近同步激光扫描在活细胞上的共和和原子力显微镜（康波卡尔）

Conpokal 使用探针戳样品表面，将共和显微镜与原子力显微镜相结合。虽然这两种技术都单独有效，但 Conpokal 有助于荧光共定位和机械特性。康波卡尔技术的主要优点是近同时的双显微镜。

在AFM探测之前和之后，共生研究细胞骨骼和其他细胞过程，提供区域特定的机械特性。这种技术在机械生物学领域具有冲击力，例如，脑细胞可以在生理条件下进行检测，以检查电脉冲和力交易。在开始分析之前，选择适当的 AFM 悬臂进行所需的数据收集，并使用手套、AFM 芯片安装阶段、钳子和一把小螺丝刀将芯片安装到玻璃块中。

小心地将 AFM 芯片放在玻璃块的中心。悬臂加 AFM 芯片的一小部分应放在玻璃块的可见、非不透明部分。使用螺丝刀拧紧螺钉，直到芯片紧固玻璃块，并使用镜头检查芯片是否正确方向。

当芯片正确定向时，将玻璃块以正确的方向放入 AFM 头，然后将玻璃块锁定到位。通过亮场显微镜定位校准盘底部后，使用 AFM 系统 Z 步进电机控制面板将 AFM 悬臂 2000 微米移至样品上方。使用明亮的场照明和 Z 步进电机控制面板，缓慢地将 AFM 芯片降到玻璃盘底部，步数为 100 至 200 微米，以避免将 AFM 尖端撞到 Petri 盘中。

在仪器平台上找到控制 X Y 或 AFM 头的纯运动手动千分尺。当 AFM 悬臂的阴影变暗，形状变锐利时，使用手动千分尺校正 AFM 头并调整 AFM 悬臂在视野中的位置。此时，可能需要调整查找表。

注意在显微镜软件视图中出现阴影，这表明 AFM 尖端越来越接近菜盘的底部。继续使用小步骤降低 AFM 提示，直到提示主要位于焦点。当激光就位时，使用激光定位表盘将激光放在 AFM 尖端位于悬臂上的背面。

激光对齐面板应显示大于零伏特的总和信号。在 AFM 悬臂上的所有方向上移动激光器，直到达到最大和信号，同时保持 AFM 尖端。设置激光位置后，使用手动控制的偏转表盘将垂直和横向偏转归零。

使用垂直和横向偏转旋钮对准探测器，使目标居中，在激光对齐面板中未观察到垂直或横向偏转。打开校准窗口，输入所有实验特定信息。更换激光滤光片。

校准前，关闭共体显微镜光源并关闭 AFM 外壳，以抑制来自室内光线或振动的任何潜在噪音。按校准按钮可自动允许系统校准尖端。校准完成后，悬臂的刚度及其灵敏度将显示在校准面板中。

然后使用"自动方法命令"按钮将图盘底部的尖端降低，并设置皮肤区域的大小、分辨率、设定点、Z 长度和像素时间，然后按下播放按钮开始扫描。对于显微镜软件中的共声显微镜成像，启用共合能力并选择适合用于染色样品的染料的激光线。选择一条或多条激光线来激发和成像样品中的特征，并设置增益以优化样品荧光但限制噪声量的值。

调整激光功率以避免饱和像素，同时最大化动态范围，将针孔大小设置为一个区域单元，以最大限度地提高光学剖面的分辨率。如果需要，根据样品亮度调整值。要设置像素停留时间，请从大约两微秒的停留时间开始，然后根据需要进行调整以反映样本亮度。

要为所选目标选择像素大小，请让仪器通过奈奎斯特选项按钮计算像素大小和图像中所选的像素数。接下来，选择"扫描"选项并开始数据收集。使用焦点旋钮以最清晰的形式定位表示样本要素的焦点平面，使用"扫描"按钮开始数据收集，使用"捕获"按钮捕获二维图像。

使用通过奈奎斯特选项控制像素大小的面板，减小扫描的面积大小，仅包围单个单元格。激活收集工具并使用从下到上选项，仅使用最清晰地照亮样本中要素的激光线，设置使用平面之间建议的间距测量体积的开始和完成平面。命名该文件，并保存到关联的文件夹。

或者，如果我们先验了解样品厚度，通过调整焦点来定义体积并选择最亮、最锐利的中间平面，并设置顶部使样品厚度高于中间平面，底部的厚度低于中间平面，然后选择适当的步进大小。通过按"运行现在"按钮运行采集。采集完成后，将文件保存到相应的文件夹中。

实验结束时，在取下玻璃块时戴上手套，将其放入安装站。使用带橡胶夹的钳子小心地取出 AFM 芯片，将用过的尖端放回存储箱的位置，以表示已使用。供将来参考，请注意实验中使用的提示。

此处显示了一个活的 HEK 细胞的代表性 AFM 扫描。此特定 HEK 电池的高度约为 10 微米，如线扫描所证明。在这里，可以观察到由于不当的 AFM 提示选择导致的扫描不良的示例。

在此图像中，黑色像素出现在单元格的顶点，表示 AFM PA 区域由于单元格高度较大而出范围。AFM 悬臂的端端也出现在图像中，因为与单元格高度相比，尖端偏移加上尖端高度不足。AFM 图像中的这些伪影表示应选择不同的 AFM 提示来对单元格进行映像。

可执行三种彩色共声成像。例如，可视化细胞核、微管和亲唇膜。分析尖端凹痕与纳米机械模型相结合，可以生成表面模量图。

此处显示了激光共合 Z 堆栈的相应 3D 投影。AFM扫描和测量模量图也可以获得微生物，如这些代表性的分析链球菌突变细菌观察到。如所证明，与传统的共微显微镜相比，AFM 可以达到这种规模的更好分辨率。

粘合力映射是通过孔面来可视化分子相互作用的一种技术。例如，研究细胞表面分子的调制，以观察结合动力学。康波卡尔为探索医学微生物学的结构功能关系开辟了一条新途径。

例如，物理和化学事件和肽层，可以与抗生素耐药性有关。