按流细胞测量评估主要穆林河马神经元的主要组织相容性综合类 I 的表达
May 19th, 2020
该协议描述了一种从胚胎小鼠大脑中培养原发性海马神经元的方法。然后通过流动细胞学分析对培养神经元细胞外表面的主要组织相容性复杂I类的表达进行评估。
该方案使用流式细胞术定量评估小鼠培养的原代神经元上的细胞外 MHC 1 类表达。还可以进行 MHC1 表达的 NC2 免疫染色，以避免由于蛋白质、三级、结构变化、透化或变性条件而导致的信号丢失。除了指导对感染的免疫反应外，MHC 1 类还调节神经元突触连接。
然而，调节 MHC 1 类表达的因素仍然未知。胚胎脑解剖步骤需要练习才能掌握。在学习该技术时，请注意练习解剖，而不必担心时间或随后的培养过程。
为了分离胚胎海马体，将第一个收获的小鼠胚胎脑置于立体解剖显微镜下。并使用两对无菌 Dumont 5 号镊子捏住嗅球并彻底拉出脑膜。一旦脑膜被完全去除，皮质的上侧将横向打开以暴露海马体。
用镊子将海马体从附着的皮层中捏出，然后小心地将分离的海马体转移到含有 5 毫升冰上 Hibernate-E 培养基的无菌 15 毫升锥形管中。当所有海马体都收集到一个 15 毫升的试管中时，通过离心沉淀脑组织。每个胚胎用 0.5 毫升新鲜制备的木瓜蛋白酶解离物替换上清液，并通过倒置将试管混合数次。
将组织在 37 摄氏度下放置 30 分钟，每 10 分钟倒置混合样品，然后通过离心再次收集组织。用等体积的新鲜 Hibernate-E 培养基替换上清液，并使用完全打开的玻璃、火焰抛光的巴斯德移液管将组织研磨 10 次。让组织沉淀 2 分钟后，将上清液转移到新的 50 mL 锥形管中。
将等体积的 Hibernate-E 培养基加回组织中，并使用半开玻璃火焰抛光巴斯德移液管将组织研磨 10 次。让组织再静置 2 分钟后，将上清液混合在 50 mL 试管中。向组织中加入等体积的 Hibernate-E 培养基，并用四分之一开放玻璃火焰抛光的巴斯德移液管研磨组织 10 次。
让组织沉淀 2 分钟后，将上清液混合在 50 mL 试管中。通过离心收集上清液中的解离细胞。并将沉淀重悬于 5 毫升神经元生长培养基中用于计数，将细胞稀释至每毫升神经元生长培养基中 10 至 5 个活细胞的最终接种密度，并向 12 孔聚-D-赖氨酸包被板的每个孔中加入 1 毫升细胞。
然后将板放入细胞培养箱中，在培养物的使用寿命内，每周两次用等体积的新鲜培养基替换一半的培养基。为了评估培养的神经元表达 MHC1 的能力，在适当的培养日期，将每个孔中的 0.5 毫升上清液替换为 0.5 毫升新鲜神经元生长培养基，每毫升补充 200 单位干扰素 β，在细胞培养箱中孵育 6 至 72 小时。孵育结束时，用不含添加剂的冷 Neurobasal 培养基洗涤每个孔一次，然后向每个孔中加入 0.5 mL 未添加添加剂的冷 Neurobasal 培养基，其中补充有 1 μg/mL FC 模块和 1 μg/mL 荧光偶联的抗 MHC1 抗体。
在 4 摄氏度下孵育 45 分钟后，避光保存。用冷的 Dulbeccos PBS 洗涤每个孔一次。接下来，向每个孔中加入 0.5 mL 室温无酶细胞解离缓冲液，并搅拌以去除细胞。
在倒置组织培养显微镜下确认解离，并向每个孔中加入 0.5 毫升 FACS 缓冲液。研磨细胞以分散团块，并将每个孔中的全部体积转移到单独的 1.7 ml 微量离心管中。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于每管 100 微升新鲜 FACS 缓冲液中。
将每种悬浮液转移到 96 孔 U 形底板的各个孔中，并向每个孔中加入 100 微升固定剂试剂。研磨数次以避免细胞聚集，并在室温下避光孵育板 15 分钟。在孵育结束时，离心以收集孔底部的细胞，并将沉淀重悬于每孔 200 微升新鲜 FACS 缓冲液中。
离心后，将沉淀重悬于 100 μL 透化试剂中，每孔补充有荧光偶联的抗神经元核抗体。混合后，将板在室温下孵育 20 分钟，并避光摇动。在孵育结束时，通过离心 3 次收集细胞，在离心之间将沉淀重悬于 100 微升新鲜 FACS 缓冲液中。
最后一次洗涤后，将细胞重悬于 100 微升 2% 对甲醛的 FACS 缓冲液中，并充分混合。可以通过对总事件进行顺序设门以排除细胞碎片和双峰，以及通过它们的神经元核阳性来识别神经元。然后可以进一步分析神经元核阳性细胞的 MHC1 阳性。
从这些数据中，可以计算出 MHC1 染色阳性神经元的百分比和中位荧光强度，从而揭示，例如，干扰素 β 治疗显着上调 MHC1 神经元表达的百分比和强度。稍作修改，这些方法可用于培养其他神经元群，如皮质神经元或测试不同的细胞标志物、刺激分子或基因修饰。
概述
本协议概述了一种从胚胎小鼠脑中培养原代海马神经元并使用流式细胞术评估其表面主要组织相容性复合物I类（MHC I类）表达的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- MHC I类在免疫反应和神经元突触连接中发挥作用。
- 神经元中MHC I类表达的调控尚未完全了解。
- 原代神经元培养技术需要练习，尤其是在解剖中。
- 流式细胞术用于定量分析MHC I类表达。
研究目的
- 建立培养原代海马神经元的可靠方法。
- 调查培养神经元上MHC I类的表达。
- 探讨干扰素β对MHC I类表达的影响。
使用的方法
- 解剖胚胎小鼠脑以分离海马。
- 使用木瓜蛋白酶解离细胞。
- 在神经元生长培养基中培养神经元。
- 使用流式细胞术分析以评估MHC I类表达。
主要结果
- 干扰素β处理显著增加神经元中MHC I类的表达。
- 流式细胞术允许定量分析MHC I类的阳性率和中位荧光强度。
- 可以通过特定的门控策略识别神经元并分析其MHC I类表达。
- 该方法可以适用于其他神经元群体和标记物。
结论
- 该协议提供了一种系统的方法来培养和分析原代海马神经元。
- 了解神经元中MHC I类的表达可能揭示免疫-神经相互作用的见解。
- 该方法可以应用于研究各种神经元群体及其对不同刺激的反应。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of MHCI expression on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry enables precise interrogation of neuro-immune interactions relevant to CNS drug discovery. This workflow supports mechanistic de-risking and target validation for programs investigating immune modulation in neurological contexts. Reliable detection of neuronal MHCI expression informs early-stage portfolio decisions where immune signaling intersects with synaptic function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of MHCI modulation in primary neurons for hypothesis-driven target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying neuronal response to immune stimuli such as interferon beta.
- Facilitates functional assessment of neuro-immune pathways implicated in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative assay for MHCI expression using flow cytometry.
- Provides standardized gating and marker strategies for reliable neuronal identification and output measurement.
- Prepares validated neuronal systems for downstream compound or genetic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro neuronal MHCI expression data with translational biomarker strategies in neuroimmunology.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement of neuro-immune targets based on quantitative readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a robust platform for testing immune modulation in primary neuronal cultures.
- Discovery Biology: Quantifies MHCI expression changes in response to defined stimuli, supporting pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables calculation of percentage positivity and median fluorescence intensity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo or disease-relevant models where immune-neuronal interactions are critical.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for other neuronal populations or protein markers, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuro-immune target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Standardizes neuronal MHCI quantification for reproducibility and cross-study comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for neuro-immune programs by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets with immune modulation components.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuronal culture and flow cytometry analysis.
- Demands access to cell sorting and quantitative fluorescence instrumentation.
- Necessitates standardized gating and antibody labeling protocols for cross-team reproducibility.
- Adaptable to other neuronal types or markers with protocol modifications.
- Dependent on careful dissection and culture technique to ensure neuronal purity and viability.
