Name: 小鼠胚胎干细胞中神经祖细胞和神经元的分化与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学习使用悬滴法将小鼠胚胎干细胞分化为神经祖细胞和神经元，并通过RT-qPCR、免疫荧光和流式细胞术进行综合分析。该方法为研究早期外胚层发育提供了重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金（1R35GM133496-01）对 Z. Gao 的资助。我们感谢 Ryan Hobbs 博士在切片方面的协助。感谢&#160;宾夕法尼亚州立大学医学院的核心设施，包括基因组科学与生物信息学、高级光学显微镜&#160;显微成像和流式细胞术。我们还要感谢 Dr.&#160;Yuka Imamura&#160;感谢在RNA-seq分析方面提供的帮助。&#160;

1. 小鼠胚胎干细胞培养
<ol>
	<li>用 0.1% 明胶包被一个 10 cm 的组织培养处理板，并让明胶静置至少 15–30 分钟，然后吸除。</li>
	<li>在将小鼠胚胎干细胞（mESCs）接种至预热的 mESC 培养基前一日，接种经 γ 射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。（mESC 培养基为含 15% 胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、丙酮酸钠、LIF、PD0325901（PD）和 Chir99021（CH）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM））。</li>
	<li>在培养 E14 细胞前，让经 γ 射线照射的 MEFs 沉降并贴附于培养板表面。</li>
	<li>在 37 °C 水浴中快速解冻 E14 ESCs，并迅速将细胞转移至含有温热 mESC 培养基的 15 cm 圆锥形离心管中。在 200 × g 条件下离心 3 分钟以收集细胞，弃去上清液。</li>
	<li>用 10 mL mESC 培养基重悬细胞，并将细胞接种至先前已接种 γ 射线照射 MEFs 的培养板中。将细胞培养物置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育。</li>
	<li>传代培养时，吸除培养基，并用无菌 1× PBS 洗涤培养板。加入足量 0.05% 胰蛋白酶以覆盖培养板表面，在 37 °C 下孵育 3 分钟。</li>
	<li>用 mESC 培养基中和胰蛋白酶，并吹打形成单细胞悬液。在 200 × g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>使用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞，并将约 5.0 × 105 个细胞接种至一个 10 cm 培养板中。</li>
	<li>用 10 mL mESC 培养基重悬细胞，将细胞接种至明胶包被的组织培养板上，并按前述条件进行培养。 
	注意：建议每 2 天传代一次 mESCs，以防止细胞在克隆中发生分化。培养基中的酚红仅作为 pH 指示剂，根据细胞密度不同，可能在不到 2 天内变为黄色（更酸性），因此可能需要每天更换培养基。经 γ 射线照射的 MEFs 在经过数次传代后将逐渐死亡。</li>
</ol>
2. 胚状体、神经前体细胞及神经元分化
<ol>
	<li>执行前述的细胞传代培养方案，并对细胞进行计数（步骤 1.7–1.10）。</li>
	<li>悬滴法（第 0 天）
	<ol>
		<li>对于一个 10 cm 的细胞培养皿，准备约 2.5 × 104 个细胞，将其中 5.0 × 102 个细胞悬浮于 20 µL 分化培养基中（DMEM 加 15% FBS、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素和丙酮酸钠）。一个 10 cm 培养皿上大约可接种五十个含细胞的 20 µL 液滴。</li>
		<li>取适当数量的细胞，以 200 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用适量的分化培养基重悬细胞，使细胞密度为每 20 µL 含 5.0 × 102 个细胞（例如，将 2.5 × 104 个细胞重悬于 1 mL 分化培养基中）。</li>
		<li>使用微量移液器或重复移液器，将 20 µL 细胞悬液液滴加至组织培养皿的盖子上。确保液滴之间保持足够距离，以防止其融合。 
		注意：由于液滴是加在盖子上而非培养皿底部，因此可使用经组织培养处理的贴壁培养皿或悬浮培养皿。为更方便且无菌地操作，建议先将液滴接种在贴壁型组织培养皿的盖子上，随后按以下方法转移至悬浮培养皿中。</li>
		<li>在培养皿中加入 5–10 mL 的 1× PBS，然后小心地将盖子盖回培养皿上。将培养物置于 37 °C 培养箱中孵育。 
		注意：在培养皿中加入 PBS 是为了防止液滴干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第 2 天，使用微量移液器从盖子上收集液滴，并将其转移至含有 10 mL 分化培养基的 10 cm 细胞悬浮培养皿中。将培养物置于培养箱内的轨道摇床上，以低速振荡孵育。</li>
	<li>在第 4 天，为收获拟胚体（EBs），收集细胞，以 200 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。 
	注意：根据后续实验的要求，EBs 也可用 1× PBS 洗涤。</li>
	<li>为继续实验并诱导拟胚体分化为神经前体细胞（NPCs），准备含有 5 µM 视黄酸（RA）的分化培养基。</li>
	<li>通过以 100 × g 离心 3 分钟使 EBs 沉淀，或让 EBs 自然沉降，吸除旧培养基。向培养皿中加入 10 mL 含 5 µM RA 的分化培养基。</li>
	<li>在第 6 天，通过倾斜培养皿并如上所述用移液器吸出部分培养基，更换至少一半的培养基为含 5 µM RA 的新鲜培养基。 
	注意：建议在第 5 天和第 7 天也至少更换一半含 RA 的新鲜培养基。注意观察酚红指示剂颜色；若变为黄色，则最好更换全部培养基。</li>
	<li>在第 8 天，通过收集细胞、以 200 × g 离心 3 分钟并弃去上清液的方式收获神经前体细胞（NPCs）。 
	注意：根据后续实验的需要，NPCs 也可用 1× PBS 洗涤。如需保存，NPCs 可冷冻保存并在后续实验中再次解冻使用。若需继续培养，可使用 accutase 替代胰蛋白酶进行消化。</li>
	<li>为继续实验并将 NPCs 分化为神经元，先通过离心将 NPCs 收集至 15 mL 圆锥形离心管中，用胰蛋白酶解离，并在 37 °C 孵育 3 分钟。用移液器吹打 NPCs，确保所有 NPC 聚集体均被充分解离，然后用培养基中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>使用 40 μm 尼龙细胞筛过滤细胞，在接种前进行细胞计数，并以 1.5 × 105/cm2 的密度接种于 N2 培养基中（DMEM/F12 培养基 + 3 mg/mL 葡萄糖 + 3 mg/mL 富脂牛血清白蛋白（LBSA）+ 1:100 N2 补充剂 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL 青霉素/链霉素 + 1 mM L-谷氨酰胺），接种于经组织培养处理的培养皿中用于后续 PCR 和 Western blot 实验；或接种于组织培养板中用于免疫荧光实验。</li>
	<li>在第 9 天，用新鲜的 N2 培养基更换旧培养基。</li>
	<li>在第 10 天，将 N2 培养基更换为 N2/B27 培养基（50% DMEM/F12 和 50% 神经基础培养基，3 mg/mL LBA，1:200 N2 补充剂，1:100 B27 补充剂，50 U/mL 青霉素/链霉素，以及 1 mM L-谷氨酰胺）。</li>
	<li>在第 11–12 天，按以下步骤收获神经元：用 1× PBS 洗涤细胞，加入胰蛋白酶，在 37 °C 培养箱中孵育 3 分钟，随后用培养基中和胰蛋白酶，并以 200 × g 离心 3 分钟。</li>
</ol>
3. 小鼠胚胎干细胞及分化细胞的表征
<ol>
	<li>碱性磷酸酶（AP）检测
	<ol>
		<li>使用试剂盒评估碱性磷酸酶活性（参见材料表）。</li>
		<li>从培养板中移除培养基，并用1×PBS洗涤胚胎干细胞（ESCs）。</li>
		<li>向培养板中加入1 mL试剂盒提供的固定液（含甲醛和甲醇），室温孵育2–5分钟。 
		注意：在固定液中孵育时间过长可能影响AP活性。</li>
		<li>移除固定液，用1×PBS洗涤ESCs，并在培养板中保留少量PBS。 
		注意：保持ESCs在PBS中湿润，以避免影响AP活性。</li>
		<li>将A、B、C三种底物溶液按1:1:1比例混合配制AP反应液。先混合A和B溶液，室温孵育2分钟后，再加入C溶液。</li>
		<li>移除1×PBS，加入先前配制的AP反应液。</li>
		<li>用铝箔包裹培养板或在暗室中进行操作，避光孵育约15分钟。</li>
		<li>监测反应进程，当溶液显色明显时及时移除反应液，以避免非特异性染色。</li>
		<li>用1×PBS洗涤ESCs两次。</li>
		<li>通过加入1×PBS或封片剂覆盖ESCs，防止样本干燥。 
		注意：AP表达将呈现红色或紫色染色。培养板可储存于4 °C冰箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RT-qPCR
	<ol>
		<li>分别按照步骤1.6–1.7和2.4收集ESCs、EBs和NPCs在不同阶段的细胞。</li>
		<li>使用RNA、DNA和蛋白质提取液提取RNA（参见材料表）。</li>
		<li>使用逆转录试剂盒（参见材料表）合成cDNA，并遵循制造商说明书操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定与包埋
	<ol>
		<li>按照前述方法（步骤2.6）收集EBs和NPCs，并用含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS溶液在室温下固定30分钟。</li>
		<li>移除PFA溶液，用1×PBS洗涤样本5分钟。</li>
		<li>将样本置于1×PBS及10%、20%、30%蔗糖溶液的梯度中，在25‒28 °C条件下孵育，每步30分钟后转移至下一溶液。 
		注意：样本可在4 °C条件下储存于30%蔗糖溶液中，待后续包埋步骤使用。</li>
		<li>用蔗糖溶液润湿移液枪头，将样本（避免堆叠）置于冷冻模具中央，并吸除多余液体。 
		注意：也可使用滤纸去除多余溶液。用蔗糖溶液润湿枪头可防止EBs和NPCs粘附在枪头内壁。</li>
		<li>小心加入最佳切割温度（OCT）包埋剂至模具中，避免重悬样本，并用移液枪去除气泡。</li>
		<li>将模具置于低速实验室混合器上，轻柔振荡15分钟，有助于若在OCT中发生重悬的EBs和NPCs沉降至底部。</li>
		<li>将模具置于液氮或干冰上快速冷冻样本。 
		注意：样本可在-70 °C冰箱中储存，待后续步骤使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冷冻切片
	<ol>
		<li>在将样本转移至仪器前，将冷冻切片机预冷至-20至-18 °C。</li>
		<li>将冻结的OCT包埋块从模具中取出，用少量OCT包埋剂粘附于持样器表面并固定。&#160;</li>
		<li>调整OCT包埋块方向，使EBs和NPCs尽可能靠近刀片，以确保切片过程中不丢失样本。</li>
		<li>小心切下10 μm厚度的切片，并密切注意含有样本的切片部分。</li>
		<li>迅速将含有样本的OCT切片转移至组织包埋载玻片上，室温下空气干燥1小时。 
		注意：样本可于-70 °C储存，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光（IF）
	<ol>
		<li>在室温下，用含10%正常驴血清和0.1% Triton X-100的1×PBS溶液封闭OCT切片或含神经元的培养腔室，孵育1小时。</li>
		<li>在含5%正常驴血清和0.05% Triton X-100的1×PBS溶液中，加入一抗稀释液，4 °C孵育过夜。</li>
		<li>用含0.1% Triton X-100的1×PBS溶液洗涤样本三次，每次5分钟。</li>
		<li>在含5%正常驴血清和0.05% Triton X-100的1×PBS溶液中，加入二抗稀释液，室温孵育1小时。</li>
		<li>用含0.1% Triton X-100的1×PBS溶液洗涤样本三次，每次5分钟，随后在1 μg/mL DAPI中孵育。</li>
		<li>用封片剂和盖玻片封片，并使其干燥。</li>
		<li>在荧光显微镜下观察样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA-seq分析
	<ol>
		<li>在不同阶段收集细胞，并进行RNA提取（参见步骤3.2）。</li>
		<li>根据Wang等8所述方案，构建cDNA文库，进行深度测序和数据分析。</li>
		<li>使用R软件包clusterProfiler进行基因本体（GO）分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术
	<ol>
		<li>按照步骤1.6–1.7收集ESCs，并重悬于培养基中；按照步骤2.4收集EBs和NPCs，并重悬于培养基中。</li>
		<li>使用40 μm尼龙细胞筛网将细胞悬液过滤至新的15 mL离心管中。</li>
		<li>使用流式细胞仪检测样本的GFP信号（由机构核心设施完成）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kaufman, M. H., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).</li>
<li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Sugaya, K., Vaidya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapies+for+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Exosomes%2C+Stem+Cells+and+MicroRNA%3A+Aging%2C+Cancer+and+Age+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases.</a> Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).</li>
<li>Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+embryoid+body+formation+and+hematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+different+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems.</a> Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).</li>
<li>McKee, C., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in stem cell culture.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).</li>
<li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WDR68+is+essential+for+the+transcriptional+activation+of+the+PRC1-AUTS2+complex+and+neuronal+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).</li>
<li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).</li>
<li>Visan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+a+tool+to+assess+developmental+neurotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroToxicology%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro.</a> NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).</li>
<li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).</li>
<li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+So%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochemical So. 31, 45-49 (2003).</li>
<li>Park, Y. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%26+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro.</a> Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li>
<li>Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+leukemia+inhibitory+factor+for+establishing+and+maintaining+embryonic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice.</a> Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).</li>
<li>Onishi, K., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIF+signaling+in+stem+cells+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">LIF signaling in stem cells and development.</a> Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).</li>
<li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336, 688-690 (1988).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ghimire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+naive%2C+primed+and+ground+state+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells+originating+from+the+same+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+for+Forming+Embryoid+Body+from+Mouse+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).</li>
<li>Wang, X., Yang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+%28mES%29+cells+using+the+hanging+drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).</li>
<li>Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Retinoic+Acid+in+the+Differentiation+of+Embryonal+Carcinoma+and+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells.</a> Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).</li>
<li>Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox1+marks+an+activated+neural+stem%2Fprogenitor+cell+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus.</a> Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+Re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Bahmad, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akt%2FmTOR+pathway+in+cancer+stem%2Fprogenitor+cells+is+a+potential+therapeutic+target+for+glioblastoma+and+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma.</a> Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).</li>
<li>Bastiaens, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+a+MEMS-Based+3D+Cell+Culture+System+for+in+vitro+Neuro-Electrophysiological+Recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Mechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings.</a> Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).</li>
<li>Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer%3A+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+imaging+%28HCI%29+on+miniaturized+three-dimensional+%283D%29+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的实验方法已建立数十年，研究人员持续对以往的实验方案进行改进，或为不同目的开发新的方案7,10,11。我们采用一系列检测手段，全面分析小鼠胚胎干细胞向神经元分化各阶段的效率与进程，该方法也可用于分析小鼠或人胚胎干细胞向其他谱系的分化。此外，我们的方法已被证明是体外评估特定基因或信号通路对神经元分化影响的有效工具8。
通过我们的方法，经视黄酸（RA）处理的多能性未分化ESC可高效地定向分化为神经谱系，并进一步诱导生成神经元7。为了提高胚胎干细胞向神经细胞分化的成功率并降低异质性，保持胚胎干细胞处于未分化状态至关重要12。经γ射线照射或丝裂霉素C处理的非增殖性MEF可维持ESC的多能性，并为其生长提供支架支持<sup class="...

自从小鼠囊胚发育阶段的内细胞团首次分离出小鼠胚胎干细胞（mESC）以来1,2，mESC 已被广泛用作研究干细胞自我更新与分化能力的有力工具3。此外，研究 mESC 的分化过程有助于深入理解分子机制，从而提高基于干细胞治疗神经退行性疾病等疾病的疗效与安全性4。与动物模型相比，这种体外系统具有诸多优势，包括操作和评估简便、维持细胞系的成本远低于动物饲养，以及遗传操作相对容易。然而，分化细胞类型的效率和质量常常受到不同 mESC 细胞系以及分化方法的影响5,6。此外，传统评估分化效率的方法依赖于对特定标志基因的定性检测，缺乏足够的稳健性，因而难以全面捕捉基因表达的整体变化。
本研究旨在利用一系列检测方法对神经元分化进行系统性评估。通过针对特定标志物的传统体外分析结合RNA测序（RNA-seq），我们建立了一个平台，用于测量分化效率以及该过程中转录组的动态变化。基于先前建立的方案7，我们采用悬滴法生成拟胚体（embryoid bodies, EBs），随后使用超生理浓度的视黄酸（retinoic acid, RA）诱导生成神经前体细胞（neural progenitor cells, NPCs），再通过神经诱导培养基将NPCs进一步分化为神经元。为评估分化效率，除传统的RT-qPCR和免疫荧光（immunofluorescence, IF）检测外，我们还进行了RNA-seq和流式细胞术分析。这些检测手段为阶段性特异性分化的进程提供了全面的评估。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶 + 0.53 mM EDTA 1×</td><td>康宁</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 明胶</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>用去离子水配制</td></tr><tr><td>16% 甲醛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28908</td><td>用1X PBS稀释</td></tr><tr><td>40-&amp;mu;m细胞滤筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>抗体用于免疫荧光时按1:500稀释</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶染色试剂盒 II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD</td><td>657338</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 高灵敏度 DNA 试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>C298-500</td><td>Fisher Chemical</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>康宁</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EB缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>111000200</td><td>Pharmco</td><td>用去离子水稀释</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 测序系统</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR 分析级</td><td>用去离子水稀释</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>来自 MEF 上清液收集</td></tr><tr><td>m18srRNA 引物</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3&#039;&lt;br/&gt; 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸</td><td>康宁</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>mNanog 引物</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3&#039;&lt;br/&gt; 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'</td></tr><tr><td>mNes 引物</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3&#039;&lt;br/&gt; 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'</td></tr><tr><td>mNeuroD1 引物</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3&#039;&lt;br/&gt; 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'</td></tr><tr><td>mOct4 引物</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3&#039;&lt;br/&gt; 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'</td></tr><tr><td>mPax6 引物</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3&#039;&lt;br/&gt; 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'</td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin 一抗</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>抗体用于免疫荧光时按1:200稀释</td></tr><tr><td>神经基础培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>神经丝蛋白一抗</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq文库制备试剂盒</td><td>BioO Scientific</td><td>NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>康宁</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用去离子水配制</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>P217-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸二氢钾</td><td>0781-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BP358-10</td><td>Fisher Bioreagents</td><td></td></tr><tr><td>- 磷酸氢二钠七水合物</td><td>SX0715-1</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>随机六聚体引物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>在DMSO中配制</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>康宁</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>用1×PBS稀释</td></tr><tr><td>SuperScript III 逆转录酶</td><td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 化合物</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TriPure 提取试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Rapid</td><td>Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞及神经元的分化与鉴定

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

我们描述了将小鼠胚胎干细胞培养并分化为神经细胞系的逐步操作流程，随后通过一系列检测方法对已分化的细胞进行表征。采用E14小鼠胚胎干细胞，通过悬滴法形成拟胚体，随后使用视黄酸诱导其分化为神经前体细胞，最终进一步分化为神经元。定量&#160;逆转录&#160;聚合酶链式反应（RT-qPCR）和免疫荧光实验结果显示，在分化后第8天和第12天，神经前体细胞和神经元分别表达相应的标志物（神经前体细胞标志物为nestin，神经元标志物为neurofilament）。对携带Sox1启动子驱动GFP报告基因的E14细胞系进行流式细胞术分析表明，分化第8天约有60%的细胞呈GFP阳性，提示此阶段神经前体细胞已成功分化。最后，通过RNA-seq分析对全转录组的动态变化进行了系统性表征。这些方法可用于研究特定基因和信号通路在神经分化过程中调控细胞命运转变的作用。

作为本方法的示例，我们对E14细胞进行了拟胚体（EB）、神经前体细胞（NPC）和神经元分化的实验。E14细胞在γ射线照射的MEF细胞上培养（图1A），直至γ射线照射的MEF细胞群体被稀释殆尽。我们通过碱性磷酸酶（AP）染色（图1B）以及后续的RT-qPCR检测 Nanog 和 Oct4 标志物（见下文）来确认E14细胞的多能性。随后，将去除γ射线照射MEF后的E14细胞按照图2A所示方案诱导分化。简言之，将含有500个细胞的20 µL分化培养基液滴接种于培养皿盖内表面（详见方案第2节）。形成的拟胚体被收集后转移至新鲜分化培养基中悬浮培养。在分化第4天至第8天期间，向培养皿中加入5 μM的视黄酸（RA）以诱导生成神经前体细胞。分化的拟胚体呈圆形，且在分化过程中体积持续增大（图2B）。在第8天，收集NPC并用胰酶消化，将获得的单细胞悬液接种于含N2添加剂的DMEM/F1...

我们描述了利用悬滴法将小鼠胚胎干细胞在体外分化为神经元细胞的实验步骤。此外，我们通过RT-qPCR、免疫荧光、RNA测序和流式细胞术进行了全面的表型分析。

我们描述了将小鼠胚胎干细胞培养并分化为神经细胞系的逐步操作流程，随后进行一系列检测……

除了小鼠胚胎干细胞向神经元细胞分化的实验方案外，我们还展示了一系列可全面分析该分化过程的实验方法。这些技术与早期外胚层胚胎发育相关，为研究人员提供了分析神经元细胞分化的多种选择。在进行该操作时，必须从处于最佳状态的干细胞开始。因此，将EBs、MPCs和神经元培养在新鲜且最适的培养基中非常重要。本方案的可视化演示十分关键，因为其中包含可能影响其成功与有效性的细微步骤，尤其是分化部分。首先建立悬滴细胞培养。对于10厘米的细胞培养板，将细胞浓度调整为每20微升分化培养基中含有500个细胞。准备足够量的细胞悬液，以制备50个20微升的液滴。使用微量移液器或重复移液器将20微升的细胞悬液滴加到组织培养板的盖子上，注意保持液滴之间有足够的间距，以防止液滴相互融合。向培养板中加入5至10毫升PBS，小心盖上盖子。将培养物置于37摄氏度培养箱中孵育。两天后，收集盖子上的液滴，并将其转移至含有10毫升分化培养基的10厘米细胞悬浮培养板中，然后将培养板置于培养箱内的轨道摇床上，设置为低速摇动。再过两天后，以200 × g离心细胞3分钟，弃去上清液。为诱导类胚体分化为神经前体细胞，将细胞重悬于含5 µM视黄酸的分化培养基中。将培养板孵育2天，然后通过倾斜培养板并用移液器吸出的方式，更换至少一半的新鲜培养基。两天后，以200 × g离心3分钟收集细胞，并移除上清液。用含4% PFA的PBS在室温下固定拟胚体和神经前体细胞30分钟。随后移除PFA，并用PBS洗涤细胞5分钟。将细胞依次在 PBS 配制的 10%、20% 和 30% 蔗糖溶液中孵育，温度为 25 至 28 摄氏度，每次孵育持续 30 分钟或更长时间，直至细胞沉降至管底。用移液器将样品转移至 Cryomold 的中心位置，并吸出多余液体。小心地向模具中加入最佳切割温度包埋剂（OCT 溶液），避免重新悬浮样品，然后用移液器去除多余的气泡。将带有样本的模具置于实验室混合器上，以低速搅拌15分钟，使类胚体和神经前体细胞沉降至OCT溶液底部。随后将模具放入液氮中，快速冷冻样本。在室温下，用含10%正常驴血清和0.1%Triton X-100的PBS溶液对含有神经元的OCT切片或培养腔室进行封闭处理，持续1小时。然后将样品在含有5%正常驴血清和0.05%Triton X-100的PBS中稀释的一抗溶液中，于4°C孵育过夜。次日，用含0.1%Triton X-100的PBS洗涤样品三次，每次五分钟。随后在室温下，将样品与用含5%正常驴血清和0.05%Triton X-100的PBS稀释的二抗溶液孵育一小时。重复使用 Triton X-100 和 PBS 洗涤，然后将样品置于浓度为一微克每毫升的 DAPI 中孵育。用盖玻片和封片剂封片，待其干燥后，使用荧光显微镜观察成像。为进行神经元分化，将 E14 细胞培养在经γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞上，直至成纤维细胞群体稀释消失。通过碱性磷酸酶染色证实了E14细胞的多能性。分化后，胚胎小体呈圆形，并持续增大。至第10天，分化为神经元的神经前体细胞呈现细长的细胞形态。在第8天对神经前体细胞、在第12天对神经元进行了免疫荧光实验。神经前体细胞中观察到巢蛋白（nesting）染色阳性，神经元中观察到神经丝蛋白（neurofilament）染色阳性。对表达Sox1启动子驱动的GFP报告基因的小鼠胚胎干细胞系进行分化，并对胚胎干细胞和神经前体细胞进行流式细胞术分析。研究发现，在NPC阶段的总细胞中，有58.7%为GFP阳性，而在ESC阶段则无GFP阳性细胞。对E14胚胎干细胞、类胚体以及神经前体细胞进行了RNA测序实验。RNA测序热图中的基因根据其表达水平进行排序。对四个基因簇进行的基因本体分析表明，它们分别对应不同的细胞功能或通路。执行本方案时，拟胚体（EBS）应呈现为球形、颜色加深的细胞团块。为确保EBS以此形态生长，若培养基在第1天开始变黄，应及时更换培养基。对于MPC培养而言，采用相同的方法同样重要，因为EBs和MPCs均处于早期胚胎发育的关键阶段。还可对神经元分化不同阶段进行其他功能性基因组学检测，例如ChIPseek以及染色质构象捕获实验，以深入理解其背后的生物学过程。通过在神经元分化过程中整合化学与功能性基因组学检测手段，研究人员能够更清晰地阐明早期胚胎发育的分子机制。

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

小鼠胚胎干细胞中神经祖细胞和神经元的分化与表征

我们介绍一种基于小分子的方案，用于将小鼠胚胎干细胞分化为少突胶质前体细胞（OPCs）。该方案可在30天内高效地生成Olig2+NG2+的OPCs。我们还描述了一种生成“可放电”OPCs的方法，这类细胞能够产生动作电位。...

胚胎干细胞向少突胶质细胞前体的分化

我们开发了一种新方案以提高效率 体外...

小鼠胚胎干细胞高效分化为运动神经元

本视频展示了将人胚胎干细胞（hESCs）直接分化为神经前体细胞（NPCs）的方法，该过程无需使用饲养层细胞或任何中间步骤。通过选择性抑制骨形态发生蛋白（BMP）和转化生长因子-β（TGF-β）信号通路，可诱导hESCs分化为神经前体细胞（NPCs）。...

将人类胚胎干细胞分化为神经前体细胞

本视频演示了一种方法 体外 从小鼠胚胎干细胞（mESCs）生成神经前体细胞（NPCs）。将mESCs在悬浮培养中形成拟胚体（EBs），随后诱导其分化为NPCs 通过...

一种从小鼠胚胎干细胞生成神经前体细胞的技术

该视频展示了一种将神经前体细胞分化为神经元的细胞培养方法。通过在添加了生长因子的富含营养的培养基中孵育细胞，前体细胞成熟为具有发育良好的轴突和树突的神经元。一种稳定剂可确保细胞在整个分化过程中的存活率，并防止氧化损伤。...

神经前体细胞向神经元的分化

本方案详细描述了使用无血清单层培养法从胚胎干细胞诱导生成神经前体细胞的方法。这些前体细胞可用于分化为成熟的神经细胞类型，或用于研究神经特化过程，并可适用于多孔板形式的化合物筛选高通量扩增。...

小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养条件下的神经分化

我们介绍了一种利用小鼠胚胎干细胞生成二维或三维类胚体的技术。随后，我们阐述了如何通过视黄酸诱导类胚体细胞的神经分化，以及如何利用前体细胞标志物的免疫荧光染色和免疫印迹法分析其分化状态。...

二维和三维拟胚体中视黄酸诱导小鼠胚胎干细胞神经分化的分析

本方案描述了一种利用改良的拟胚体转单层法从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞及有丝分裂后中间神经元前体的方法。这些前体细胞可用于 体外...

小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

本文介绍一种从E13小鼠胚胎神经节隆起中分离神经干细胞的新型显微手术技术。...

小鼠胚胎神经干细胞的分离与培养

本文介绍了一种人类胚胎干细胞单细胞培养及其后续分化为神经前体细胞的实验方案。该方案操作简便、稳定可靠、可扩展性强，适用于药物筛选和再生医学应用。...

利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

本文建立了一种低成本且易于操作的方法，可实现胚胎干细胞向神经元的快速高效分化。该方法适用于在各实验室中推广应用，可为神经科学研究提供有力工具。...

小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

学习使用悬滴法将小鼠胚胎干细胞分化为神经祖细胞和神经元，并通过RT-qPCR、免疫荧光和流式细胞术进行综合分析。该方法为研究早期外胚层发育提供了重要工具。

小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞及神经元的分化与鉴定

探索更多视频