超分辨率成像研究原发神经元中蛋白质和突触标记的共同定位
October 31st, 2020
该协议演示了如何使用超分辨率显微镜来研究蛋白质在原发神经元培养物中的共定位。
突触是神经元的功能元素，其缺陷或损失是几种神经退行性和神经性疾病的基础。成像研究被广泛用于研究其在生理和病理条件下的功能和可塑性。由于其尺寸和结构，蛋白质的定位研究需要高分辨率成像技术。
在该协议中，我们描述了一个程序，用于研究在初级神经元中使用结构化照明显微镜在超分辨率水平上与突触标记目标蛋白质的共同定位。SIM 是一种图案照明技术，可使宽场显微镜的空间分辨率翻倍，细节达到约 100 纳米。该协议指示强大的联合本地化研究所需的控制和设置，并概述正确分析成像数据的统计方法。
但是，允许超分辨率分析的关键是采集过程中使用的试剂，如与目标衍射指数兼容的室盖玻片和安装解决方案。要获得小鼠海马原发神经元，请将海马从P1分离至P4幼崽。板细胞每井7万个细胞，每井体积200微升。
等到海马原发神经元在电镀后12至14天完全成熟，进行共定位研究。将每井PBS 200微升中4%的甲状甲醛PFA加入到神经元中，以快速修复它们。去除溶液，用1%牛血清白蛋白BSA在PBS中孵育样品，每井200微升，在室温下一小时，被动地用不相关的蛋白质覆盖板的所有自由结合表面进行分析。
与0.2%Triton X-100的相同缓冲液相比，基于BSA的阻尼缓冲液比0.2%Triton X-100的缓冲液更有效地降低了抗体背景。加入原抗体。作为阴性控制，不要向其中一口油井添加任何原抗体。
使用 SIM 兼容的安装剂（例如 ProLong 玻璃抗fade安装剂）安装电池。用盖玻璃盖住和保护细胞，例如直径为八毫米的圆形盖玻璃。
也可以使用方形的。将室盖玻片存放在室温下，在获取图像前至少等待 48 小时。钻石玻璃在超分辨率收购前至少需要两天的固化时间。
使用两种策略来保证抗体特异性。第一种是使用至少两种不同的抗体，针对同一基质。第二种策略是抗体中和，通过与纯化的蛋白质靶点孵育，或用于提高抗体。
我们经常使用尼康制造的 N-SIM 超分辨率显微镜进行分析。以下说明旨在独立于使用显微镜获取 SIM 图像。还必须最大限度地提高显微镜的性能，以便对仪器进行精确校准，包括校正环、激光对焦和光栅块对焦。
在采集 SIM 图像之前，系统需要使用特定子分辨率尺寸的荧光珠进行适当的校准。一个例子是四普克微球。这些珠子染色有不同的荧光染料，允许用一个样品校准不同的激光器。
在水浴中，声波约1.8倍10到第8荧光微球10分钟。在双蒸馏水中稀释荧光微球的500分之一。再声一次，再用10分钟。
将稀释的珠子的15微升移液放入室盖玻片的井中。让溶液在室温下干燥五分钟。添加 10 微升的安装解决方案，例如
ProLong 玻璃，在上面放置一个 8 毫米的盖玻片。等待至少 48 小时，以便进行适当的固化。打开显微镜和激光。
让系统预热，以达到所有显微镜组件的热平衡，SIM超分辨率显微镜系统至少需要三个小时。选择 100 倍目标。通过将激光器与衍射光栅块的中心对齐来开始校准。
在 N-SIM 系统中，一个千分尺旋钮和专用摄像机允许光束向目标中心。插入显微镜的室盖玻片进行观察。通过调整目标校正盖，将系统设置为室体盖玻片厚度。
NIS软件是N-SIM超分辨率显微镜系统的专有软件，具有调节颜色校正的自动功能。调整每个通道的光栅块焦点，以确保样品上聚焦的结构化图案照明。该软件为此任务提供自动功能。
获取多色微球的原始 3D SIM 图像。计算每个独立波长的超解析图像的 Fourier 变换。如果转换的图像无法获得正确的花样图案，则重新启动校准，因为尚未实现超分辨率。
在超解析图像中，选择单个微球并计算每个通道的强度轮廓，以测量实现的分辨率。它现在应该接近100纳米横向。通过覆盖微球的多通道采集来执行通道注册。
目标是横向和轴向地混合所有通道信号。这将消除不同通道错位导致的色差，并帮助共同本地化分析。通过使用 SIMcheck 的功能照明相位步骤和照明模式焦点（一套用于开源应用程序 ImageJ 的插件）确认校准质量。
在共和或宽场模式下使用 40 倍目标开始分析样本。这允许导航示例，保持良好的细节和较大的视野。使用 MAP2 抗体信号检测表示神经元过程的区域。
在共合模式下获取样品的图像，以确定染色的质量。切换到目标 100X。将机油涂抹到 100 倍目标上。
获取宽场或共和图像，稍后将用于评估超解析图像的质量。切换到 3D SIM 模式。使用对话窗口设置采集参数，选择可用的最高位深度设置以最大化颜色信息。
通常，16 位是标准选择。此外，为了提高信噪比，请选择低频值进行采集，例如一兆赫。使用直方图窗口，设置激光功率，获得信号的线性响应，避免信息丢失，限制图像中的饱和像素。
N-SIM 系统使用 Andor iXon3 摄像机。当工作在 16 位时，选择 16，000 的目标强度，以确保摄像机的线性响应。或者，选择 30，000 到 45，000 之间的范围，以最大化收购的动态范围。
在成像样品时将激光功率设置为 0.1% 到 50%，曝光时间设置为 50 毫秒到 2 秒之间。超过 50% 的激光功率可能导致使用的荧光团快速光漂白。开始以 3D SIM 模式获取图像。
使用 SIMcheck，ImageJ 的一套免费插件，评估原始图像的采集质量。如果 SIMcheck 未检测到任何伪影或质量问题，请从完整的技术复制中获取至少 10 张图像，以便进行统计分析。采集的图像是需要处理的原始数据，以获取用于进一步分析的重建 SIM 图像。
在协议中，我们建议使用突触物理和PSD-95作为突触前和后突触标记。但是，可以使用其他标记。大量的文献支持使用其他蛋白质，如德布林和低音作为突触标记。
3D SIM 采集的图像是原始图像，需要处理才能获取重建的超解析图像。原始图像的重建不正确会导致伪影，影响样本的分析。因此，应高度重视正确选择重建参数。
使用显微镜重建分析软件处理原始图像，以获得超解析图像。或者，使用免费可用的 ImageJ 插件 fairSIM 来重建原始图像。使用显微镜重建软件或 ImageJ 插件 SIMcheck 计算超解析图像的 Fourier 变换。
对于每个通道，一个好的重建图像应返回一个花一样的图像。如果重建的图像无法重新创建花状形状，请从原始图像重新启动，然后通过修改重建参数（如线性滤波、apodization 和零阶抑制）进行重建。在 NIS 软件中，使用预览来监视更改参数如何影响最终解析的图像、修改参数的照明调制对比度、高分辨率噪声抑制和对焦抑制。
使用基于 ImageJ 的插件 NanoJ-SQUIRREL 分析重建的图像，以公正地检测伪影，以评估超解析图像的质量。在分析共同本地化时，我们使用了两种方法。第一种是基于配置文件分析的可视化方法，它显示联合本地化的单个事件，并确定每个通道的贡献。
作为研究突触标记和感兴趣的蛋白质之间的共同定位的第一步，采取超解析的图像，并分析单个位置以确定信号重叠。识别超解析图像上的单个位点。获取荧光信号的强度剖面到感兴趣的位点。
如果剖面分析建议单位点共定位，则可以通过计算 Pearson 和 Mander 的系数对整个图像进行更一般性的分析。使用JACoP，一个图像J插件，确定两个参数的共同本地化，皮尔逊和曼德的。在校准了系统并评估了重建图像的质量之后，我们接下来开始分析与 MAP2、神经元标记、PSD-95、后突触标记和我们的目标蛋白质 SUMO1 有抗体染染的主要神经元培养物。
我们首先分析了以40倍目标执行四通道共体显微镜的样品。在选择表示神经元过程的区域时，我们切换到了 100 倍的目标。我们获取了同一区域的共和图像和 SIM 图像，以评估 NanoJ-SQUIRREL 的重建质量，并执行共同定位分析。
阐明突触的结构和组成对于理解调节记忆和认知的生理和病理过程至关重要。虽然在正常状态下突触是记忆的构建基块，但它们也是复杂神经系统疾病的基础，例如痴呆症最常见的疾病之一。此处描述的协议允许使用称为结构化照明显微镜的超分辨率显微镜技术研究突触的蛋白质组成。
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概述
本协议展示了利用超分辨率显微镜研究原代神经元培养物中蛋白质共定位的方法。通过使用结构光照明显微镜（SIM），研究人员可以达到约100纳米的空间分辨率，以研究突触蛋白相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 成像技术
- 蛋白质定位
背景
- 突触在神经元功能中起着至关重要的作用，并与各种神经退行性疾病有关。
- 由于蛋白质尺寸较小，需要高分辨率成像技术来研究蛋白质定位。
- 超分辨率方法可以显著提高成像能力，超越传统显微镜。
- 本协议为在原代神经元中进行共定位研究提供指导。
研究目的
- 描述使用SIM研究突触位点蛋白质共定位的详细步骤。
- 通过适当的控制和设置，说明确保稳健结果的最佳实践。
- 概述分析超分辨率成像数据的统计方法。
使用的方法
- 利用结构光照明显微镜（SIM）实现神经元培养物的超分辨率成像。
- 在从小鼠海马（P1到P4幼鼠）分离的原代神经元中进行共定位研究。
- 细胞在固定和抗体标记之前培养并成熟12到14天。
- 使用荧光珠校准SIM系统以确保准确性。
- 步骤包括抗体阻断、控制的使用和特定的安装技术等关键步骤。
主要结果
- 实现了能够分辨突触位点蛋白质相互作用的高分辨率成像。
- 提供了最佳抗体特异性方法的详细信息，以确认有效标记。
- 下一步包括分析强度轮廓和执行通道注册以确保准确的共定位分析。
- 验证了超分辨率成像技术以确认成功校准。
结论
- 本研究建立了一个全面的协议，用于在超分辨率水平上检查神经元中的蛋白质定位。
- 概述的方法使研究人员能够更详细地探索突触动力学和蛋白质相互作用。
- 这种方法为神经元机制和神经生物学及疾病研究的潜在影响提供了宝贵的见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Super-resolution imaging enables precise visualization of protein interactions at synaptic sites, addressing a critical need in neurodegenerative disease research where target validation requires nanoscale spatial resolution. This capability supports mechanistic de-risking by clarifying co-localization patterns between therapeutic targets and established synaptic markers, improving predictive confidence in early discovery. The method provides a disease-relevant system for evaluating target engagement in primary neurons, directly informing portfolio triage for CNS-focused programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing target protein co-localization with pre- and post-synaptic markers at ~100 nm resolution.
- Operational Value: Provides quantitative co-localization metrics (Pearson’s and Mander’s coefficients) to objectively assess target-synaptic relationships.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation, supporting go/no-go decisions based on subcellular localization evidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, super-resolved imaging data suitable for assay development in neuronal models.
- Operational Value: Establishes reproducible sample preparation and imaging protocols using chambered coverslips and SIM-compatible mountants.
- Strategic Value: Enables scalable, multi-parameter imaging workflows for screening compound effects on synaptic protein localization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant primary hippocampal neurons to model synaptic biology in a physiologically accurate system.
- Operational Value: Supports longitudinal studies from 12–14 days post-plating, aligning with neuronal maturation timelines for consistent data.
- Strategic Value: Facilitates biomarker alignment by quantifying co-localization changes between target proteins and synaptic markers under experimental conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing super-resolution imaging data that informs target validation prior to lead identification, with outputs directly applicable to mechanistic de-risking and target confidence assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving nanoscale protein organization at synapses.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative imaging outputs with built-in controls for antibody specificity and instrument calibration.
- Analytics: Enables statistical analysis of co-localization via intensity profile analysis and correlation coefficients, facilitating condition comparisons.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through use of primary neurons and synaptic markers relevant to neurodegenerative disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across multiple targets and projects within neuroscience portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through direct visualization of target-synaptic co-localization, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Standardization via calibrated SIM systems, validated reagents (e.g., ProLong Glass mountant), and defined antibody specificity controls.
- Strategic Value: Improved capital efficiency by de-risking targets early, minimizing investment in poorly localized candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on subcellular evidence of target engagement at synapses.
Implementation Considerations
- Expertise in super-resolution microscopy, neuronal culture, and immunofluorescence labeling is required.
- Instrumentation includes an N-SIM or equivalent system with laser calibration tools and high NA objectives.
- Standardization across teams depends on shared protocols for chambered coverslip preparation, mounting, and SIMcheck-based quality control.
- Adaptation to other neuronal models requires validation of maturation timelines and marker compatibility.
- Practical limitations include the 48-hour mounting cure time and need for sub-resolution bead calibration before each imaging session.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:04
Primary Cultures
1:48
Immunofluorescence Staining
3:32
SIM Microscopy
4:01
Microscope Calibration
7:11
Acquisition
9:24
Post-production: Image Reconstruction
11:24
Colocalization with Profile Analysis
12:05
Quantification of Pearson's and Mander's
12:27
Results
13:16
Conclusions
