Name: 在跨脊柱直流刺激期间类型识别大鼠脊柱腺瘤的 Vivo 细胞内记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学习在体细胞内记录技术，研究跨脊柱直流刺激对大鼠腰段运动神经元膜特性及节律性放电模式的影响。该方法为神经康复应用提供重要实验基础。

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本工作由国家科学中心资助，项目编号为 2017/25/B/NZ7/00373。作者谨此感谢 Hanna Drzymała-Celichowska 和 Włodzimierz Mrówczyński 的贡献，他们两人均参与了本文所呈现结果的数据收集与分析工作。

本方案所涉及的所有操作均已获得相关主管部门（例如，当地伦理委员会）的批准，并遵循有关动物福利与管理的国家及国际准则。
注意：参与该操作的每位人员都必须接受过基本外科手术操作的适当培训，并持有进行动物实验的有效许可证。
1. 麻醉与术前给药
<ol>
	<li>使用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（6月龄、体重400‒550 g的雄性Wistar大鼠的初始剂量为60 mg·kg-1）。 
	注意：本方案不限于上述品系、性别或年龄的大鼠。若出于不同研究目的或伦理委员会要求，也可选用其他麻醉剂，如氯胺酮-赛拉嗪混合剂、α-氯醛糖、或芬太尼+咪达唑仑+美托咪定组合。</li>
	<li>约5分钟后，用钝头镊子夹捏大鼠后肢脚趾，检查麻醉深度。只有在未观察到反射反应时，方可进行后续操作步骤。</li>
	<li>皮下注射0.05 mL阿托品，以减少插管后黏液分泌。</li>
	<li>皮下注射5 mL磷酸盐缓冲液，其中含4%葡萄糖溶液、NaHCO3（1%）和明胶（14%）。该缓冲液将在实验过程中经皮下血管吸收，有助于维持体液平衡。</li>
	<li>在整个手术过程中，应定期检查动物是否存在反射反应，并根据需要追加麻醉剂（戊巴比妥钠10 mg·kg-1·h-1）。</li>
</ol>
2. 手术
<ol>
	<li>为动物进行手术处理做准备：剃除左后肢背侧从踝关节到髋关节、背部从尾部到高位胸段、胸部左侧以及胸骨上方颈部腹侧区域的毛发</li>
	<li>静脉通路的建立
	<ol>
		<li>将大鼠仰卧位放置于闭环加热垫上，并用肢体固定装置固定。</li>
		<li>使用21号刀片，沿皮肤从胸骨向颏部做纵向切口。</li>
		<li>用镊子夹住皮肤，并将其与下方组织分离。</li>
		<li>采用钝性分离技术暴露右侧颈外静脉，小心地将静脉从周围组织中游离出来。</li>
		<li>找到无分支的静脉段，在其下方穿入两根4-0缝线。</li>
		<li>在先前确定的无分支静脉段近心端打一个松结，在该静脉段远心端也打一个松结。在靠近心脏一侧夹闭静脉，然后结扎远心端。</li>
		<li>使用虹膜剪在夹子与远端结扎线之间剪开静脉。提起静脉瓣膜，将预充液体的导管插入至被夹子阻挡处。</li>
		<li>用镊子夹住静脉和导管，移除夹子并将导管向静脉内推进数毫米。将导管两端固定于静脉上，并额外在皮肤上增加一个固定点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>气管插管的置入
	<ol>
		<li>使用钝头镊子分离覆盖胸骨舌骨肌的两个下颌腺体，沿中线分开胸骨舌骨肌以暴露气管。</li>
		<li>在气管下方穿入三根4-0缝线，然后在气管插管插入点下方打两个结，上方打一个结。</li>
		<li>定位喉部的环状软骨，在第三气管软骨环下方做切口。</li>
		<li>将气管插管沿气管插入，并用预先准备好的缝线固定插管位置，再额外加一根缝线将插管固定于皮肤。</li>
		<li>在分离的肌肉上方放置一小块浸有生理盐水的棉球，缝合手术区域的皮肤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>后肢神经的解剖
	<ol>
		<li>使用21号刀片在左后肢背侧从跟腱至髋关节处做纵向切口。</li>
		<li>用镊子夹住皮肤，采用钝性分离技术将切口两侧的皮肤与下方肌肉分离。</li>
		<li>找到由股二头肌覆盖的膝关节后方腘窝区域，使用剪刀在该肌肉的前部与后部之间做切口。</li>
		<li>向上延伸切口，将股二头肌的两个头完全切断至髋部，以暴露坐骨神经。必要时进行电凝止血。</li>
		<li>辨认坐骨神经的腓肠神经、胫神经和腓总神经分支。</li>
		<li>使用剪刀将腓肠肌外侧头与内侧头分离，以暴露胫神经及其分支。</li>
		<li>使用55号镊子夹住腓肠神经远端，远端切断并尽可能向近端游离神经。</li>
		<li>对腓总神经重复上述操作。</li>
		<li>使用钝头玻璃棒将胫神经从周围组织中分离，注意避免损伤血管，并在其远端切断。</li>
		<li>辨认内侧腓肠肌（MG）神经以及外侧腓肠肌和比目鱼肌（LGS）神经。</li>
		<li>使用55号镊子小心游离MG神经和LGS神经，将其与周围组织分离，但保持其与相应肌肉的连接。</li>
		<li>在暴露的神经下方放置一块浸有生理盐水的棉球。</li>
		<li>缝合手术区域的皮肤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>椎板切除术
	<ol>
		<li>使用21号刀片从骶骨向上至胸椎做纵向切口。</li>
		<li>将皮肤与下方肌肉分离。</li>
		<li>在胸椎和腰椎棘突两侧切断最长肌。</li>
		<li>使用钝刃手术刀将肌肉从脊柱上推开，暴露每节椎骨的横突。</li>
		<li>使用钝头剪刀沿暴露的脊柱剪断附着于横突的肌肉腱，必要时使用止血剂。</li>
		<li>将Th13椎骨识别为具有肋骨附着的最下端胸椎节段，使用精细咬骨钳去除Th13至L2椎骨的棘突和椎板，以暴露脊髓的腰段。注意不要损伤将用于脊柱稳定的L3棘突。</li>
		<li>去除Th12椎骨的棘突，并尽可能磨平椎骨背侧表面。</li>
		<li>采用钝性分离技术将肌肉从Th11椎骨处分离，以创建支架插入点。</li>
		<li>在暴露的脊髓节段上覆盖一层薄的浸有生理盐水的棉球。</li>
		<li>将大鼠转移至特制的金属框架上，该框架配有两根平行杆和两个带夹子的可调节臂，用于支撑和稳定脊柱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 记录与刺激的准备工作
<ol>
	<li>脊柱固定与神经排列
	<ol>
		<li>将大鼠置于定制框架内，放置在连接闭环加热系统的加热垫上，以维持动物体温在 37 ± 1°C。</li>
		<li>将心电图电极插入皮下，并连接至放大器以监测心率。</li>
		<li>利用皮肤瓣，在暴露的脊髓上方形成一个深池。</li>
		<li>使用金属夹具，将夹具置于 Th12 横突下方和 L3 棘突处，以固定脊柱。</li>
		<li>确保脊柱被牢固固定并保持水平，然后在脊柱两侧施加背腹向压力以牵开肌肉。</li>
		<li>用温热（37 °C）的矿物油填充该池，并维持此温度。</li>
		<li>将 4-0 缝线穿过跟腱，提起并拉伸手术侧左后肢，使踝关节与髋关节处于同一水平。</li>
		<li>利用皮肤瓣，在暴露的胫神经、MG 和 LGS 神经上方形成一个深池。</li>
		<li>用温热（37 °C）的矿物油填充该池。</li>
		<li>将 MG 和 LGS 神经置于双极银丝刺激电极上，并连接至方波刺激器。每个神经使用独立的刺激通道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表面电极放置
	<ol>
		<li>将一个银球电极置于暴露脊髓左侧尾侧，参考电极插入背部肌肉中，并将两个电极连接至差分直流放大器。该表面球状电极用于记录来自神经的传入冲动群。</li>
		<li>使用恒流刺激器，以持续时间为 0.1 ms、频率为 3 Hz 的方波脉冲刺激 MG 和 LGS 神经，观察传入冲动群。</li>
		<li>确定神经激活的阈值（T），以约 3·T 强度分别刺激每条神经，并记录每条神经传入冲动群的幅度。</li>
		<li>将表面电极向头侧移动并重复该步骤，以确定每条神经冲动群幅度最大的脊髓节段。确定最大冲动群位置后，将表面电极移至远离脊髓的安全距离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肌肉麻痹与建立气胸以减少呼吸运动
	<ol>
		<li>通过静脉注射神经肌肉阻滞剂使大鼠麻痹，并将气管插管连接至外置呼吸机，同时连接适用于啮齿类动物的二氧化碳浓度监测仪（潘库溴铵，初始剂量为 0.4 mg·kg-1，每 30 分钟追加 0.2 mg·kg-1）。</li>
		<li>监测呼气末 CO2 浓度，并通过调节通气参数（频率、气道压力和潮气量）将其维持在约 3‒4%。</li>
		<li>在记录侧第 5 与第 6 肋骨之间的皮肤上做一纵向切口。</li>
		<li>使用钝头剪刀剪开覆盖的肌肉，以暴露肋间间隙。</li>
		<li>使用小型锐利剪刀，在肋间肌和胸膜上做一小切口，然后将钝头镊子尖端插入开口，注意避免压迫肺组织。</li>
		<li>让镊子自然撑开，或插入小管以保持气胸开放状态直至实验结束。</li>
		<li>神经肌肉阻滞完成后，通过监测心电图频率评估麻醉深度，若心率超过 400 bpm，则补充麻醉剂。&#160;肌肉麻痹与建立气胸以减少呼吸运动，从而提高记录稳定性</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切开硬脑膜与软脑膜
	<ol>
		<li>使用 #55 镊子轻轻提起硬脑膜，从 L5 节段开始向尾侧，向头侧剪至 L4 节段。</li>
		<li>使用一对超薄 5SF 镊子，在背柱表面血管之间的软脑膜上制造一个小孔，位置应精确对应 MG 或 LGS 神经传入冲动群最大的节段。</li>
		<li>必要时使用浸有生理盐水并干燥的明胶海绵小块止血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>经脊髓直流电刺激（tsDCS）电极放置
	<ol>
		<li>在大鼠腹部腹侧、对应 L4-L5 脊髓节段的头尾水平处，做一小切口。</li>
		<li>用金属夹夹住暴露的皮肤瓣，该夹将作为参考电极。</li>
		<li>在 Th12 椎骨背侧放置一块浸有生理盐水的海绵。确保海绵大小与主动 tsDCS 电极相同（直径为 5 mm 的圆形不锈钢板）。</li>
		<li>使用精细操纵器，将主动 tsDCS 电极压在海绵上并紧贴骨骼，确保电极整个表面均匀受压。</li>
		<li>将参考电极和主动 tsDCS 电极均连接至恒流刺激装置，该装置能够提供持续的直流电流。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微电极制备
	<ol>
		<li>使用微电极拉制仪制备微电极。 
		注：可使用带纤维或无纤维电极，但需注意电极柄必须足够长以到达前角，同时足够细以避免在下降过程中压迫脊髓。
		<ol>
			<li>调节拉制仪参数，使进入脊髓的电极柄长约 3 mm，电极尖端直径不超过 1‒2 µm，微电极电阻介于 10 至 20 MΩ 之间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用 2M 柠檬酸钾电解液填充微电极。</li>
		<li>将制备好的微电极安装在微操纵器上，确保可实现 1‒2 µm 的步进移动和立体定位校准。</li>
		<li>将微电极连接至细胞内放大器，参考电极置于背部肌肉中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>&#160;神经肌肉阻滞后，通过监测心电图频率评估麻醉深度，并补充麻醉剂，使大鼠心率不超过 400 bpm。</li>
</ol>
4. 运动神经元追踪与穿刺
<ol>
	<li>将传入放电记录电极重新放置在脊髓背侧表面，位于记录位点尾侧，L6节段水平。</li>
	<li>以3 Hz频率、3T强度、0.1 ms电脉冲刺激MG和LGS神经，以激活所选神经内所有α-运动神经元的轴突。</li>
	<li>以15‒20°的内-外侧角度（尖端指向外侧）将微移液管插入软脑膜的选定区域。</li>
	<li>在下降至表面以下后，校准微电极并补偿其电容和电压偏移；当所有参数稳定后，继续穿透脊髓。在刺激相应神经时，随着接近特定的运动核团，可在微电极电压轨迹中观察到运动神经元池的逆向场电位。</li>
	<li>以1‒2 µm的步进继续微电极的穿透，并定期使用细胞内放大器的“buzz”功能清除电极尖端的残留物。</li>
	<li>观察运动神经元的穿透过程，其特征为记录电压轨迹突然超极化，并出现逆向锋电位。</li>
</ol>
5. 记录运动神经元膜电位和放电特性
<ol>
	<li>在细胞内放大器的桥式模式下，通过刺激相应的神经分支，根据逆向动作电位的“全或无”特性来鉴定运动神经元。记录随后的20次扫描轨迹，用于后续平均处理。</li>
	<li>&#160;实施严格的纳入标准以确保高质量&#160;数据：静息状态&#160;至少 -50 mV 的膜电位&#160;振幅；动作&#160;大于50 mV的电位幅度，呈正相&#160;超调；膜&#160;在记录前至少稳定5分钟。</li>
	<li>在细胞内放大器的不连续电流钳模式（电流切换速率模式 4–8 kHz）下，使用 0.5 ms 的细胞内去极化电流脉冲诱发运动神经元的顺向动作电位。重复至少 20 次，用于离线平均处理。</li>
	<li>使用40次超极化电流脉冲（1 nA，每次100 ms）刺激运动神经元，以计算细胞的输入电阻。</li>
	<li>使用50 ms的方波脉冲以递增的幅度刺激运动神经元，确定引起单个动作电位所需的去极化电流的最小幅度，即为阈值电流（rheobase）。</li>
	<li>注入持续时间为500毫秒的方波去极化电流脉冲，以0.1–2纳安为步长逐步增加电流强度，以诱发运动神经元的节律性放电。</li>
</ol>
6. 经脊髓直流电刺激（tsDCS）
<ol>
	<li>在保持运动神经元稳定穿刺的同时，通过脊髓直流电刺激开始极化程序。根据实验设计调整电流强度和刺激时间（例如，0.1 mA，持续15分钟）。</li>
	<li>在开启直流电后立即观察运动神经元的膜电位。阳极极化（主动电极为阳极）应导致膜电位去极化，而阴极极化（主动电极为阴极）则应引起相反效应。观察膜电位静息值在直流电刺激下的变化是否稳定，以确保电场强度未受影响。</li>
	<li>在持续电流刺激过程中，每隔5分钟重复步骤5.3‒5.6。</li>
	<li>关闭直流电后，继续每隔5分钟重复步骤5.3‒5.6，直至记录信号不稳定或不符合纳入标准。</li>
	<li>终止实验，并通过静脉注射戊巴比妥钠致死剂量（180 mg·kg-1）处死动物。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

如果操作正确，所述实验方案的手术部分应在大约三小时内完成。手术过程中应特别注意维持动物生理状态的稳定，尤其是体温和麻醉深度。除了明显的伦理考量外，麻醉不足可能导致在神经分离或椎板切除期间出现过度的肢体运动，从而损伤制备标本或导致实验提前终止。在使用微电极穿刺脊髓之前，若对动物实施麻痹，必须密切监测麻醉深度和心率，并根据动物体重及肺容量调整适当的通气参数。一旦生理参数偏离正常范围，必须立即纠正，以确保手术成功。手术完成后，应能够维持至少四小时的稳定记录状态。
在运动神经元穿刺后，记录的稳定性至关重要。对照记录期间必须保持膜电位恒定，因为任何波动都会显著影响阈下电流（rheobase current）以及节律性放电的阈值。适当固定脊柱可提供基本的稳定性，而实施气胸的目的则是减少呼吸所诱发的脊髓运动。此外，在进行穿刺前，必须确保肌肉收缩已完全消除，并需定期给予神经肌肉阻断剂。
在成功穿透后，可通过刺激相应的神经分支逆行识别所记录的运动神经元。这是体内实验准备的一大优势，因为在此条件下运动神经元的轴突仍与所支配的肌肉保持连续，而相比之...

经脊髓直流电刺激（tsDCS）正逐渐被认可为一种在健康和疾病状态下调节脊髓环路兴奋性的有效方法1,2,3。该技术通过位于选定脊髓节段上方的主动电极与位于腹侧或更头端位置的参考电极之间传递恒定电流来实现刺激4。已有多个研究证实，tsDCS可用于治疗某些病理状态，例如神经病理性疼痛5、痉挛性肌张力增高6、脊髓损伤7，或用于促进康复过程8。研究人员&#160;提出，tsDCS可引起细胞膜内外细胞内和细胞外空间离子分布的改变，这种改变可能促进或抑制神经元活动，具体效应取决于电流的方向9,10,11。然而，直到最近，尚缺乏对运动神经元直接受此影响的直接证据。
本文介绍了一种详细的实验方案，用于在麻醉大鼠中进行腰段脊髓运动神经元的活体细胞内记录，同时应用经脊髓直流电刺激（tsDCS），以观察脊髓神经网络在阳极或阴极极化条件下，运动神经元膜特性和放电特性所发生的变化。相较于先前使用的细胞外记录技术，细胞内记录可开辟多个神经元特性研究的新领域9,12。例如，可精确测量tsDCS诱导的直流电流所引起的运动神经元膜电位变化，确定动作电位产生的电压阈值，或分析动作电位的各项参数。此外，该技术还可用于测定运动神经元的被动膜特性（如输入电阻），并观察细胞内刺激电流与运动神经元节律性放电频率之间的关系。通过逆向刺激功能明确的外周神经（即支配屈肌或伸肌的传出神经）来鉴定所记录的运动神经元，可进一步区分其所支配的运动单位类型（快型与慢型），从而为检验极化效应是否对成熟脊髓神经系统的不同组成单元产生差异性影响提供可能。由于记录前需进行广泛的外科手术，且对记录的稳定性和可靠性要求极高，该技术具有较大挑战性，但可实现对单个运动神经元电生理特性的直接、长期评估——包括tsDCS应用前、中、后的连续观察，这对于明确tsDCS的即时效应及持续作用至关重要13。由于运动神经元直接激活梭外肌纤维14，并参与肌肉收缩及力量产生的反馈调控15,16，因此任何观察到的tsDCS对运动单位或肌肉收缩特性的影响，均可关联至运动神经元兴奋性或放电特性的调节作用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;药物与溶液&lt;/strong&gt;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Atropinum sulfuricum</td><td>Polfa Warszawa</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Merck</td><td>346351</td><td>-</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>106329</td><td>-</td></tr><tr><td>Pancuronium Jelfa</td><td>PharmaSwiss/Valeant</td><td>-</td><td>神经肌肉阻滞剂</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Biowet Pu?awy Sp. z o.o</td><td>-</td><td>主要麻醉剂</td></tr><tr><td>柠檬酸钾</td><td>Chempur</td><td>6100-05-06</td><td>-</td></tr><tr><td>Tetraspan</td><td>Braun</td><td>-</td><td>HES 溶液</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术器械&lt;/strong&gt;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>21 号刀片</td><td>FST</td><td>10021-00</td><td>手术刀片</td></tr><tr><td>电凝器</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>-</td></tr><tr><td>胸腔引流管</td><td>Mila</td><td>CT1215</td><td>-</td></tr><tr><td>Dumont #4 镊子</td><td>FST</td><td>11241-30</td><td>肌肉镊</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>硬脑膜镊</td></tr><tr><td>Dumont #5F 镊子</td><td>FST</td><td>11255-20</td><td>神经镊</td></tr><tr><td>Dumont #5SF 镊子</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>软脑膜镊</td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11008-13</td><td>钝头镊</td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11053-10</td><td>皮肤镊</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>FST</td><td>13013-14</td><td>-</td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td>FST</td><td>16021-14</td><td>用于椎板切除术</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>静脉剪</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>FST</td><td>15002-08</td><td>硬脑膜剪</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>FST</td><td>14184-09</td><td>用于气管切开</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>FST</td><td>104075-11</td><td>肌肉剪</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>FST</td><td>14002-13</td><td>皮肤剪</td></tr><tr><td>气管插管</td><td>-</td><td>-</td><td>定制</td></tr><tr><td>静脉导管</td><td>Vygon</td><td>1261.201</td><td>-</td></tr><tr><td>血管插管镊</td><td>FST</td><td>18403-11</td><td>-</td></tr><tr><td>血管夹</td><td>FST</td><td>18320-11</td><td>用于静脉夹闭</td></tr><tr><td>血管扩张探针</td><td>FST</td><td>10160-13</td><td>用于静脉解剖</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术材料&lt;/strong&gt;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>明胶海绵</td><td>Pfizer</td><td>GTIN 00300090315085</td><td>止血剂</td></tr><tr><td>丝线 4.0</td><td>FST</td><td>18020-40</td><td>-</td></tr><tr><td>丝线 6.0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Axoclamp 2B</td><td>Molecular devices</td><td>已停产</td><td>细胞内放大器/新型号 Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>CapStar-100 呼气末 CO2 监测仪</td><td>CWE</td><td>11-10000</td><td>气体分析仪</td></tr><tr><td>Grass S-88</td><td>A-M Systems</td><td>已停产</td><td>恒流刺激器</td></tr><tr><td>带柔性探针的恒温毯系统</td><td>Harvard Apparatus</td><td>507222F</td><td>加热系统</td></tr><tr><td>ISO-DAM8A</td><td>WPI</td><td>74020</td><td>细胞外放大器</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>-</td><td>-</td><td>定制/替代 IVM/Scientifica</td></tr><tr><td>P-1000 微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>微电极拉制仪</td></tr><tr><td>SAR-830/AP 小动物呼吸机</td><td>CWE</td><td>12-02100</td><td>呼吸机</td></tr><tr><td>支撑架</td><td>-</td><td>-</td><td>定制/替代 实验室标准底座 51601/Stoelting</td></tr><tr><td>脊柱夹具</td><td>-</td><td>-</td><td>定制/替代 大鼠脊柱适配器 51695/Stoelting</td></tr><tr><td>TP-1 直流刺激器</td><td>WiNUE</td><td>-</td><td>经颅直流电刺激器（tsDCS stimulator）</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他材料&lt;/strong&gt;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>1B150-4 玻璃毛细管</td><td>WPI</td><td>1B150-4</td><td>用于微电极制备</td></tr><tr><td>脱脂棉</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>柔性管路</td><td>-</td><td>-</td><td>用于连接呼吸机和 CO2 分析仪</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>WPI</td><td>MF28G67-5</td><td>用于填充微移液管</td></tr><tr><td>银丝</td><td>-</td><td>-</td><td>用于神经电极</td></tr></tbody></table>

在体条件下对经脊髓直流电刺激期间类型明确的大鼠脊髓运动神经元进行细胞内记录

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

在体内的脊髓运动神经元细胞内记录为确定完整脊髓网络中细胞的电生理特性提供了“金标准”，相较于传统的体外或细胞外记录技术具有显著优势。在体细胞内记录的一个优点是，该方法可在神经系统完全成熟的成年动物上进行，因此许多观察到的生理机制可转化为实际应用。在本方法学论文中，我们描述了该技术与外源施加的恒定电流刺激相结合的操作流程，后者可模拟脊髓神经元网络内部发生的极化过程。经脊髓直流电刺激（tsDCS）是一种新兴的神经调节干预手段， increasingly 被用于各种神经损伤后的康复治疗以及运动领域。目前，tsDCS 对神经系统的影响仍知之甚少，其作用背后的生理机制在很大程度上尚不明确。将 tsDCS 与细胞内记录同步应用，使我们能够直接观察运动神经元膜特性以及节律性放电特征在脊髓神经元网络极化过程中的变化，这对于理解 tsDCS 的作用机制至关重要。此外，当本方案包含对运动神经元所支配肌肉及其功能（屈肌 versus 伸肌）以及生理类型（快型 versus 慢型）的鉴定时，便可选择性地研究 tsDCS 对脊髓回路中已鉴定组分的影响，而这些组分似乎受到极化的不同影响。本文所述操作流程重点在于细胞内记录与刺激的手术准备，强调为实现准备稳定性与结果可重复性所必需的各个步骤。文中还讨论了阳极或阴极 tsDCS 应用方法的具体细节，同时关注实际操作与安全性问题。

在确保细胞穿刺条件稳定的前提下，可通过细胞内记录计算动作电位的多个参数及细胞膜特性。图1A展示了一个由细胞内刺激诱发的典型顺向动作电位，该电位符合所有数据纳入标准（静息膜电位至少为-50 mV，峰电位幅度高于50 mV，并具有正向超射）。可测量的动作电位参数包括峰电位幅度、后超极化幅度以及后超极化半衰时间（AHP-HDT）。在大鼠运动神经元中，AHP-HDT的数值可作为区分快型与慢型运动神经元的可靠标准（慢型运动神经元AHP-HDT > 20 ms，快型运动神经元AHP-HDT < 20 ms）17。图1B显示了细胞对持续100 ms、强度为1 nA的超极化电流脉冲的反应，可通过电压偏转计算出运动神经元的峰值和平台期输入电阻（IR）。图1C展示了一个阈下动作电位的扩展电压轨迹，其中动作电位的电压阈值清晰标出，代表了电压门控钠通道被激活以启动动作电位时的膜去极化水平。在经颅静态直流电刺激（tsDCS）应用期间及之后...

本方案描述了在同时进行经脊髓直流电刺激的条件下，对大鼠腰段运动神经元进行体内细胞内记录的方法。该方法使我们能够在脊髓阳极或阴极极化之前、期间和之后，测量运动神经元的膜特性并记录其节律性放电活动。

体内脊髓运动神经元的细胞内记录为确定这些细胞的电生理特性提供了“金标准”...

本方案通过脊髓运动神经元的细胞内记录，直接研究跨脊髓直流电刺激对脊髓网络功能的影响。该技术的主要优势在于，可在完全成熟的神经系统上进行细胞内记录，从而促进将实验观察结果转化为实际应用。在确认足底反射消失后，使用解剖显微镜和21号刀片，对一只已麻醉的6月龄雄性Wistar大鼠从胸骨至下巴做纵向皮肤切口。用钝性分离法暴露右侧颈静脉，并在无分支的静脉段下方放置两根4-0结扎线。在静脉节段的近端打一个松结，再在该节段的远端打一个松结。将静脉近心端用夹子夹闭，并结扎静脉的远端。使用虹膜剪在夹子与远端结扎处之间做一切口。然后抓住一段静脉瓣膜，将预先填充好的导管插入至静脉被夹子阻塞的位置。接着移除夹子，并将导管向静脉内推进数毫米。进行气管插管时，使用钝头镊子分离覆盖在胸骨舌骨肌上的两个颌下腺。沿中线分离胸骨舌骨肌，暴露气管。在气管下方放置三根4-0缝线，于气管插管插入点下方打两个结，上方打一个结。然后将气管插管插入第三气管软骨下方的气管中，并用预先准备好的结扎线固定插管。为分离后肢神经，使用21号刀片从左侧后肢的跟腱至髋部沿后侧做纵向切口。使用剪刀在膝关节后方的腘窝前部与后部之间做一切口。剪断股二头肌的两个头，以暴露坐骨神经。分离腓肠肌的外侧头与内侧头，以暴露胫神经及其分支。然后使用55号镊子，仔细分离腓肠肌内侧和腓肠肌外侧以及比目鱼肌的神经，将其与周围组织分开，同时保持神经与各自肌肉的连接。进行椎板切除术时，使用21号刀片从骶骨向上沿纵轴切至胸椎。确定具有肋骨附着的最尾端胸椎 Th13 节段。然后使用精细咬骨钳去除 Th13 至 L2 椎骨的棘突和椎板，以暴露脊髓的腰段。为固定脊柱，将大鼠置于特制框架内，下方垫有连接闭环加热系统的 37 °C 加热垫。利用皮瓣在暴露的脊髓上形成一个深池。将金属夹置于胸12（Th12）横突下方和腰3（L3）棘突处，并用37摄氏度的矿物油充满该池。利用皮瓣在暴露的胫神经、内侧腓肠肌神经、外侧腓肠肌神经以及比目鱼肌神经上方形成一层较深的矿物油池。将神经置于双极银丝刺激电极上，然后使用各自独立的刺激通道将电极连接至方波脉冲刺激器。对于表面电极放置，在解剖显微镜下，将银球电极置于暴露的脊髓左侧尾侧。将参考电极插入背部肌肉中，并将两个电极连接至差分直流放大器。使用恒流刺激器以持续时间为0.1毫秒、频率为3赫兹的方波脉冲刺激内侧腓肠肌、外侧腓肠肌和比目鱼肌神经，观察传入冲动群。模拟结束后，将表面电极向头端移动，并重复刺激，以确定每条神经动作电位幅度最高的脊髓节段。确定最大动作电位的位置后，静脉注射神经肌肉阻滞剂使大鼠瘫痪。同时，由助手将气管插管连接至与啮齿类动物兼容的容量呼吸机。使用55号镊子轻轻提起硬脊膜，从L5节段开始向尾侧切开硬脊膜组织，再向头侧延伸至L4节段，以打开硬脊膜和软脊膜。然后使用一对超细5SF镊子，在血管之间的背柱区域的软脊膜上制作一个小的开口，该位置应精确对应来自腓肠内侧肌、腓肠外侧肌和比目鱼肌神经的最大传入电位波的水平。放置经脊髓直流电刺激电极时，将浸有生理盐水的海绵置于第12胸椎（Th12）的背侧，然后使用精细操作将带有活性经脊髓直流电刺激电极的海绵压紧。随后将定制的汇集微电极安装到微操作器上，使其能够进行一至两微米的步进运动，并完成立体定位校准。以15至20度的内侧-外侧角度，将微量移液管尖端插入软脑膜的选定区域。为记录运动神经元的膜电位及放电特性，需在细胞内放大器的桥式模式下，刺激相应的神经分支，根据逆向动作电位的“全或无”特征来鉴定运动神经元。在细胞内放大器的断续电流钳模式下，设置电流切换速率为4至8千赫兹，采用持续时间为0.5毫秒的细胞内去极化电流脉冲，以在运动神经元中诱发正向动作电位。为计算细胞输入电阻，使用40个短暂的100毫秒超极化1纳安电流脉冲刺激运动神经元。为确定真实基值，即引发单个动作电位所需的去极化电流的最小幅度，使用50毫秒方波脉冲以递增的幅度刺激运动神经元。然后注入500毫秒去极化电流方波脉冲，并逐步增加其幅度。以0.1至2纳安为步长，诱发运动神经元的节律性放电。对于脊髓经向直流电刺激，通过脊髓经向施加直流电开始极化程序，同时保持运动神经元的稳定穿刺。此处显示的是由细胞内刺激诱发的典型正交动作电位，符合所有数据纳入标准。在此分析中，细胞对持续100毫秒、强度为1纳安的超极化电流脉冲产生反应。由此可观察到运动神经元的电压偏转，并据此确定其峰值和平台期的输入电阻。这一实际基本动作电位的扩展电压轨迹，显示出清晰标记的动作电位电压阈值。指示电压门控钠通道被激活以启动动作电位时的膜去极化水平。这些图展示了两个运动神经元在细胞内施加500毫秒方波去极化电流刺激后记录的胞内电压变化轨迹。脊髓经颅直流电刺激应用前、应用期间及应用后的变化。研究发现，阳极脊髓经颅直流电刺激可提高运动神经元兴奋性，并增加节律性放电频率；而阴极脊髓经颅直流电刺激则倾向于抑制神经元放电。此外，两种类型的经脊髓直流电刺激的效果均超过了极化期。如果由于细胞穿透不完全而导致数据纳入标准受到损害，则可能获得不准确的数据。未能补偿微电极的电阻和电容，或脊髓不稳定，均可能导致此类问题。在解剖过程中必须确保脊髓不受任何损伤，因为损伤可能导致脊髓休克，从而使后续记录无法进行。可采集组织样本以进行进一步的组织学或免疫细胞化学分析。例如，可通过检测c-fos表达水平来间接反映神经元活性。

in-vivo-intracellular-recording-type-identified-rat-spinal

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在跨脊柱直流刺激期间类型识别大鼠脊柱腺瘤的 Vivo 细胞内记录

该新方法可同时记录单个成年小鼠运动神经元的细胞内电活动，并测量其肌纤维产生的力量。在正常和基因修饰动物中联合研究运动单位的电学与机械特性，是神经肌肉系统研究领域的一项突破。...

同时记录成年小鼠腰段运动神经元的细胞内电活动及其运动单元产生的力 体内

本视频演示了使用尖端精细的玻璃微电极和专用设备记录单个脑神经元电活动信号的方法。将微电极小心插入大鼠脑内，并施加轻微震动以穿入神经元，从而记录神经元内部的电活动信号。...

单个神经元细胞内信号的活体记录

本视频介绍了在经脊髓直流电刺激下对大鼠运动神经元进行的体内细胞内记录。该方案描述了如何在脊髓阳极或阴极极化前、期间和之后，测量运动神经元的膜特性并记录其节律性放电活动。...

大鼠脊髓运动神经元的经脊髓直流电刺激

本视频演示了通过电刺激大鼠尺神经、调节电极以获得最佳信号，并逐步增加刺激强度以评估神经功能，来记录复合肌肉动作电位（CMAP）的操作流程。该方法可实现对神经传导功能的定量评估。 体内...

在大鼠体内测量复合肌肉动作电位

本视频展示了大鼠C纤维神经传导的单纤维记录。对一只麻醉的大鼠进行切口以暴露坐骨神经，该神经为下肢提供感觉和运动支配。随后暴露单个C纤维。通过植入足部的刺激电极施加电刺激，并从单根神经纤维记录反应。...

在体大鼠坐骨神经C纤维单纤维记录

GABA能突触前抑制是脊髓中一种强大的抑制机制，在脊髓神经网络对运动和感觉信号的整合中具有重要作用。可通过记录背根电位（DRP）来测量初级传入纤维去极化的基础过程。本文介绍了一种在小鼠中进行体内DRP记录的方法。...

通过背根电位记录法测量小鼠脊髓初级传入抑制 在体 内

我们展示了如何制备幼鼠脊髓的斜切片。该制备方法可用于刺激腹根。...

斜向脊髓切片的制备用于腹根刺激

单纤维记录是一种适用于中枢和周围神经系统的有效电生理技术。结合带有附着坐骨神经的完整背根神经节制备，可检测传导阻滞的机制。这两种方案均有助于加深对周围神经系统与疼痛关系的理解。...

利用体内单纤维记录法及附着坐骨神经的完整背根神经节研究传导阻滞的机制

该方法可用于记录大鼠腓肠肌内三种运动单位的单收缩和强直收缩力以及动作电位。通过电刺激轴突可实现单个运动单位的功能性分离。...

大鼠腓肠肌内侧头单个运动单元的功能性分离

本方案描述了一种利用膜片钳技术以高时空分辨率研究运动神经元对脊髓刺激（SCS）电反应的方法，该方法可帮助研究人员同时提高分离脊髓和维持细胞活性的技术水平。...

的 离体 脊髓刺激期间运动神经元全细胞膜片钳记录用脊髓切片制备

我们介绍了一种同时记录脊髓多通道细胞外电活动和心功能，并分析与心搏同步的脊髓背角神经元的方法。该方法为研究针刺诱导胸腔内脏功能变化背后的脊髓机制提供了一个时间同步的研究框架。...

研究躯体刺激对大鼠脊髓背角心脏锁定神经元反应的编码特征

学习在体细胞内记录技术，研究跨脊柱直流刺激对大鼠腰段运动神经元膜特性及节律性放电模式的影响。该方法为神经康复应用提供重要实验基础。

在体条件下对经脊髓直流电刺激期间类型明确的大鼠脊髓运动神经元进行细胞内记录

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