改进的 UPLC-UV 方法，用于在莱图斯品种（Lactuca sativa L.）和作物野生亲亲（Lactuca spp.） 中对维生素 C 进行定量化
June 30th, 2020
我们提出了一种快速可靠的方法来量化维生素C在 Lactuca spp.使用 UPLC-UV，有可能转移到其他植物。关键步骤是样品制备和维生素C提取在稳定条件下，减少脱氢抗坏血酸抗坏血酸和优化色谱过程。
维生素C是水果和蔬菜营养价值的指标。我们需要一种简单可靠的方法来量化它，特别是在生菜，全世界消费最多的叶类蔬菜。这种方法可防止维生素C降解，并提供了增强的萃取和快速，可靠的定量的抗坏血酸和脱氢皮质酸，由于其准确性和敏感性。
该方法可用于食品技术，创造营养事实标签，在医学上研究食品对健康的影响，在植物育种中，增加不同物种的维生素C含量。与伊内斯·梅迪纳·洛扎诺一起演示手术的将是何塞·安赫尔·阿兰朱埃洛和阿兰扎祖·卡斯特拉诺斯，两位来自我实验室的分析师。要准备植物样品，每种植物至少收获一片外叶和一片内叶，并立即将叶子冷冻在液氮中，然后放入零下80摄氏度的储存中。
要使冷冻植物样品冻干，请将未封盖的样品管放在冻干剂冷冻干燥器的托盘上，并如所示对冻干剂进行编程。将冷凝器温度保持在零下 80.2 摄氏度，真空常数在 112，当材料完全干燥时，在 20 毫升聚丙烯管中，将直径 10 毫米的不锈钢球加入到冻干样品中。并使用多管涡流器，在适当的时间和强度，磨成细尘样品。
要准备抗坏血酸标准库存和稀释溶液，在精度平衡上精确称重 10 毫克抗坏血酸标准。并在90毫升的移动相到样品。使用磁力搅拌器溶解样品，并使用体积烧瓶精确测量 100 毫升的溶液。
添加额外的超纯水，必要时在pH2下用甲酸酸酸化。然后准备从库存中的五个稀释，以获得校准曲线。在低光照强度下工作，将 50 毫克冻干地面样品和 5 毫升萃取溶剂加入 15 毫升聚丙烯离心管中，并旋转溶液 5 秒钟。
在轨道摇床上以每分钟2000转的速度摇动样品10分钟后，将管子转移到超声波浴池10分钟后，在室温下通过离心收集样品。然后通过0.22微米再生纤维素过滤器将上清液应变成5毫升琥珀小瓶，提取提取物中的抗坏血酸和去氢性抗坏血酸。为了准备稀释剂以确定叶样品中的抗坏血酸浓度，将200微升提取物一和800微升超纯水加入两毫升琥珀液相色谱小瓶中，然后用PTFE/硅胶塞关闭小瓶。
对于总抗坏血酸萃取，将萃取的200微升一个，转移到两毫升琥珀液色谱小瓶中，并在小瓶中加入200微升的还原溶液。用插头合上小瓶，将溶液旋涡五秒钟。在室温下孵育30分钟后，在不受光线影响下，使用200微升0.4摩尔硫酸，停止反应，稳定抗坏血酸，达到酸性pH。
为了准备稀释剂以确定样品中抗坏血酸的总浓度，加入400微升的超纯水，加入总抗坏血酸提取物二。用插头合上小瓶。在开始实验前至少一小时，确认所有工作解决方案已加载到 UPLC 系统中并打开三个 UPLC 模块。
内部校准过程完成后，打开软件并加载工具程序。加载软件后，单击第四纪溶剂管理器并单击鼠标右键选择启动控制台，以访问 UPLC 管理控制台。单击"系统、控制和启动"，继续准备和稳定 UPLC 仪器，然后单击 Prime 溶剂、QSM、检查 A、B、C、D、密封洗涤和 Prime 持续时间（大于五分钟）以清除所有 UPLC 管路，至少五分钟。
单击 SM，检查超过 45 秒的洗涤溶剂。检查清除溶剂，并检查 35 个循环以清除和清洁喷油器。要将 UPLC 与方法条件进行平衡，请选中"平衡"到"方法"和"QSM"，然后将流量设置为每分钟 0.3 毫升。
溶剂 A 至 2%溶剂 B 至 0%溶剂 C 98%和溶剂 D 至 0%仍以均衡度为方法与 SM，将样品设置为 5 摄氏度，将柱设置为 30 摄氏度。仍在"与方法和其他"的"均衡"中，选择"灯打开"，然后单击"开始"。让设备稳定至少一小时。
要验证稳定性，请单击"启动控制台系统和 QSM"并选择 QSM 系统压力，仅检查列中的压力。如果压力变化中没有可识别的趋势，并且增量值小于每平方英寸压力 10 磅，则在快速启动屏幕中，在矩阵中填充要分析的标准和样本的名称。为了确定标准中的抗坏血酸浓度，将每稀释物的五微升注入 UPLC 仪器，并进行色谱，从最稀释到表中所示最浓缩的溶液。
为了确定叶样品中的抗坏血酸和总抗坏血酸浓度，将稀释提取物一和二微升分别注入 UPLC 仪器进行色谱分析。要计算抗坏血酸和总抗坏血酸浓度，在软件中单击快速启动、浏览项目、通道、标准名称或样品名称和 PDA 通道一，245 纳米在 1.2 纳米。要打开标准和样本色谱图，请单击色谱的起点并将其拖动到终点，以在标准和样品中集成相应的峰值。
然后利用抗坏血酸标准稀释的数据，建立一个校准曲线，表示色谱确定的吸收度值，并插值样品的吸收度值，根据公式获得抗坏血酸和总抗坏血酸浓度。在Lactuca基质中，维生素C定量需要开发一种色谱方法，以确保可靠的结果。在这里，可以观察到由非优化协议呈现和抗坏血酸峰产生的色谱图，以及矿工肩部的不明成分。
然而，在改善了萃取和色谱条件后，可以实现一个无未知化合物干扰的抗坏血酸峰。此外，使用 UPLC 紫外线设备（而不是 HPLC 紫外线）可缩短保留和运行时间。抗坏血酸峰值的干扰，由于色谱过程中分离不足，一直导致维生素C含量低估。
由于重叠的峰值区域由垂直下降在它们之间的最深处集成。此外，使用非优化协议可防止从结果中提取任何有用的结论。由于所有的样品似乎具有类似的维生素C含量，其任何形式。
相比之下，使用优化的协议可以检测不同类型的样本之间的统计显著差异。一定要收集多个样本，正确保存样品，尽量减少样品接触氧化剂，并量化两种形式的维生素C。
概述
本研究提出了一种可靠的方法，用于定量分析乳苣属植物中的维生素C，使用UPLC-UV。该方法可以增强抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的提取和定量分析，使其适用于多个领域。
关键研究组成部分
科学领域
- 食品技术
- 植物生物学
- 营养科学
背景
- 维生素C对于水果和蔬菜的营养价值至关重要。
- 生菜是全球最常食用的叶菜之一。
- 可靠的定量分析方法对于营养标签和健康研究至关重要。
- 该方法可防止提取过程中维生素C的降解。
研究目的
- 开发一种快速可靠的维生素C定量分析方法。
- 优化抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的提取过程。
- 为食品技术和植物育种应用提供便利。
使用的方法
- 样品制备包括冷冻和植物样品的冻干。
- 准备抗坏血酸标准溶液用于校准。
- 使用UPLC-UV对样品进行色谱分析。
- 详细描述了提取和定量程序以确保准确性。
主要结果
- 该方法提供了更高的提取效率。
- 实现了维生素C的精确定量分析。
- 结果可应用于营养标签和健康研究。
- 该方法可适用于其他植物种类。
结论
- 所开发的方法快速、可靠且敏感。
- 它可以显著帮助营养分析和植物育种。
- 未来的应用可能扩展到各种食品技术领域。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of vitamin C in plant matrices is critical for early-stage discovery and validation of nutritional biomarkers in food and agricultural biotechnology pipelines. The optimized UPLC-UV protocol enables sensitive, reproducible measurement of both ascorbic acid and dehydroascorbic acid, supporting robust hypothesis testing and mechanistic de-risking in trait selection and nutritional profiling. This capability enhances predictive confidence for R&D teams prioritizing crop improvement and functional food development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of vitamin C forms for nutritional biomarker validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing ascorbic acid and dehydroascorbic acid contributions.
- Facilitates detection of statistically significant differences across plant genotypes.
- Improves confidence in trait selection for crop breeding programs.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible workflow for vitamin C quantification in diverse plant matrices.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput screening and comparative studies.
- Reduces assay variability by minimizing sample oxidation and optimizing chromatographic separation.
- Enables reliable evaluation of nutritional content in breeding and food technology pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nutritional biomarker measurement with translational research in plant-based health interventions.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of functional food candidates.
- Provides risk-adjusted data for advancing nutritional traits in crop development.
Pipeline & Workflow Integration
This UPLC-UV method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for nutritional biomarker validation and trait selection in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification for vitamin C biosynthesis and stability.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for quantitative comparison of plant lines.
- Analytics: Provides robust chromatographic readouts and calibration-based quantification for cross-sample analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment for functional food and crop improvement studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse plant species and processed food matrices with minimal modification.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in nutritional trait validation.
- Operational Value: Standardizes sample handling and quantification, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions in crop and food product pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of high-value nutritional traits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatographic analysis and sample preparation.
- Needs access to UPLC-UV instrumentation and analytical software for calibration and quantification.
- Demands strict sample handling protocols to prevent oxidation and degradation.
- Adaptable to various plant and food matrices with minor protocol adjustments.
- Potential limitations include sensitivity to sample preparation errors and chromatographic interferences.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:03
Plant Material Preparation
1:57
Ascorbic Acid (AA) Standard Preparation
2:34
AA and Dehydroascorbic Acid (DHAA) Extraction
3:40
DHAA Reduction for Total AA (TAA) Extraction
4:31
Ultra-High-Performance Liquid Chromatography-Ultraviolet Preparation
6:46
AA Determination
7:21
AA and DHAA Quantification
8:18
Results: Representative Vitamin C Quantification in Lactuca Species
9:44
Conclusion
