Name: 从成人人类脑组织获取人类微胶质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 了解从活体成人脑组织中高效分离原代小胶质细胞的稳健方法。该技术通过简化步骤减少细胞损失，可获得约80%纯度的小胶质细胞，适用于神经科学和细胞生物学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SJ 的实验室由印度理工学院焦特布尔分校（IITJ）的机构资助建立，并获得印度生物技术部（BT/PR12831/MED/30/1489/2015）和印度电子与信息技术部（No.4(16)/2019-ITEA）资助。人脑组织切片经机构伦理委员会批准后，由印度全印医学科学研究所（AIIMS）焦特布尔分校提供。感谢印度理工学院焦特布尔分校设计与艺术协会的本科学生 Mayank Rathor 提供视频拍摄支持。

所有组织均在获得印度理工学院焦特布尔分校和全印度医学科学研究所（AIIMS）焦特布尔分校的机构伦理委员会伦理批准后获取。
1. 组织获取与处理（第0天）
<ol>
	<li>将组织收集到含有10 mL冰冻人工脑脊液（aCSF）（2 mM CaCl2∙2H2O、10 mM葡萄糖、3 mM KCl、26 mM NaHCO3、2.5 mM NaH2PO4、1 mM MgCl2∙6H2O、202 mM蔗糖）的50 mL离心管中20。若需将组织转移至其他地点，确保离心管始终置于冰上。 
	注意：使用经高压灭菌的蒸馏水配制aCSF，并在超净台中用0.22 µm注射器滤器过滤。该溶液可在4 °C保存1个月。</li>
	<li>用70%酒精仔细擦拭收集管，然后转移至无菌超净工作台。</li>
	<li>小心弃去aCSF，并在无菌条件下称量组织重量。组织重量对于计算后续步骤所需胰蛋白酶-EDTA的体积至关重要。</li>
	<li>将组织置于新鲜预热至37 °C的aCSF中孵育5分钟。此步骤对避免细胞死亡至关重要。</li>
	<li>弃去aCSF，用37 °C的1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤组织一次。根据需要重复PBS洗涤，确保彻底去除所有血液。</li>
	<li>将组织在37 °C的温PBS中孵育5分钟。</li>
	<li>小心弃去PBS，并将组织转移至已灭菌的培养皿中。可用移液器吸除PBS，以防止组织损失。</li>
	<li>使用无菌手术刀将组织切成小块（至少1 mm3）。组织切得越细，胰蛋白酶-EDTA解离时的表面积越大，从而提高细胞得率。</li>
	<li>将切碎的组织转移至50 mL离心管中，加入每克组织10 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并用10 mL血清移液管反复吹打混匀。向培养皿中加入2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液，用移液器充分冲洗培养皿表面，然后将冲洗液全部转移回离心管中。此操作可最大限度减少切碎过程中组织和细胞的损失。</li>
	<li>将离心管置于摇床上，在37 °C、250 rpm条件下孵育30分钟。此步骤有助于增强组织中细胞的解离效果。</li>
	<li>孵育结束后，加入10 mL中和液（50% DMEM/50% F12含谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清）以中和胰蛋白酶活性，并用10 mL血清移液管混匀。所加中和液体积应与所用胰蛋白酶体积相等。</li>
	<li>在4 °C条件下以2,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于1 mL培养基（50% DMEM/50% F12含谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、20% L929上清液、10%胎牛血清）中。 
	注意：L929细胞培养于DMEM培养基（含谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清）中。细胞培养应遵循ATCC推荐的方法。上清液应从融合度至少达到75%的培养瓶中收集。可批量收集并储存在-80 °C，以防止生长因子降解。建议将L929上清液单独加入各培养瓶中，而非直接添加至基础培养基储备液中。</li>
	<li>将细胞接种于适合贴壁细胞生长的T-25培养瓶中，并加入4 mL额外培养基。将培养瓶置于37 °C、5% CO2条件下孵育。轻轻振荡培养瓶，使组织均匀分散。振荡时避免液体接触瓶口，以防污染风险增加。</li>
</ol>
2. 细胞培养（第2天）
<ol>
	<li>在第0天从T-25培养瓶中收集培养基，平均分装至三个1.5 mL离心管中。用1 × PBS洗涤培养瓶一次，轻轻晃动培养瓶以去除残留的组织碎片。避免剧烈震荡，因少量残留碎片不会对培养产生不利影响。向培养瓶中加入5 mL新鲜培养基。</li>
	<li>将收集的培养基于4 °C、1,466 × g（4000 rpm）离心4分钟。</li>
	<li>弃去每管中的上清液，向其中一管加入1 mL培养基，用移液器充分混匀。将含有细胞的混合培养基依次转移至其余各管中，每加一次均用移液器充分混匀，最后将所有细胞汇集至同一管中。</li>
	<li>将细胞接种至另一个适合贴壁细胞生长的T-25培养瓶中，加入4 mL培养基，于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
</ol>
3. 细胞培养（第4天）
<ol>
	<li>弃去两个烧瓶中的培养基，向烧瓶中加入新鲜的 5 mL 培养基。</li>
	<li>将烧瓶置于 37 °C、5% CO2 条件下培养 2 天。</li>
</ol>
4. 细胞培养（第6天）
<ol>
	<li>细胞将可用于后续实验。</li>
</ol>

<ol><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li>
<li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+Beyond%3A+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li>
<li>Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+heterogeneity+in+tissues%3A+phenotypic+diversity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%3A+A+microglial+conundrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li>
<li>Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li>
<li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li>
<li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+TBI+brain%3A+The+good%2C+the+bad%2C+and+the+dysregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518(2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2FBrain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+side+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer%27s+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PU.1+regulates+Alzheimer%27s+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44(2018).</li>
<li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li>
<li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain%3A+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16(2017).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371(2016).</li>
<li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inflammasome+Sensor%2C+NLRP3%2C+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).</li>
<li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li>
<li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+%28Lt+betaR%29%3A+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophage+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小胶质细胞在正常脑组织中维持稳态，并在多种神经系统疾病的病理生理过程中发挥核心作用4小胶质细胞在神经发育和突触形成中起核心作用2小胶质细胞研究已被证明对于理解多种神经系统疾病的发生与发展至关重要4啮齿类动物的小胶质细胞是原代小胶质细胞研究中最常用的选择模型，尽管在多个关键方面，啮齿类动物的小胶质细胞与原代人类小胶质细胞存在差异。13开发经济高效且高产量的原代人小胶质细胞分离方案可能有助于弥补这一空白。我们建立了一种从活体手术切除的成年人大脑组织中分离原代人小胶质细胞的方案。经检测，所获小胶质细胞纯度约为80%，检测时间为第7天th 天
该实验方案中最关键的步骤之一是将获取的组织运输至实验室进行处理。由于运输时间约为75分钟，我们可能无法成功分离出任何细胞。为此，我们使用一个50 mL离心管，仅加入10 mL aCSF。aCSF提供了组织所需的营养物质，而管内剩余的空间有助...

中枢神经系统（CNS）由一个复杂的神经元和胶质细胞网络构成1。在胶质细胞中，小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞发挥作用2,3。小胶质细胞在健康的中枢神经系统中负责维持稳态4。此外，小胶质细胞通过突触修剪在神经发育过程中发挥重要作用2。小胶质细胞在多种神经系统疾病的病理生理过程中处于核心地位，包括但不限于阿尔茨海默病5、帕金森病6、脑卒中7、多发性硬化8、创伤性脑损伤9、神经病理性疼痛10、脊髓损伤11以及胶质瘤等脑肿瘤12。
与中枢神经系统稳态及疾病相关的研究常利用啮齿类动物的小胶质细胞，原因是目前缺乏经济高效且省时的人原代小胶质细胞分离方案13。啮齿类动物的小胶质细胞在Iba-1、PU.1、DAP12和M-CSF受体等基因的表达方面与人原代小胶质细胞相似，已被广泛用于理解正常及病变脑组织的功能13。有趣的是，多种免疫相关基因（如TLR4、MHC II、Siglec-11和Siglec-3）在人与啮齿类动物小胶质细胞中的表达存在差异13。此外，在两种物种中，多个基因的表达在时间动态变化以及神经退行性疾病状态下也有所不同14,15。这些显著差异表明，人小胶质细胞是研究小胶质细胞在稳态与疾病中功能不可或缺的模型。原代人小胶质细胞还可作为潜在药物候选物临床前筛选的有效工具16。上述原因凸显了建立经济高效的人原代小胶质细胞分离方案日益增长的需求。
我们建立了一种从成人脑组织中分离原代人源小胶质细胞的方案，这些脑组织是因肿瘤切除或其他外科手术过程中产生的手术窗口而获得的。本方法与现有方法有显著不同。我们能够在组织取材地点至实验室开始分离操作的约75分钟转运时间后，成功分离并培养小胶质细胞。我们使用L929成纤维细胞的上清液促进分离后小胶质细胞的生长。该方法专门针对仅培养和扩增原代小胶质细胞。所获得的细胞培养物中小胶质细胞比例约为80%。尽管其他方案可通过密度梯度离心、流式细胞术和磁珠分选等方法获得富集的小胶质细胞培养物，但本方案是一种快速、简便、稳定且成本效益高的原代人源小胶质细胞培养方法17,18,19,20。相较于现有方法，本方案能够利用手术切除的活体成人脑组织，而非尸体来源的固定脑组织，具有明显优势18,21。

<table><tbody><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液</td><td>Himedia</td><td>A002</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>离心机（4 &amp;deg;C）</td><td>Sigma</td><td>146532</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>Abdos</td><td>P10203</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>New Brunswik</td><td>Galaxy 170 S</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Himedia</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>含谷氨酰胺的DMEM培养基</td><td>Himedia</td><td>AL007S</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Himedia</td><td>RM9955</td><td></td></tr><tr><td>锥形离心管（50 ml）</td><td>Thermo Fsiher Scientific&amp;nbsp;</td><td>50CD1058</td><td></td></tr><tr><td>荧光素标记蓖麻凝集素-1</td><td>Vector</td><td>FL-1081</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DM2000LED</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的Fluoroshield封片剂</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>GFAP抗体</td><td>GA5</td><td>3670S</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>New Brunswik Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>L929细胞系</td><td>ATCC</td><td>NCTC克隆929 [L细胞，L-929，Strain L的衍生株] (ATCC&amp;nbsp;CCL-1)</td><td></td></tr><tr><td>层流洁净台</td><td>Thermo Fsiher Scientific&amp;nbsp;</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Merck</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12营养混合物培养基</td><td>Himedia</td><td>Al106S</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Duran Group</td><td>237554805</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Himedia</td><td>ML023</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Himedia</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Labware</td><td>LW-SP1010</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Himedia</td><td>MB045</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Himedia</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（0.2&amp;mu;m，25 mm直径）</td><td>Axiva</td><td>SFPV25R</td><td></td></tr><tr><td>适用于贴壁细胞培养的T-25细胞培养瓶</td><td>Himedia</td><td>TCG4-20X10NO</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

从成人脑组织中获取人源小胶质细胞

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中常驻的固有免疫细胞。小胶质细胞在发育过程中、维持稳态以及感染或损伤期间发挥着关键作用。多个独立研究团队已强调了小胶质细胞在自身免疫性疾病、自身炎症综合征和癌症中的核心作用。在某些神经系统疾病中，小胶质细胞的活化可能直接参与致病过程。原代小胶质细胞是研究脑内免疫反应、细胞间相互作用以及疾病中小胶质细胞表型失调的有力工具。与永生化的小胶质细胞系相比，原代小胶质细胞更能模拟体内小胶质细胞的特性。成人人类小胶质细胞与胎儿人类及啮齿类小胶质细胞具有明显不同的特性。本实验方案提供了一种从成人人类脑组织中高效分离原代小胶质细胞的方法。研究这些小胶质细胞有助于深入理解小胶质细胞与中枢神经系统中其他常驻细胞群体（包括少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞）之间的细胞间相互作用。此外，可对来自不同人脑的小胶质细胞进行培养，以表征其独特的免疫反应，推动个体化医学及多种治疗应用的发展。

通过采用上述方案（图1），我们成功从活体手术切除的脑组织中分离出原代人源小胶质细胞。培养的细胞使用蓖麻凝集素-1（Ricinus communis agglutinin-1，RCA-1）对小胶质细胞进行染色（绿色），并使用胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）对星形胶质细胞进行染色（红色）（图2），方法如前所述22,23,24,25,26。使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）对细胞核进行染色（...

本方案是一种高效、经济且可靠的从活体成人人类脑组织中分离原代小胶质细胞的方法。分离得到的原代人类小胶质细胞可作为研究稳态及疾病状态下细胞过程的工具。

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中常驻的固有免疫细胞。小胶质细胞在发育过程中以及维持……中发挥关键作用。

本方案的总体目标是从活体成人脑组织中分离原代小胶质细胞。在我们的案例中，这些组织是在手术过程中作为手术窗口获取的。首先将脑组织收集于冰上预冷的PBS中，随后将组织切成约1毫米见方的小块，并借助胰蛋白酶-EDTA进行消化处理。随后，通过离心收集细胞，并将其接种于适合雄激素细胞培养的培养瓶中，培养48小时。再次从培养瓶中收集细胞，并继续培养以供后续使用。现在可利用免疫细胞化学方法对原代人小胶质细胞进行表征，并用于进一步的实验。本方案从成人人类脑组织中分离小胶质细胞的主要优势在于，能够以非常经济的方式高效获得原代成人人类小胶质细胞。该方案具有良好的稳健性，并通过减少现有方案中的操作步骤，降低了细胞损失。将组织收集至含有10 mL冰上预冷的aCSF的50 mL Falcon管中。用70%酒精小心擦拭收集管，然后转移至无菌超净工作台。小心弃去aCSF，并将组织放入Falcon管中称重。通过减去空Falcon管的重量，计算组织的近似重量。将新鲜的 aCSF 预热至 37 摄氏度。将组织置于温热的 aCSF 中 5 分钟。此步骤至关重要，可避免细胞死亡。小心弃去 aCSF，并用预热至 37 摄氏度的 1× PBS 清洗组织一次。根据需要反复用 PBS 清洗，确保所有血液完全去除。将组织在温热的 PBS 中孵育 5 分钟。小心弃去一半 PBS。将组织连同剩余的 PBS 转移至已灭菌的培养皿中。用1 mL移液器小心吸除残留的PBS，以防止组织丢失。使用无菌手术刀将组织切成至少1 mm³的小块。向培养皿中加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，借助移液管充分洗涤培养皿。将切碎的组织转移至含有 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 的 50 mL Falcon 管中，每克组织加入 10 mL。使用 10 mL 血清移液管反复吹打混匀。将试管置于37摄氏度、250 rpm转速的摇床上孵育30分钟。加入10 mL中和培养基以中和胰蛋白酶。用10 mL血清移液管充分混匀。在 4 摄氏度下以 2000G 离心 10 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 培养基中。将细胞接种至适合雄激素细胞培养的 T25 培养瓶中，并加入 4 mL 新鲜培养基。培养基将包含20% L929上清液和1%链霉素。建议将L929上清液单独加入培养瓶中，而不是添加到储存的培养基中。我们已完成使用培养瓶对组织进行均匀分散。震荡时避免将培养基带到瓶口，以免增加污染风险。将培养瓶置于37摄氏度、5% CO2条件下培养48小时。从第0天准备的T25培养瓶中收集培养基至离心管中。在 4 摄氏度下，以 1,466 ×g 离心收集的培养基 4 分钟。在收集的培养基离心的同时，用 1× PBS 清洗第 0 天的培养瓶一次。轻轻摇动培养瓶，以去除残留的组织碎片。避免剧烈振荡烧瓶，因为任何残留的碎片都不会对培养物产生不利影响。向烧瓶中加入 5 mL 新鲜培养基。弃去离心管中的上清液。向其中一根试管中加入 1 mL 培养基，并用移液器充分混匀。将含有细胞的混合培养基依次加入其他试管中，每加一次均需充分混匀。将细胞接种至一个独立的 T25 培养瓶中，该培养瓶适用于雄激素细胞培养。向培养瓶中加入 4 mL 新鲜培养基。将两个培养瓶在 37 摄氏度、5% CO2 条件下培养 48 小时。弃去两个培养瓶中的培养基，并加入 5 mL 新鲜培养基。将烧瓶在37摄氏度、5% CO2条件下孵育48小时。第6天时，细胞即可用于后续实验。如图中所示。图A部分第一张图像显示星形胶质细胞经GFAP染色，呈绿色。图A部分第二张图像显示小胶质细胞经RCA染色，呈绿色。图B部分显示小胶质细胞经RCA染色，呈绿色，星形胶质细胞经GFAP染色，呈红色。图像叠加显示了小胶质细胞与星形胶质细胞的共定位。从图像中可以明显看出，所制备的培养物中大部分细胞为小胶质细胞。图像由盲法对照进行定量分析，结果展示于C部分。结果显示，所制备的培养物中约有80%的细胞为小胶质细胞。该技术操作耗时约一个半小时。通过本方案，应能充分掌握如何从成人人类脑组织中分离出启动状态的小胶质细胞，并可将其用于后续实验。

obtaining-human-microglia-from-adult-human-brain-tissue

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

从成人人类脑组织获取人类微胶质

从大脑复杂的细胞异质性中分离原代小胶质细胞，对于研究其在生理和病理条件下的作用至关重要。本方案描述了一种机械分离与混合细胞培养技术，可获得高产量、高纯度且具有活性的原代小胶质细胞 体外...

从新生大鼠脑组织的混合胶质细胞培养物中分离原代小胶质细胞

该视频演示了一种从成年小鼠脑皮层中分离小胶质细胞的技术。首先，对皮层进行分割和匀浆处理，以去除神经元和其他胶质细胞，同时保留小胶质细胞。随后，将细胞悬液与抗髓鞘磁珠以及磁场接触，从而有效分离出小胶质细胞和髓系细胞，去除髓鞘碎片及含有髓鞘的细胞。...

从成年小鼠大脑皮层中分离小胶质细胞

该视频展示了从新生小鼠脑组织中分离和培养细胞的方法。该方法包括对脑组织进行酶消化和机械解离，随后在不含神经元生长因子的培养基中进行培养，以获得混合的胶质细胞群体。...

从新生小鼠脑组织中获取混合胶质细胞培养物

我们概述了从新生小鼠大脑皮层和成年小鼠脊髓中高效、快速分离和培养活体小胶质细胞的方法。皮层小胶质细胞的解剖与接种可在90分钟内完成，初次解剖后约10天可进行后续的小胶质细胞收获。...

培养来自新生期和成年中枢神经系统的小胶质细胞

成功研究小胶质细胞生物学的一个关键在于，从小胶质细胞从中枢神经系统组织中分离的过程中，保持其免疫功能的 ex vivo 状态。通过旋转振荡法分离小胶质细胞，可获得高纯度且具有免疫功能的细胞培养物，这一点在使用促炎刺激物脂多糖（LPS）和 Pam3CSK4（Pam）激活小胶质细胞后，通过荧光成像、免疫细胞化学和 ELISA...

从新生小鼠中分离保留免疫表型和功能的皮层小胶质细胞

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

本文介绍的实验方案允许通过鼻腔途径将诱导多能干细胞来源的人小胶质细胞（iPSMG）移植到免疫功能健全的小鼠脑内。文中展示了细胞的制备与鼻腔移植方法，以及为维持iPSMG存活而给予细胞因子混合物的操作步骤。...

通过无创经鼻途径在免疫功能健全小鼠脑内移植人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞

本方案描述了将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为小胶质细胞样细胞的过程 体外 实验。我们还包含了一种详细的制备方法，用于从诱导多能干细胞衍生的下运动神经元中生成人突触体，该突触体可作为底物用于 体外...

人源小胶质样细胞：由诱导性多能干细胞分化而来及 体外 使用人突触体的活细胞吞噬作用检测

我们描述了一种利用磁珠激活细胞分选（MACS）技术从小鼠下丘脑（或类似的较小脑区结构）中快速分离小胶质细胞的实验方案。经MACS分选获得的下丘脑小胶质细胞可用于 离体 分析并可接种培养以进行 体外...

通过磁激活细胞分选法从新鲜灌注的成年小鼠脑组织中分离下丘脑小胶质细胞

本研究阐述了一种建立人单核细胞来源的小胶质细胞样（iMG）细胞的新方法，可用于间接评估脑部炎症。该细胞模型可能有助于针对脑部潜在炎症及相关神经精神疾病的研究。...

用于逆向转化脑科学研究的人源血液诱导小胶质样细胞的构建

了解从活体成人脑组织中高效分离原代小胶质细胞的稳健方法。该技术通过简化步骤减少细胞损失，可获得约80%纯度的小胶质细胞，适用于神经科学和细胞生物学研究。

从成人脑组织中获取人源小胶质细胞

探索更多视频