小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞及神经元的分化与鉴定

除了小鼠胚胎干细胞向神经元细胞分化的实验方案外，我们还展示了一系列可全面分析该分化过程的实验方法。这些技术与早期外胚层胚胎发育相关，为研究人员提供了分析神经元细胞分化的多种选择。在进行该操作时，必须从处于最佳状态的干细胞开始。

因此，将EBs、MPCs和神经元培养在新鲜且最适的培养基中非常重要。本方案的可视化演示十分关键，因为它包含了可能影响实验成功与效果的细微步骤，尤其是分化部分。首先建立悬滴细胞培养。

对于10厘米的细胞培养板，将细胞浓度调整为每20微升分化培养基中含有500个细胞。准备足够量的细胞悬液，以制备50个20微升的液滴。使用微量移液器或重复移液器，将20微升的细胞悬液液滴加入组织培养板的盖子上，注意保持液滴之间有足够的间距，以防止液滴相互融合。

向培养板中加入5至10毫升PBS，小心盖上盖子。将培养物置于37摄氏度培养箱中孵育。两天后，收集盖子上的液滴，并将其转移至含有10毫升分化培养基的10厘米细胞悬浮培养板中，然后将培养板置于培养箱内的轨道摇床上，设置为低速摇动。

再过两天后，以200 × g离心细胞3分钟，弃去上清液。为诱导类胚体分化为神经前体细胞，将细胞重悬于含有5 µM视黄酸的分化培养基中。将培养板孵育2天，然后通过倾斜培养板并用移液器吸出的方式，更换至少一半的新鲜培养基。

两天后，以200 × g离心3分钟收集细胞，并移除上清液。用含4% PFA的PBS在室温下固定拟胚体和神经前体细胞30分钟。随后去除PFA，并用PBS洗涤细胞5分钟。

将细胞依次在 PBS 配制的 10%、20% 和 30% 蔗糖溶液中孵育，温度为 25 至 28 摄氏度，每次孵育持续 30 分钟或更长时间，直至细胞沉降至管底。用移液器将样品转移至 Cryomold 的中央位置，并吸出多余液体。小心地向模具中加入最佳切割温度（OCT）包埋剂，避免重新悬浮样品，然后用移液器去除多余的气泡。

将带有样本的模具置于实验室混合器上，以低速搅拌15分钟，使类胚体和神经前体细胞沉降至OCT溶液底部。随后通过将模具放入液氮中快速冷冻样本。在室温下，用含10%正常驴血清和0.1%Triton X-100的PBS溶液对含有神经元的OCT切片或培养室进行封闭处理，持续1小时。

然后将样品在含有5%正常驴血清和0.05%Triton X-100的PBS中稀释的一抗溶液中，于4°C孵育过夜。次日，用含0.1%Triton X-100的PBS洗涤样品三次，每次五分钟。随后将样品在含有5%正常驴血清和0.05%Triton X-100的PBS中稀释的二抗溶液中室温孵育一小时。

重复使用 Triton X-100 和 PBS 洗涤，然后将样品在 1 微克/毫升 DAPI 中孵育。用盖玻片和封片剂封片，待其干燥后，使用荧光显微镜进行成像。为进行神经元分化，将 E14 细胞培养在经γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞上，直至成纤维细胞群体被稀释殆尽。

通过碱性磷酸酶染色证实了E14细胞的多能性。分化后，胚胎小体呈圆形，且大小持续增加。至第10天，分化为神经元的神经前体细胞呈现细长的细胞形态。

在第8天对神经前体细胞、在第12天对神经元进行了免疫荧光实验。神经前体细胞中观察到巢蛋白（nesting）染色阳性，神经元中观察到神经丝蛋白（neurofilament）染色阳性。对表达Sox1启动子驱动的GFP报告基因的小鼠胚胎干细胞系进行分化，并对胚胎干细胞和神经前体细胞进行流式细胞术分析。

研究发现，在NPC阶段的总细胞中，有58.7%为GFP阳性，而在ESC阶段则无GFP阳性细胞。对E14胚胎干细胞、类胚体以及神经前体细胞进行了RNA测序实验。RNA测序热图中的基因根据其表达水平进行排序。

对四个基因簇进行的基因本体分析表明，它们分别对应不同的细胞功能或通路。执行本方案时，拟胚体（EBS）应呈现为球形、颜色加深的细胞团块。为确保EBS正常生长，若培养基在第一天开始变为微黄色，应及时更换培养基。

对于MPC培养而言，相同的方法同样重要，因为EBs和MPCs均处于早期胚胎发育的关键阶段。可对神经元分化不同阶段进行其他功能性基因组学检测，例如ChIPseek和染色质构象捕获实验，以深入了解其潜在的生物学过程。通过在神经元分化过程中整合化学与功能性基因组学检测手段，研究人员能够更清晰地阐明早期胚胎发育的分子机制。