改良的UPLC-UV法用于测定莴苣品种（Lactuca sativa L.）及作物野生近缘种（Lactuca spp.）中维生素C的含量

维生素C是衡量水果和蔬菜营养价值的重要指标。我们需要一种简便且可靠的定量方法，尤其是在生菜中——这是全球消费量最大的叶类蔬菜。该方法能够防止维生素C降解，并通过其准确性和灵敏度，实现对抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的高效提取以及快速、可靠的定量分析。

该方法可应用于食品技术领域以制作营养成分标签，在医学领域用于研究食物对健康的影响，以及在植物育种中提高不同物种的维生素C含量。本次实验操作由我实验室的两名分析员何塞·安赫尔·阿拉纽埃洛（Jose Angel Aranjuelo）和阿拉兰扎·卡斯特利亚诺斯（Arantzazu Castellanos）与伊内斯·梅迪纳·洛萨诺（Ines Medina Lozano）共同演示。准备植物样品时，需采集每株植物至少一片外层叶和一片内层叶，并立即用液氮速冻叶片，随后置于–80 °C条件下保存。

为了冻干冷冻的植物样品，将未加盖的样品管放置在冷冻干燥机冻干室内的托盘上，并按照指示设置冷冻干燥机程序。保持冷凝器温度为-80.2 °C，真空度恒定在112。当样品完全干燥后，在20 mL聚丙烯管中向冻干样品加入直径为10 mm的不锈钢研磨珠。并在适当的时间和强度下使用多管涡旋仪将样品研磨成细粉。

配制抗坏血酸标准储备液及稀释溶液时，使用精密天平准确称取10毫克抗坏血酸标准品，加入90毫升流动相。用磁力搅拌器溶解样品，再用容量瓶准确定容至100毫升，得到最终溶液。

根据需要添加额外的超纯水（用甲酸调节至 pH 2）。然后从储备液中配制五个稀释浓度，以获得标准曲线。在低光照强度下操作，向一个 15 毫升聚丙烯离心管中加入 50 毫克冻干研磨样品和 5 毫升提取溶剂，涡旋混合溶液 5 秒。

将样品在2000转/分钟的摇床中振荡10分钟后，转移至超声波水浴中，在室温下超声处理10分钟，随后通过离心收集样品。然后将上清液经0.22微米再生纤维素滤膜过滤，收集至5毫升棕色小瓶中，以提取提取液一中的抗坏血酸和脱氢抗坏血酸。为测定叶片样品中抗坏血酸浓度而制备稀释液时，取200微升提取液一与800微升超纯水加入2毫升棕色液相色谱小瓶中，并用聚四氟乙烯/硅胶塞密封小瓶。

为提取总抗坏血酸，将200微升提取液一转移至一个2毫升棕色液相色谱小瓶中，并向小瓶中加入200微升还原溶液。用瓶塞密封小瓶，涡旋混合溶液5秒。在室温下避光孵育30分钟后，加入200微升0.4摩尔硫酸以终止反应，并将抗坏血酸稳定在酸性pH条件下。

为测定样品中总抗坏血酸浓度，需进行稀释：向总抗坏血酸提取液二中加入 400 µL 超纯水，用塞子盖紧小瓶。在开始实验前至少一小时，确认所有工作溶液均已加入超高效液相色谱（UPLC）系统，并开启三组 UPLC 模块。

内部校准过程完成后，打开软件并加载仪器程序。软件加载完毕后，点击四元溶剂管理器，右键单击以选择启动控制台，进入超高效液相色谱（UPLC）管理控制台。点击系统、控制和启动，进入UPLC仪器的准备与稳定化步骤，然后点击溶剂冲洗、QSM，选中A、B、C、D、密封冲洗，并设置冲洗时间大于五分钟，以对所有UPLC管路进行至少五分钟的排空冲洗。

点击SM，检查清洗溶剂时间是否超过45秒。检查吹扫溶剂，并执行35个循环以吹扫和清洁进样器。为使超高效液相色谱系统达到方法设定条件，请勾选“平衡至方法”和QSM，并将流速设置为0.3毫升每分钟。

将溶剂A调整为2%，溶剂B调整为0%，溶剂C调整为98%，溶剂D调整为0%。保持在平衡至方法和SM状态，将样品温度设为5摄氏度，柱温设为30摄氏度。仍处于平衡至方法和其他状态时，选择开启光源，然后点击开始。让设备稳定至少一小时。

为验证系统稳定性，点击启动控制台系统和QSM，选择QSM系统压力，仅检查色谱柱内的压力。若压力变化无明显趋势，且压力差值小于每平方英寸10磅，则在快速启动界面中，用待分析的标准品和样品名称填写矩阵。为确定标准品中抗坏血酸的浓度，按照表格所示顺序，从最稀释到最浓缩的溶液，分别取五微升（5 µL）注入UPLC仪器，并进行色谱分析。

为测定叶片样品中的抗坏血酸和总抗坏血酸浓度，分别向超高效液相色谱仪（UPLC）中注入五微升的稀释提取液一和提取液二，进行色谱分析。在软件中，依次点击 Quickstart、Browse Project、Channels、标准品或样品名称以及 PDA channel one，在 245 纳米（带宽 1.2 纳米）处，计算抗坏血酸和总抗坏血酸浓度。为打开标准品和样品的色谱图，点击色谱图的起始点并拖动至终点，以对标准品和样品中的相应色谱峰进行积分。

然后利用抗坏血酸标准溶液的数据绘制校准曲线，以表示色谱法测定的吸光度值，并通过内插法计算样品的吸光度值，根据公式得出抗坏血酸和总抗坏血酸的浓度。在莴苣基质中进行维生素C的定量，需要建立一种色谱分析方法，以确保获得可靠的结果。此处可观察到一个由未优化的实验方案所得的色谱图，其中显示了抗坏血酸峰以及一个未识别的次要肩峰。

然而，在优化提取和色谱条件后，可以获得无未知化合物干扰的清晰抗坏血酸峰。此外，使用超高效液相色谱（UPLC）紫外检测设备替代高效液相色谱（HPLC）紫外检测设备，可缩短保留时间和运行时间。抗坏血酸峰中的干扰物会因色谱过程中分离不充分，导致维生素C含量被低估。

由于重叠峰的面积是通过两峰之间最深点处的垂直切分进行积分的。此外，使用未优化的实验方案会使得无法从结果中得出任何有用的结论，因为所有样品在维生素C的任一形态下似乎都具有相似的含量。

相比之下，采用优化后的方案可检测出不同类型样品之间的统计学显著差异。务必采集多个样品，正确保存样品，尽量减少样品与氧化剂的接触，并对维生素C的两种形式均进行定量分析。总维生素C含量不仅可在任何植物物种中定量，还可用于任何水果、蔬菜甚至加工食品的检测，仅需对技术方法进行少量修改即可。