提示与规范将涉及探针选择与校准、分辨率、技术局限性以及接近同步运行的操作策略。未来工作将聚焦该技术的发展前景及潜在的研究路径。
本实验方案涵盖了活细胞和固定细菌样品的培养、探针检测及成像。在液体环境中进行原子力显微镜（AFM）检测时存在一个挑战，即由于样品阻碍和流体动力阻力导致悬臂梁运动受阻。如果样品未能良好地附着于基底上，则部分样品可能在液体中漂浮，从而污染悬臂梁。在这种情况下，测量结果将受到影响，因为测量的前提是假设样品具有弹性附着性和特定的微机械特性。HEK细胞未经过固定剂处理，然而，S. mutans 和 E. faecalis 与其他原核细胞类似，需要额外的固定措施。所选细菌表现出活跃的运动性，这会妨碍细胞的探针检测和成像，因此采用温和的化学固定方法以促进样品的固定。除化学固定外，也可采用其他方法，例如使用滤膜通过物理方式将单个细胞截留在孔隙中75。
探针的选择也是原子力显微镜（AFM）搭建与操作中的关键环节。当需要基于生物材料的形变来测定其力学性能时，必须考虑悬臂梁刚度与材料刚度之间的匹配性，这是一项具有挑战性的任务。主要目标是使所选悬臂梁的刚度与材料的刚度尽可能匹配。如果悬臂梁远比样品柔软，则会产生过大的偏转；如果悬臂梁比样品更硬，则AFM检测器可能无法捕捉到如此微小的偏转。因此，在选择合适的AFM悬臂梁时，应根据具体的实验应用进行选择。若要在间歇接触模式下获取高分辨率图像，用于活细胞成像的AFM探针其刚度范围宜在0.1 – 0.3 N/m之间，针尖半径应在5 nm – 100 nm范围内，此时推荐使用小型锥形针尖。尖锐的针尖可提供较小的接触面积，并能更深入地压入样品，有助于获取样品形貌中的细微结构和特征76。然而，尖锐针尖也可能带来问题，当实验参数（例如，设定点、像素时间、接近速度）导致过大的压痕或压入速度过快时，容易刺穿样品。为了避免高应变率效应、尖锐针尖附近的局部应变硬化，或为了更好地控制接触面积和接近速度，许多研究者选择使用胶体探针进行力谱测量，以获得弹性模量。
建议使用弹性系数在 0.01 - 1.0 N/m 范围内、探针尖端半径为 1 – 5 µm 的原子力显微镜（AFM）探针来测量活细胞的弹性模量。较大的探针尺寸（通常为玻璃胶体）可提供已知的接触面积，且在接触过程中不易刺穿细胞。优先选择矩形悬臂梁而非三角形，因为在校准过程中，矩形几何结构可采用无接触法进行校准，而三角形几何结构则需依赖接触式校准。此外，由于 AFM 探针结构精细，建议操作人员使用带橡胶尖头的镊子，以降低损坏精密 AFM 芯片或安装块的风险。其他需要注意的参数包括 AFM 探针的接近速度以及对样品的压痕深度。一个合理的指导原则是将压痕深度控制在样品厚度（或高度）的约 10%，并选择一个可避免悬臂梁受到潜在流体动力阻力的速度38。
复杂的实验仪器通常会遇到一些障碍，需要在仪器安装、校准和操作过程中进行故障排查。对于新用户而言，常见的错误是将原子力显微镜（AFM）的探针或悬臂撞击到样品或样品基底上。为避免此问题，本方案建议将悬臂退出2000 µm。此步骤可确保在前一位使用者实验结束后未将探针退出的情况下，探针不会接触到培养皿底部。然而，2000 µm的距离是针对本方案所用特定培养皿支架选定的。根据所使用的培养皿支架类型不同，可能需要选择更大或更小的退出距离。在激光与探测器对准过程中，方案中提到需调节镜面旋钮以最大化总和信号。但并非所有原子力显微镜都配备镜面调节旋钮。如果仪器具备该旋钮，则调节它便是解决总和信号偏低问题的一种方法，该旋钮用于补偿扫描所处的介质环境，即液体（例如，水、培养基、PBS）或空气。由于光在空气和液体中折射率不同，可能需要调节镜面旋钮。原子力显微镜悬臂的最大弯曲灵敏度位于探针位置，因此，通过照射在光电二极管上的位置来反映悬臂弯曲状态的激光光斑，必须准确地位于AFM探针所在位置。根据所选AFM探针的不同，总和信号值可能在0.3 – 3.0 V之间变化。在AFM悬臂背面镀上Cr-Au或Al等金属涂层，可提高总和信号强度及测量灵敏度。
在原子力显微镜（AFM）操作过程中进行针尖校准时，针尖几何形状是关键因素。非接触式校准与接触式校准之间已观察到良好的一致性。如果所选的AFM悬臂梁不是矩形，则必须执行接触式校准。请注意，针尖校准所处的介质必须与样品所处的介质相同。如果这两种液体不同，用户必须重新校准。当在液体中使用AFM针尖时，系统测得的共振频率应为制造商标注的固有共振频率的四分之一至三分之一。检验系统是否正确完成针尖校准的一个有效方法是查看生成的热噪声文件中的数值，并确保该文件已保存至正确的文件夹。如果系统在校准过程中出现困难或输出明显不合理的数值，应重新校准，或轻微调整激光位置后再重新校准。
另一个导致总和信号不佳的原因可能是原子力显微镜（AFM）悬臂梁的对准问题。当AFM芯片被安装到玻璃块中时，必须确保悬臂梁的尖端保持在较小的激光窗口（光滑玻璃区域）内。如果芯片安装得过于靠前，悬臂梁自然静止时的角度可能导致激光从悬臂梁反射时偏离光电探测器，从而造成总和信号不佳。如果芯片安装得过于靠后，激光将无法从悬臂梁背面反射，同样导致总和信号差。因此，可能需要调整已安装的AFM芯片位置。此外，还可能遇到样品高度相关的问题。本实验方案所用的AFM仪器具有最大15 µm的压电陶瓷Z轴范围（高度）。如果用户发现软件无法在某个像素点采集高度数据和力图，则会出现一个黑框，表示系统超出范围（图2C）。解决此问题的一种方法是将压电陶瓷高度设置为较低值，例如2或3 µm，以便将大部分15 µm的范围用于映射预期的细胞高度。在大多数与细胞或细菌相关的实验中，该技术应能解决Z轴范围相关的问题。
对于高度超过 10 – 15 µm 的高大样品，若实验人员需要更大的 z 轴扫描范围，则可能需要为原子力显微镜（AFM）配备额外模块。大多数 AFM 制造商均可为多数系统提供此项选配，但需额外费用。通过扩展 z 轴范围，实验人员能够顺利扫描在微米尺度上被视为高大的样品，基本避免超出量程或需改装 AFM 压电马达的问题。尽管这些模块需额外成本，但部分型号（取决于制造商）可将 z 方向的行程增加至高达 100 µm。若用户配备长工作距离、高倍物镜，或愿意使用干镜（如 20x 或 40x），即使样品较高，仍可实现共聚焦成像。降低显微镜物镜的放大倍数可增加工作距离，从而获得足够的空间以观察较高样品的顶端。但使用较低放大倍数的物镜会牺牲分辨率。在本文所述的 Conpokal 装置中，所用的 60x TIRF（全内反射荧光）物镜在玻璃底培养皿盖玻片之外的工作距离接近 100 µm。
关于本文所述共聚焦显微镜，需说明若干重要条件。本研究中用于生成图像的共聚焦系统配备60倍TIRF油镜，数值孔径为1.49。激光&#160;使用405 nm、488 nm和561 nm激发波长的激光线对活细胞样品进行成像，结果如图所示 图3 和 图4共聚焦显微镜的衍射极限可通过使用阿贝分辨率公式来确定， 阿贝分辨率（x, y） = λ/2NA，其中 λ 为 Alexa 488 的激发波长，即 488 nm，且 NA 是共聚焦聚光镜的数值孔径，其值为0.3。因此，轴向分辨率为272 nm。对于落射荧光成像，考虑两种情况以确定分辨率，即针孔设置为1个艾里单位（AU）和0.5 AU。在后一种情况下，针孔进一步关闭，导致显著的光损失，但分辨率提高。共聚焦软件计算得出，当针孔为0.5 AU时，横向原生分辨率和轴向原生分辨率分别为170 nm和290 nm；当针孔为1 AU时，分别为200 nm和370 nm。系统中引入的球面像差可通过去卷积过程进行校正，以提高显微镜图像的对比度和分辨率。由于共聚焦显微镜固有的衍射限制，细菌菌落的共聚焦图像在 图6 缺乏与AFM扫描细菌所见细节相匹配的分辨率 图5原子力显微镜（AFM）能够获取纳米尺度的形貌特征和细节，这些信息难以通过共聚焦显微镜捕获。然而，具体选择取决于所需的荧光分辨率。 图5 和 图6 证明Conpokal技术除了真核细胞外，还可适用于微生物。
使用共聚焦显微镜的一个优势在于，操作者能够以更高的细节清晰度采集样品中特定区域的三维图像。这些图像可通过原子力显微镜（AFM）成像所探测的表面，与同一区域的共聚焦扫描进行关联。由于该显微镜为倒置式，落射荧光图像所采集的光信号来自样品被探测面的相反一侧。共聚焦系统中的针孔有助于限定来自某一特定距离的单一焦平面，同时滤除来自样品其他部分甚至环境光线的干扰。本质上，针孔有助于分离出样品中目标焦平面返回的光信号。通常，该目标焦平面必须含有较强的荧光标记物，因为在倒置共聚焦系统中，单分子检测仅限于更高分辨率的共聚焦显微镜。落射荧光照明方式较不理想，因为在落射荧光成像模式下，所有从样品反射进入物镜的光均被采集并用于生成图像，因此无法实现单一焦平面的分离。由于针孔的存在，共聚焦技术能够针对所研究的样品特征提供更为独立的单平面图像77。例如，若使用AFM探测真核细胞的顶端，则可利用显微镜的激光扫描共聚焦功能而非落射荧光成像模式，对同一表面进行分离成像。建议在数据采集过程中，同时结合微分干涉差（DIC）成像模式，并借助透射光探测器和488 nm激光线，实时监测细胞的健康状态和形态变化。在采集样品的z轴层扫图像时，针对上述详细步骤，仅需调整探测器的增益。测量过程中若出现细胞形态的改变（这种变化在荧光通道中未必可见），则表明测量中引入了人为假象。
通过遵循成像技术中所用最短波长的软件建议，可以获得理想的层间间距。利用采集软件图像处理模块中提供的去卷积算法，可有效提高图像体积的原生分辨率和信噪比。然而，在进行荧光显微镜操作时，选择特定的染料和染色剂至关重要，以避免过早发生漂白或因激发/发射光谱重叠而产生的串扰。有时，用户可能会遇到共聚焦光源生成故障。如果用户发现无光发射或激光线工作异常，一种可行的故障排除方法是重置系统，通常通过重新启动操作软件来实现。如果问题仍然存在，则透射光探测器可能未能正确进入或退出光学显微镜的光路位置。重置透射光探测器的位置可能有助于缓解光信号收集或激光成像问题。
Conpokal 仪器的核心功能是使用户能够在液体环境中，对活体生物材料的同一细胞或特征，同步采集基于光学和力学的信息。本文明确描述了如何在液体环境中进行此类实验——液体是许多生物材料的天然生存环境，尽管使用该仪器仍可进行干燥条件下的实验。当样品制备于培养皿中时，培养皿的高度会成为限制因素。由于固定原子力显微镜（AFM）悬臂的玻璃块结构限制，培养皿侧壁高度必须低于 10 mm；若培养皿过高，仪器将无法将 AFM 探针下降至样品或基底表面。
尽管样品尺寸存在限制，但在仪器或软件功能方面，时间延迟并无限制。在具备适当条件的情况下，共聚焦显微镜与原子力显微镜（AFM）可实现同步操作。其接近同步能力所面临的主要限制，源于在同时执行某些共聚焦显微功能和原子力显微功能时所产生的噪声。在采集z轴层扫图像时，移动显微镜物镜的电机所产生的振动，会叠加到AFM探针尖端运动过程中的信号上。使用油镜时，这种噪声会被进一步放大，因为电机在z轴方向上下移动，以逐层照亮样品中的不同焦平面。因此，推荐的实验方案为依次采集AFM扫描图像和共聚焦z轴层扫图像。若要实现共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）与AFM的同步成像，则共聚焦部分需采用静态成像模式；然而，以当前技术，两种仪器之间的切换延迟最短可缩短至数十秒。在图2A和图4B所展示的图像采集过程中，从AFM操作切换至共聚焦成像的实际耗时约为2–4分钟。该数值是通过从总时长33分钟中减去两次图像采集的时间段得出的，其中33分钟包括启动并完成AFM扫描、切换仪器模式以启动共聚焦成像，以及开始并完成共聚焦z轴层扫图像采集的全部时间。
Conpokal 的未来目标是探索新的结构-功能关系，并深入理解单细胞过程。例如，对细胞或细菌样本进行原位（in situ）药物处理实验，以确定细胞弹性变化的影响，这将推动生物材料、生物学和生物力学领域的发展。在成像和探针检测的同时向样本培养皿中施加治疗干预，将有助于了解样本在活体、精确控制的环境中随时间对治疗药物的响应。引入新的药物或环境挑战，将有助于进一步理解细胞骨架或细胞器定位如何影响细胞运动、拓扑结构、刚度等特性。Conpokal 的另一项潜在进展是实现对系统环境的全面控制。本方案中提到的当前 Conpokal 系统被安置在一个声学屏蔽 enclosure 内，旨在降低实验室内部噪声。对该 enclosure 的进一步改进将有望实现在无菌环境、温度可控，甚至可变重力等一种或多种因素组合条件下的测试。目前，Conpokal 方法已为表征液相中活体生物材料提供了一种有效且实用的手段，而该技术的未来发展将进一步拓展这些能力。

微米或纳米尺度的力学评估工具常用于揭示单个细胞或微生物水平上的变形特性，而独立的高分辨率显微技术则用于观察亚细胞过程和结构特征。共聚焦-原子力联用技术（Conpokal）是将激光扫描共聚焦显微镜与原子力显微镜（AFM）整合于同一仪器平台的技术。该技术最初应用于非生物聚合物体系，旨在测定硬表面与软表面接触时的黏附性、弹性及表面张力。共聚焦图像直观展示了聚合物在与硬探针接触时的形变、黏附及脱离行为1,2。从聚合物材料到生物样品，该技术为活细胞或微生物的共聚焦成像与原子力显微的近同步观测提供了可能。
细胞弹性的改变与多种人类疾病的发病机制相关3，包括血管疾病4、疟疾5,6、镰状细胞贫血7、关节炎8、哮喘9以及癌症6,10,11,12,13,14,15。测量细胞力学特性的常用技术包括磁珠法16,17、光镊技术18,19、微吸管抽吸法8,20,21,22以及原子力显微镜（AFM）11,23,24,25,26。自从将AFM应用于活细胞以来，该技术已被广泛用于以纳米级精度表征细胞表面形貌27,28以及力学性质11,24,29,30,31。AFM还进一步被改进用于微流变学32,33、频率调制34,35和蠕变实验25,36,37，以研究不同细胞系的黏弹性特性。在利用AFM获得的力-压痕测量数据中，提取定量弹性值的关键在于选择合适的纳米接触模型1,2。已有AFM研究表明，细胞骨架药物对细胞弹性具有显著影响，导致弹性模量发生明显变化38。基于弹性模量的测量结果，许多研究人员发现癌细胞比其非转化对应细胞更柔软11,38,39。增强的可变形性可能在癌细胞转移和组织浸润能力中发挥重要作用40。这种行为受到细胞骨架结构改变的调控38,41,42。除癌症外，另一类与力学相关的疾病是呼吸系统疾病。例如，急性呼吸窘迫综合征每年影响越来越多的人群。研究表明，当患者接受高浓度氧气的机械通气治疗时，其病情可能加重43。在一系列利用AFM观察肺泡上皮巨噬细胞的研究中，科学家发现富氧环境会促进肌动蛋白形成，从而增加细胞刚度；这充分体现了AFM在深入理解大气环境对呼吸功能在细胞水平上的影响，以及最终对人体修复与健康影响方面的重要作用44,45,46。上皮细胞在向伤口迁移过程中的刚度也可通过AFM进行评估，并且弹性模量的变化可用于提示后续细胞铺展行为47,48。因此，定量测量细胞力学特性具有实际需求，有助于理解病变细胞与健康细胞之间的差异及其相互作用。
原子力显微镜（AFM）还可用于研究黏附性能和表面结构。原子力显微镜具有多种工作模式，可通过接触力学获取样品信息。对于活体生物样品，主要目标之一是获得定量的力学性能参数（例如，弹性模量、黏附力），以及绘制表面高度图。这些模式包括轻敲模式（也称为间歇接触模式），该模式通过使悬臂间歇性地接触样品表面并保持恒定的振幅；以及接触模式，该模式通过调节悬臂的升降以维持恒定的弯曲程度49。黏附力图可通过AFM系统上的力映射方式采集。悬臂将样品压入至特定作用力后随即撤回，探测器测量撤回过程中抵抗撤回的力，从而生成力-位移曲线。黏附力即为撤回过程中测得的最大力值。表面形貌可提供样品在微米或纳米尺度上的详细视图。悬臂根据每个像素点处悬臂运动所捕获的压痕与弯曲信息，在样品表面进行光栅扫描，从而揭示微米和纳米级别的结构特征。利用AFM，可测量诸如肽聚糖结构50、聚合物链排列51、鞭毛52、片状伪足53和丝状伪足54等微小结构的尺寸。尽管AFM的优势在于力-位移曲线和非光学的拓扑成像，共聚焦显微镜则可对荧光标记的样品实现高分辨率成像。
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是活细胞、固定细胞及组织成像的主要技术55,56,57自1955年以来，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）已被用于生物成像 即自创立以来58,59共聚焦显微镜的工作原理（即，尽管通过针孔拒绝离焦光的原理基本保持不变，其技术实现已变得极为多样化56,57,58,60共聚焦成像可通过多点扫描实现，例如在转盘式系统中。61，单个激光束的点扫描，如线扫描中所示62，或通过多元素探测器对点扩散函数进行成像，并随后进行像素重分配57近年来，共聚焦成像技术的实用性因激光扫描功能、高速共振扫描以及高灵敏度探测器等进展而得到进一步拓展。63,64,65所有共聚焦系统相较于宽场显微镜的优势在于能够在Z轴方向进行光学切片，并提供更精细的细节，尤其是在厚样品中。基于相机检测的宽场显微镜会同时收集来自焦平面以及照明光路中所有其他区域发射的光。通过关闭针孔，虽然会降低信号强度，但可同时提高轴向和横向分辨率。66在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）中，随着激发激光在x-y视场内扫描，图像通过逐像素收集发射信号而构建。通过沿样品z轴方向采集多个x-y平面的信息，可重建样品的三维结构。57,67共聚焦显微镜结合荧光蛋白的引入，彻底改变了我们对细胞生物学的理解68例如，它已成为神经科学领域的一项重要工具69共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）常用于观察透明化组织，以获取免疫染色后脑组织及神经元网络结构的全面图像。70这一应用为研究脑内神经元与胶质细胞之间的突触连接及通讯机制提供了新的见解71从脑细胞到囊泡，荧光染色方案通过共聚焦显微镜支持对细胞功能的观察与记录，推动治疗技术的进步72,73.
尽管共聚焦显微镜和原子力显微镜各自都是功能强大且用途广泛的工具，但将二者结合（Conpokal）可使研究人员独特地将细胞/组织的形貌特征与微机械性能同各类细胞器及其动态行为的观察相关联。联用仪器使用户能够“看到”他们正在探测的内容，这是单一技术所无法比拟的巨大优势。通过Conpokal技术，可将原子力显微镜（AFM）的力图谱叠加在共聚焦图像上，从而将细胞刚度、黏附性或形态等参数与样品内部的细胞骨架结构进行关联分析。Conpokal方法的总体目标是为研究人员提供一个简洁高效的平台，以在同一系统中同时获取成像数据和材料特性信息。在本研究中，我们演示了Conpokal的操作流程，包括合适的样品选择与制备、仪器设置、悬臂梁校准，并提供了成功排除故障的指导建议。在实验方案之后，我们展示了代表性结果，包括细菌和细胞的AFM高度图、细菌和细胞的AFM模量图，以及通过同一样品的共聚焦与AFM成像获得的多标记细胞的共聚焦图像。最后，我们讨论了Conpokal实验中的关键步骤、故障排除建议、技术局限性、研究意义以及该方法的未来发展方向。

<table><tbody><tr><td>声学屏蔽罩</td><td>JPK-Bruker</td><td>Acoustic Enclosure</td><td>用于降低噪音的腔室</td></tr><tr><td>BioTracker 488 绿色微管细胞骨架染料</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCT142</td><td>用于标记哺乳动物细胞中的微管</td></tr><tr><td>CP-qp-CONT-BSG AFM 探针</td><td>NanoAndMore</td><td>CP-qp-CONT-BSG-B</td><td>适用于生物样品模量测量的胶体AFM探针</td></tr><tr><td>Dil 染料（1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（'DiI'；DiIC18(3)））</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D282</td><td>用于标记哺乳动物细胞的质膜</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>VWR</td><td>VWRL0100-0500</td><td>细胞培养基的组分</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285601</td><td>用于模拟生物环境</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fischer Scientific</td><td>45000-736</td><td>细胞培养基的组分</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents 微生物学培养基添加剂：酵母提取物</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>细菌培养基的组分</td></tr><tr><td>FluoroDish 细胞培养皿</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>FD35-100</td><td>底部为玻璃的培养皿，侧壁高度小于10 mm，为Nanowizard 4a AFM正常工作所必需</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 核酸染料</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>62249</td><td>用于标记哺乳动物细胞的细胞核，是活细胞中良好的核标记物</td></tr><tr><td>人胚胎肾293细胞</td><td>ATCC Global Bioresource Center</td><td>CRL-1573</td><td>本实验方案中使用的哺乳动物细胞</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>VWR</td><td>47743-716</td><td>细胞培养皿的包被材料</td></tr><tr><td>型号：PFQNM-LC-A-CAL AFM 探针</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-A-CAL</td><td>适用于高度较大样品（如真核细胞）的AFM探针</td></tr><tr><td>NanoWizard 4a</td><td>JPK-Bruker</td><td>NanoWizard 4a</td><td>原子力显微镜（AFM）</td></tr><tr><td>Nikon A1 激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>A1 HD25</td><td>用于明场、落射荧光和共聚焦成像的显微镜</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td>细胞培养基的组分</td></tr><tr><td>PetriDishHeater</td><td>JPK-Bruker</td><td>PetriDishHeater</td><td>维持所需培养皿样品温度</td></tr><tr><td>qp-BioAC-Cl AFM 探针</td><td>Nanosensors</td><td>qp-BioAC-Cl-10</td><td>三种不同刚度的AFM悬臂梁</td></tr><tr><td>可更换碳纤维尖端镊子</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>5051</td><td>用于小心地将精细的AFM探针放入或取出玻璃安装块</td></tr><tr><td>Todd Hewitt 肉汤 Bacto</td><td>BD DIFCO Bacterius Ltd</td><td>Bacto-249240</td><td>细菌培养基的组分</td></tr><tr><td>万古霉素 BODIPY FL 偶联物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V34850</td><td>用于荧光标记细菌细胞壁</td></tr></tbody></table>

活细胞近同步激光扫描共聚焦与原子力显微镜联用技术（conpokal）

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

在过去的几十年中，可用于微米和纳米尺度力学表征的技术迅速发展。从扫描电镜和透射电镜的进一步完善，到原子力显微镜的发明，以及荧光成像技术的进步，用于研究微小材料的技术取得了显著进展。Conpokal 是共聚焦显微镜与原子力显微镜（AFM）结合而成的合成词，其中探针“触碰”样品表面。尽管每种技术单独使用时在定性或定量图像采集方面均极为有效，Conpokal 却能够实现荧光成像与力学表征的联合检测。该系统设计用于近同步进行共聚焦成像与原子力探针测量，便于对活体微生物样品开展实验。联用仪器所提供的额外信息，可将原子力显微镜测得的力学性质（例如，弹性模量、黏附力、表面粗糙度）与共聚焦显微镜下可观测的亚细胞结构或活动实现共定位分析。本研究提供了一套逐步操作规程，用于同步操作激光扫描共聚焦显微镜与原子力显微镜，以实现对同一细胞、同一区域的共聚焦成像与力学表征。

Conpokal 技术的示意图表示如下 图1A 实验装置的图像如图所示 图1B为了通过共聚焦显微镜将生物结构与原子力显微镜（AFM）中的相同结构进行精确定位，安装过程中两种系统的对准至关重要。应选择彼此熟悉各自空间需求的知名共聚焦显微镜和AFM制造商。此外，该技术的成功实施依赖于良好的染色程序、生物结构的固定以及AFM探针的恰当选择。活细胞的高度常常给AFM成像带来挑战。图中显示了对一个活体HEK细胞进行AFM扫描的结果。 图2A该特定HEK细胞的高度约为 10 μm，由绿色的线扫描所示（图 2B）。原子力显微镜探针应满足以下条件之一：无偏移（探针位于悬臂末端）或探针高度大于细胞高度（例如，尖端高度 ≥ 10 μm) 将生成单个细胞的高分辨率图像。文中包含了一个因原子力显微镜探针选择不当而导致扫描效果不佳的示例。 图 2C在此图像中，细胞顶端出现黑色像素，表明由于细胞高度较大，AFM压电元件已超出量程。AFM悬臂末端因探针偏移且相对于细胞高度而言探针高度不足，从而在图像中显现（呈圆形方块状）。AFM图像中的这些伪影表明应更换不同的AFM探针以对细胞进行成像。
该方法需要高效的荧光染色标记以及适用于活细胞成像的正确探针。我们进行了三色共聚焦成像，如图3A所示，分别使用了细胞核染料（发蓝色荧光）、微管染料（发绿色荧光）和脂溶性膜染料（发红色荧光）。选择这些活细胞探针是因其光谱重叠有限，并且与标准滤光片组兼容。我们还在图3B中提供了明场光学图像。
通过原子力显微镜（AFM）对针尖压痕进行分析，并结合纳米力学模型，可生成表面的模量图。图中示例采用赫兹（Hertz）模型拟合，并假设针尖形状为抛物线形（半径为8 nm），所得模量图叠加于细胞形态的三维重建图像上，如图4A所示（该图与图3中相同的两个细胞）。相应的激光共聚焦z轴层扫图像的三维投影如图4B所示。
该方法也适用于较小的生物结构，包括单个细菌，其微观和纳米级特征难以通过光学显微镜分辨。一项正在进行的研究利用Conpokal技术探索细菌细胞壁内影响抗生素耐药性的力学机制。 变异链球菌s.74 细胞壁组分的操控导致了形态和抗生素抗性的改变。Conpokal 有助于在溶液中对活体样本进行数据采集。例如，表面形貌、弹性模量、黏附强度和表面粗糙度）在同一细胞样本上，以关联机械性能与细胞壁组分的有无。 图5A,B 包括一个原子力显微镜扫描图像和测得的模量图 Streptococcus mutans 细菌。在此尺度下，原子力显微镜（AFM）获得的分辨率优于传统的共聚焦显微镜。
图6 包含一株用绿色荧光细胞结构染料染色的 Enterococcus faecalis 菌落的共聚焦图像，该染料可结合细胞壁。图5 和 图6 展示了Conpokal技术除了真核细胞外，还可应用于微生物。
<img alt="共定位原子力显微镜与共聚焦显微镜示意图，展示原子力显微镜装置及细菌分析流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：Conpokal装置示意图。 
(A) Conpokal技术示意图。(B) 仪器装置实物图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="原子力显微镜（AFM）分析、高度图、悬臂梁轮廓、纳米级测量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：活细胞的原子力显微镜观察。 
（A）两个HEK细胞的AFM图像。（B）HEK细胞的高度轮廓（A图中绿线），显示细胞高度较大，达10 μm。（C）星形胶质细胞的AFM图像质量较差，细胞顶端处压电扫描器超出量程，且悬臂末端出现反向成像的迹象。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构的荧光显微镜图像，细胞核染成蓝色，细胞质呈红色和绿色荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：活细胞的共聚焦显微镜与明场显微镜图像。 
（A）活体HEK细胞的激光扫描共聚焦显微镜图像，细胞经核染料（蓝色荧光）、微管染料（绿色荧光）和亲脂性膜染料（红色荧光）染色。（B）相应的明场光学图像。比例尺为10 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="3D细胞形貌、弹性模量图谱与荧光数据显微镜结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：活体HEK细胞的原子力显微镜（AFM）与共聚焦显微镜3D重建结果的比较。 
（A）利用赫兹（Hertz）模型拟合，并结合抛物线形探针轮廓（探针半径为8 nm）构建的模量图，叠加于AFM获取的细胞3D重建图像之上。（B）激光共聚焦z轴层扫图像对应的3D投影，其中细胞核染色（蓝色荧光）、微管染色（绿色荧光）以及脂质膜染色（红色荧光）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="原子力显微镜图像，比较细菌细胞表面的力测量结果与颜色标尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：细菌样品的原子力显微镜（AFM）分析。 
（A）原子力显微镜扫描图像与（B）Streptococcus mutans 细菌的测量模量图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="绿色染色细菌簇的荧光显微镜图像；细胞可视化，微生物分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：细菌样品的共聚焦显微镜图像。 
用绿色荧光膜染料染色的Enterococcus faecalis菌落的共聚焦图像。比例尺为5 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了Conpokal技术的实验方案，该技术将共聚焦显微镜与原子力显微镜整合于同一仪器平台。Conpokal可对活体生物样本实现同一细胞、同一区域的近同步共聚焦成像与力学表征。

活细胞近同步激光扫描共聚焦与原子力显微镜联用技术（Conpokal）

近几十年来，可用于微米和纳米尺度力学表征的技术迅速发展。从扫描探针技术的进一步发展……

Conpokal 结合了共聚焦显微镜与原子力显微镜，利用探针触碰样品表面。尽管这两种技术各自均有效，Conpokal 能够实现荧光共定位与力学表征的结合。该技术的主要优势在于近乎同步的双模显微成像。共聚焦显微镜用于研究原子力显微镜（AFM）探针检测前后细胞骨架及其他细胞过程的变化，AFM可提供特定区域的力学特性。该技术在力学生物学领域具有重要意义，例如可在生理条件下对脑细胞进行探针检测，以研究电信号和力的传递。在开始分析之前，应选择适合所需数据采集的AFM悬臂梁，并佩戴手套，使用AFM芯片安装台、镊子和小螺丝刀将芯片安装到玻璃块中。将原子力显微镜（AFM）芯片小心地放置在玻璃块的中心位置，悬臂及AFM芯片的一小部分应位于玻璃块的透明可视区域内。使用螺丝刀拧紧螺丝，直至芯片紧贴玻璃块，并使用放大镜检查芯片是否正确取向。当芯片已正确取向后，将玻璃块以正确的方向放入原子力显微镜（AFM）探头中，并固定玻璃块。通过明场显微镜定位校准皿底部后，使用AFM系统的Z轴步进电机控制面板，将AFM悬臂移动至样品上方2000微米处。在明场照明下，通过Z轴步进电机控制面板，以100至200微米为步长，逐步缓慢降低AFM芯片，直至到达玻璃皿底部，以避免AFM针尖撞击培养皿。在仪器平台上找到用于控制原子力显微镜（AFM）探头在X Y方向或平面运动的手动微调旋钮。当AFM悬臂的阴影变暗且轮廓变得更加清晰时，使用手动微调旋钮校正AFM探头，并调节AFM悬臂在视野中的位置。此时，可能需要调整查找表。在显微镜软件视野中观察是否有阴影出现，这表明原子力显微镜（AFM）探针正在接近培养皿底部。继续以微小步进方式降低AFM探针，直至探针大部分处于聚焦状态。当激光就位后，使用激光对准旋钮将激光束对准悬臂上AFM探针所在位置的背面。激光对准面板应显示大于零伏的总和信号。在原子力显微镜（AFM）悬臂上沿各个方向微调激光位置，直至在AFM针尖处获得最大总和信号。激光位置确定后，使用手动控制的偏转调节旋钮将垂直和侧向偏转归零。使用垂直和横向偏转旋钮调整探测器，使目标居中，并且在激光对准面板中观察不到垂直或横向偏转。打开校准窗口，输入所有实验的特定信息。更换激光滤光片。校准前，请关闭共聚焦显微镜的光源，并合上原子力显微镜（AFM）的屏蔽罩，以减少来自室内光线或振动的潜在噪声。按下“校准”按钮，系统将自动进行探针校准。校准完成后，悬臂的刚度及其灵敏度将显示在“校准”面板中。然后使用自动进针命令按钮将探针降至样品皿底部，并设置皮肤区域大小、分辨率、设定点、Z轴扫描长度和像素时间，然后按下播放按钮开始扫描。对于显微镜软件中的共聚焦显微成像，需启用共聚焦功能，并选择与样品染色所用染料相匹配的激光谱线。选择一个或多个激光谱线以激发并成像样品中的相应结构，并调节增益值，使其在优化样品荧光信号的同时尽可能减少噪声。调整激光功率，以避免像素饱和，同时最大化动态范围，并将针孔尺寸设为一个单位面积，以提高光学切片的分辨率。根据样本亮度，必要时调整上述参数。设置像素驻留时间时，起始值约为2微秒，然后根据样本亮度需要进行相应调整。为所选物镜设置像素尺寸时，让仪器通过点击Nyquist选项按钮并结合图像中选定的像素数量来自动计算像素尺寸。接下来，选择扫描选项并开始数据采集。使用聚焦旋钮找到能最清晰呈现样品特征的焦平面，点击扫描按钮开始采集数据，再点击捕获按钮获取一幅二维图像。使用通过Nyquist选项控制像素大小的面板，将扫描区域缩小至仅包含单个细胞。激活采集工具，采用从下到上的扫描方式，仅使用能最清晰照亮样品中目标结构的激光线，根据建议的层间间距设置待测量体积的起始和终止层面。为文件命名并保存至相应文件夹。或者，如果已知样品的厚度，可通过调节焦距选择最亮、最清晰的中间层面以确定成像体积，将顶部设为中间层面以上等于样品厚度的位置，底部设为中间层面以下等于样品厚度的位置，然后选择合适的步进大小。点击“立即运行”按钮开始采集。采集完成后，将文件保存至相应文件夹。实验结束时，戴上手套取下玻璃块，并将其放入安装台。使用带橡胶 grip 的镊子小心取下原子力显微镜（AFM）芯片，并将已使用的探针 tip 放回储存盒中指定的位置，且方向应朝外以表明该探针已被使用。为便于后续参考，请记录本次实验所使用的探针编号。此处展示了一个在活体HEK细胞上进行的代表性原子力显微镜（AFM）扫描图像。该HEK细胞的高度约为10微米，通过线扫描结果得以证实。此处还可观察到由于AFM探针选择不当而导致的一次质量较差的扫描示例。在此图像中，细胞顶端出现了黑色像素，表明由于细胞高度较大，原子力显微镜（AFM）的压力敏感区域已超出范围。此外，由于探针偏移以及探针高度相对于细胞高度不足，AFM悬臂的末端也出现在图像中。这些AFM图像中的伪影表明，应选择另一种AFM探针来对细胞成像。可以进行三色共聚焦成像。例如，用于观察细胞核、微管和脂质膜。结合纳米力学模型对针尖压痕进行分析，可生成表面的模量图谱。此处展示了激光共聚焦Z轴序列图像对应的三维投影。对于微生物，也可获取原子力显微镜（AFM）扫描图像及测量得到的模量图，如本图中变形链球菌细菌的代表性分析所示。如图所示，在此尺度下，AFM所能达到的分辨率优于传统的共聚焦显微镜。黏附力图谱是一种通过共聚焦技术实现的可视化分子相互作用的方法。例如，可用于研究细胞表面分子的调控，以观察其结合动力学。共聚焦技术为探索医学微生物学中结构与功能关系提供了新的途径。例如，物理和化学事件以及肽聚糖层可能与抗生素耐药性相关联。

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近同步激光扫描在活细胞上的共和和原子力显微镜（康波卡尔）

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