通过流式细胞术检测原代小鼠海马神经元主要组织相容性复合体I类分子的表达

本方案采用流式细胞术定量评估从小鼠原代神经元培养物中提取的细胞表面MHC I类分子的表达水平。也可对MHC I类分子进行NC2免疫染色，以避免因蛋白质三级结构改变、透化处理或变性条件导致的信号丢失。除了介导针对感染的免疫应答外，MHC I类分子还可调节神经元的突触连接。

然而，调控 MHC I 类分子表达的因素仍不清楚。胚胎脑解剖步骤需要练习才能掌握。在学习该技术时，应专注于练习解剖操作，不必担心所需时间或后续的培养过程。

分离胚胎海马体时，将首次收获的小鼠胚胎脑组织置于体视解剖显微镜下，使用两把无菌Dumont 5号镊子夹除嗅球，并彻底剥离软脑膜。待软脑膜完全去除后，大脑皮层的背侧会向两侧展开，从而暴露出海马体。

用镊子将海马体从附着的皮层上轻轻分离，并小心地将分离出的海马体转移至一个无菌的15毫升锥形管中，管内含有5毫升置于冰上的Hibernate-E培养基。当所有海马体均收集至同一个15毫升管中后，通过离心沉淀脑组织。弃去上清液，每胚胎加入0.5毫升 freshly prepared木瓜蛋白酶消化液，并反复倒置混匀管内液体数次。

将组织置于37摄氏度环境中30分钟，每10分钟通过倒置混匀样品一次，然后通过离心重新收集组织。弃去上清液，加入等体积的新鲜Hibernate-E培养基，使用完全开口的玻璃火烧抛光巴斯德移液管吹打组织10次。静置组织2分钟后，将上清液转移至新的50毫升锥形管中。

向组织中加入等体积的Hibernate-E培养基，用半开的玻璃火焰抛光巴斯德吸管吹打组织10次。静置组织2分钟后，将上清液收集至50毫升离心管中。向组织中再加入等体积的Hibernate-E培养基，用四分之一开的玻璃火焰抛光巴斯德吸管吹打组织10次。

静置组织两分钟后，将上清液收集至50毫升离心管中。通过离心收集上清液中的解离细胞，将沉淀重悬于5毫升神经元生长培养基中进行细胞计数。将细胞稀释至最终铺板密度为每毫升神经元生长培养基含5 × 10⁵个活细胞，并将1毫升细胞悬液加入12孔聚-D-赖氨酸包被板的每个孔中。

然后将培养板放入细胞培养箱中，每周两次更换一半培养基，每次加入与原培养基等体积的新鲜培养基，直至培养结束。为了评估培养的神经元表达MHC1的能力，在适当的培养时间点，将每孔中的0.5毫升上清液替换为0.5毫升新鲜神经元生长培养基，该培养基中添加200单位/毫升的干扰素β，随后在细胞培养箱中孵育6至72小时。孵育结束后，用不含添加剂的冷Neurobasal培养基每孔洗涤一次，然后向每孔加入0.5毫升未添加成分的冷Neurobasal培养基，该培养基中补充有1微克/毫升的FC阻断剂和1微克/毫升的荧光标记抗MHC1抗体。

在4°C下孵育45分钟后，避光保护。用冷的Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每个孔一次。接着，向每个孔中加入0.5毫升室温的无酶细胞解离缓冲液，并轻轻振荡以使细胞脱落。

在倒置组织培养显微镜下确认解离效果，向每孔加入 0.5 毫升 FACS 缓冲液。吹打细胞以分散细胞团块，并将每孔中的全部液体转移至各自的 1.7 毫升微量离心管中。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于每管 100 微升新鲜 FACS 缓冲液中。

将每种悬液转移至96孔U型底板的各个孔中，并向每孔加入100 µL固定剂试剂。反复吹打数次以避免细胞聚集，并将培养板在室温下避光孵育15分钟。孵育结束后，离心以使细胞沉淀至孔底，并将沉淀物重悬于每孔200 µL新鲜FACS缓冲液中。

离心后，将沉淀重悬于100 µL破膜试剂中，每孔加入荧光标记的抗神经元核抗体。混匀后，将培养板在室温下避光振荡孵育20分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，共离心三次，每次离心之间用100 µL新鲜FACS缓冲液重悬沉淀。

最后一次洗涤后，将细胞重悬于100微升含2%多聚甲醛的FACS缓冲液中，并充分混匀。可通过连续设门排除细胞碎片和双联体，再结合神经元核阳性来鉴定神经元。随后可进一步分析神经元核阳性细胞的MHC I类分子表达情况。

根据这些数据，可以计算出 MHC1 染色阳性的神经元百分比以及中位荧光强度，从而揭示例如干扰素 β 处理可显著上调 MHC1 神经元表达的百分比和强度。经过轻微修改，这些方法还可用于培养其他神经元群体（如皮层神经元），或检测不同的细胞标志物、刺激分子或基因修饰。