超高分辨率成像研究原代神经元中蛋白质与突触标志物的共定位

突触是神经元的功能单元，其功能缺陷或丢失是多种神经退行性疾病和神经系统疾病的基础。成像研究被广泛用于在生理和病理条件下探究突触的功能和可塑性。由于突触的尺寸和结构特点，对蛋白质进行定位研究需要高分辨率的成像技术。

本方案中，我们描述了一种利用结构光照明显微镜在超分辨率水平上研究原代神经元中目标蛋白与突触标志物共定位的方法。SIM（结构光照明显微镜）是一种采用模式化光照的技术，可使宽场显微镜的空间分辨率提高一倍，达到约100纳米的精细程度。本方案指出了进行可靠共定位研究所需的各种对照和设置，并概述了正确分析成像数据的统计学方法。

然而，实现超分辨率水平分析的关键在于采集过程中所使用的试剂，例如与物镜折射率相匹配的带孔盖玻片和封片溶液。为获得小鼠海马原代神经元，需从出生后第1至第4天的幼鼠中分离海马组织。将细胞以每孔70,000个细胞的密度接种，每孔体积为200微升。

待海马体原代神经元培养后12至14天完全成熟，再进行共定位研究。向神经元中加入4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液，每孔200微升，以快速固定细胞。移除溶液后，将样品与含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液孵育，每孔200微升，室温下孵育1小时，以非特异性蛋白被动封闭板孔中所有游离结合位点，用于后续分析。

不含 Triton X-100 的 BSA 封闭缓冲液比含有 0.2% Triton X-100 的相同缓冲液更能有效降低抗体背景信号。加入一抗。作为阴性对照，在其中一个孔中不加入任何一抗。

使用与SIM兼容的封片剂封片，例如ProLong Glass抗荧光淬灭封片剂。用盖玻片覆盖并保护细胞，例如直径为八毫米的圆形盖玻片。

也可以使用方形的腔室盖玻片。将带腔室的盖玻片在室温下保存，并在成像前至少等待48小时。金刚石玻璃在进行超分辨率成像前，需要至少两天的固化时间。

采用两种策略以确保抗体特异性。第一种策略是使用至少两种针对同一底物的不同抗体。第二种策略是通过将抗体与纯化的靶蛋白或用于制备该抗体的抗原蛋白共同孵育，进行抗体中和实验。

我们常规使用尼康公司生产的N-SIM超分辨率显微镜进行分析。以下说明适用于各种显微镜的SIM图像采集。为了充分发挥显微镜的性能，必须对仪器进行精确校准，包括校正环调节、激光准直以及光栅块聚焦，以确保成像质量。

在采集SIM图像之前，系统需要使用特定的亚分辨率尺寸荧光微珠进行适当校准。例如TetraSpeck微球。这些微珠经不同荧光染料标记，可利用同一样本实现对不同激光器的校准。

在水浴中超声处理约1.8 × 10⁸个荧光微球，持续10分钟。用双蒸水将荧光微球按1:500比例稀释。再次超声处理，持续额外10分钟。

用移液器将15微升稀释后的珠子加入到带孔盖玻片的一个孔中。在室温下让溶液干燥5分钟。加入10微升封片液，例如

滴加 ProLong Glass，然后在其上放置一个 8 毫米的盖玻片。至少等待 48 小时，以确保充分固化。打开显微镜和激光器。

让系统预热，使显微镜所有组件达到热平衡，SIM 超分辨率显微镜系统至少需要三小时。选择 100X 物镜。通过将激光器与衍射光栅块中心对齐，开始进行校准。

在 N-SIM 系统中，通过微米调节旋钮和专用相机可将光束对准目标中心。插入带腔室的盖玻片以供观察。通过调节物镜校正环，将系统设置为与带腔室盖玻片的厚度匹配。

NIS 软件是随 N-SIM 超分辨率显微镜系统提供的专有软件，具有自动调节颜色校正的功能。为每个通道调节光栅块的焦距，以确保样品上的结构化图案照明处于聚焦状态。该软件为此任务提供了一个自动功能。

获取多色微球的原始3D-SIM图像。对超分辨率图像的每个独立波长计算其傅里叶变换。如果变换后的图像未能获得正确的花状图案，则需重新开始校准，因为尚未实现超分辨率成像。

在超分辨图像中，选择单个微球，并计算每个通道的强度分布以测量达到的分辨率。横向分辨率应接近100纳米。通过叠加微球的多通道采集图像进行通道配准。

目标是使所有通道信号在侧向和轴向上准直。这将消除因不同通道未对准而引起的色差，并有助于共定位分析。使用 SIMcheck（一款用于开源软件 ImageJ 的插件套件）中的照明相位步进和照明图案聚焦功能来确认校准质量。

使用共聚焦或宽场模式下的 40X 物镜开始分析样品。此设置可在保持良好细节的同时提供较大的视野，便于样品的导航。利用 MAP2 抗体信号来识别代表神经元突起的区域。

以共聚焦模式采集样品的图像，以评估染色质量。切换至100倍物镜，并在100倍物镜上滴加镜油。

获取一幅宽场或共聚焦图像，用于后续评估超分辨图像的质量。切换至3D SIM模式。通过对话窗口设置采集参数，选择可用的最高位深设置，以最大化颜色信息。

通常，16 位是标准选择。此外，为了提高信噪比，应选择较低的采样频率，例如 1 兆赫兹。利用直方图窗口，调节激光功率以获得信号的线性响应，避免信息丢失，并限制图像中饱和像素的数量。

N-SIM 系统使用 Andor iXon3 相机。在使用 16 位模式时，应选择 16,000 的目标强度，以确保相机的线性响应。或者，也可选择 30,000 至 45,000 的范围，以最大化采集的动态范围。

成像时将激光功率设置在0.1%至50%之间，曝光时间设置在50毫秒至2秒之间。激光功率超过50%可能导致所用荧光染料迅速发生光漂白。开始以3D SIM模式采集图像。

使用 SIMcheck（ImageJ 的一套免费插件）来评估原始图像采集的质量。如果 SIMcheck 未检测到任何伪影或质量问题，则需从完整的技术重复样本中至少采集 10 张图像，以供统计分析。所采集的图像是原始数据，需要经过处理才能获得重建的 SIM 图像，用于后续分析。

在本方案中，我们建议使用突触素（synaptophysin）和PSD-95作为突触前和突触后标记物。然而，也可使用其他标记物。大量文献支持使用其他蛋白，如drebrin和bassoon作为突触标记物。

3D SIM 获取的图像是原始图像，需要经过处理才能获得重建的超分辨率图像。原始图像重建不当可能导致伪影，从而影响对样品的分析。因此，应特别注意正确选择重建参数。

使用显微镜重建分析软件处理原始图像，以获得超分辨率图像。或者，使用免费的 ImageJ 插件 fairSIM 重建原始图像。使用显微镜重建软件或 ImageJ 插件 SIMcheck 计算超分辨率图像的傅里叶变换。

高质量的重建图像应使每个通道均呈现出类似花朵的图像。若重建图像未能再现花朵状形态，则需从原始图像重新开始，并通过调整重建参数（如线性滤波、切趾和零阶抑制）来重新进行重建。在 NIS 软件中，可通过预览功能监控参数变化对最终解析图像的影响，并相应调整参数，包括照明调制对比度、高分辨率噪声抑制以及离焦抑制。

使用基于 ImageJ 的插件 NanoJ-SQUIRREL 分析重建图像，以无偏检测伪影，评估超分辨率图像的质量。在我们的共定位分析中，采用了两种方法。第一种是基于轮廓分析的可视化方法，可显示单个共定位事件，并识别每个通道的贡献。

研究突触标记物与目的蛋白之间共定位的第一步是获取超分辨率图像，并分析单一位置以确定信号重叠情况。在超分辨率图像上识别一个单一的位置，获取该目标位置荧光信号的强度分布图。

如果轮廓分析已提示存在单一位点共定位，则可通过计算 Pearson 系数和 Mander 系数，对整幅图像进行更全面的分析。使用 ImageJ 插件 JACoP 来确定共定位的两个参数：Pearson 系数和 Mander 系数。在完成系统校准并评估重建图像的质量后，我们接下来开始分析用针对 MAP2（一种神经元标记物）、PSD-95（一种突触后标记物）以及目标蛋白 SUMO1 的抗体染色的原代神经元培养物。

我们首先使用40倍物镜进行四通道共聚焦显微镜检测来分析样品。在选定代表神经元突起的区域后，切换至100倍物镜。对同一区域采集共聚焦和SIM图像，以评估NanoJ-SQUIRREL重建结果的质量，并进行共定位分析。

阐明突触的结构与组成对于理解调控记忆和认知的生理及病理过程至关重要。在正常状态下，突触是记忆的基本构成单元，但同时也是多种复杂神经系统疾病的基础，例如最常见的痴呆类型之一——阿尔茨海默病。本文所述的实验方案可利用一种称为结构照明显微镜的超分辨率显微成像技术，研究突触的蛋白质组成。