Name: 脊髓损伤后小鼠泌尿膀胱分子分析的单细胞分离方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 了解用于脊髓损伤小鼠膀胱单细胞分析的组织解离方法。该技术通过流式细胞术生成高活力单细胞悬液，准确反映细胞类型，适用于单细胞测序等下游研究。

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本工作获得了美国国立卫生研究院基金（R01 DK077195 资助 R.M.A.，R01 DK104641 资助 R.M.A. 和 D.R.B.）的支持。我们感谢哈佛医学院波士顿儿童医院血液学/肿瘤学部、儿科系以及丹娜—法伯癌症研究所的Stuart Orkin博士提供的宝贵意见。同时感谢Kyle Costa在小鼠术后护理方面的支持，以及玛丽·塔利亚恩蒂（Mary Taglienti）和哈比布拉·舒贾伊萨迪博士（Dr. Habiballah Shojaeisaadi）（杨石博士实验室，哈佛医学院波士顿儿童医院儿科系新生儿医学部）在技术协助和有益讨论方面提供的帮助。

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<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述的小鼠脊髓损伤模型提供了一种可重复的方法，通过破坏膀胱收缩与尿道外括约肌松弛之间的协调性，从而导致功能性膀胱出口梗阻。这种失协调继而引发膀胱壁的显著重塑，最早在损伤后2周即可观察到，表现为尿路上皮和逼尿肌层的扩张。在啮齿类动物中成功建立脊髓损伤模型的关键步骤包括：（i）在损伤后持续10至14天的脊髓休克期间，严格进行手动排尿；（ii）加强营养支持以减少体重下降；（iii）预防尿液灼伤风险，尤其是在实验周期超过反射性排尿恢复时间的情况下。该模型的局限性包括：小鼠在短暂血尿期间可能因血凝块导致尿道阻塞，此外，雄性小鼠在手术后可能发生逆行射精，继而因精液凝块引起尿道阻塞。
本文所述的组织解离方法强调了在实验损伤后考虑组织结构变化的重要性，例如脊髓损伤（SCI）后发生的显著组织重塑，可能会影响后续分析结果。随着单细胞分析技术的广泛应用，至关重要的是确保观察到的基因表达差异并非由解离过程本身引起的干扰所致，而应真实反映与疾病模型相关的潜在生物学变化。通过利用公开可用的表达数据，我们能够优化消化缓冲液的配方，在有效降解细胞外基质的同时最大程度地维持细胞活性。未来应用中还可考虑进一步改进，例如添加放线菌素D，以抑制对解离方案敏感的即刻早期基因的转录15。
在解离组织或转移已处于悬浮状态的细胞时，移液技术至关重要。为了减少剪切力对细胞造成的物理损伤，在细胞重悬过程中应轻柔、缓慢地进行移液操作。通常建议使用宽口移液器吸头。若使用标准吸头，则尤其需要注意轻柔地移取细胞悬液，以避免因剪切力而损伤细胞。本实验方案中不可避免地需要使用细胞筛网，但细胞浓度可能因此下降20%或更多，同时伴随100 µL或更多的体积损失。我们建议在过滤后测定细胞浓度，以确保细胞计数的准确性。
在流式细胞术中，FMO对照用于评估因发射峰重叠导致的信号溢出背景。它们并不能反映非特异性抗体结合或当某个通道中加入抗体时可能出现的背景染色。为了校正非特异性抗体结合，必须设置相应的同型对照；而对于背景染色，则需要设置阴性对照。综合使用这些对照，可确保对细胞群体的准确检测。

正常的膀胱功能受到干扰可能导致许多个体生活质量下降。为了更好地理解损伤或疾病如何破坏膀胱的正常功能，研究膀胱内细胞的正常生物学状态及其在实验干扰下的变化至关重要。然而迄今为止，定居于泌尿膀胱内的特定细胞群体及其在损伤情况下的变化尚未被充分表征。
单细胞分析方法（如流式细胞术或单细胞RNA测序（scRNA-seq））有望揭示膀胱内特定细胞类型的特征。然而，要使这些方法获得有意义的结果，必须以不影响细胞活性、基因表达以及所获取组织中代表性细胞群体比例的方式来消化组织。采用酶解法进行组织解离的方案可能因蛋白酶的非特异性活性而影响表面标志物的表达1，从而影响通过流式细胞术进行的细胞鉴定；而解离过程本身也可能诱导即早基因的表达，正如Van den Brink及其同事近期所述2。作者指出，尽管受解离影响的亚群比例较小，但由于即早基因的高表达水平，其可能在整体表达研究中产生强烈的污染信号。此外，解离方案的持续时间会影响那些已被证明为某些亚群特有基因的整体表达水平的检测结果。因此，若在生成单细胞数据集时未考虑解离方案的影响，则所观察到的基因表达变化可能源于解离方法本身，而非真实的生物学差异。这些发现提示，已发表的单细胞转录组学数据应谨慎解读，并且研究结果应通过独立的方法加以验证。
尽管剧烈且耗时较长的解离方法可能会改变细胞中的基因表达2，但有效的细胞分离对于准确表征存在的细胞类型至关重要。由于膀胱是一个包含多种细胞类型的复杂器官，某些细胞群体（如尿路上皮细胞或基质细胞）可能相对丰度较低，而其他细胞类型（如成纤维细胞）则存在于细胞外基质中，难以分离。如果膀胱经历了显著的结构重塑和纤维化（例如在脊髓损伤3,4或膀胱出口梗阻5,6中所观察到的情况），解离过程将变得更加困难。
本文介绍了一种优化的组织解离方法，用于脊髓损伤小鼠膀胱组织的下游单细胞分析。我们通过流式细胞术比较了四种酶消化方案在获得单细胞悬液、维持细胞活力以及保持细胞群体正常比例方面的能力。基于该分析，我们得出结论：最大限度减少细胞死亡、细胞聚集体、非细胞来源的核酸以及可能干扰下游分析的抑制物，是获得高质量数据的关键。

<table><tbody><tr><td>2.5 倍放大手术放大镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-0薇乔缝线，6.5毫米针，3/8圆</td><td>ETHICON</td><td>J546</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m细胞筛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>含0.5 mM EDTA的BPBS中的Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶过滤宽口移液器吸头（1000 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶过滤宽口移液器吸头（1000 &amp;micro;L</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 CD326（Ep-CAM），大鼠单克隆，IgG2a &amp;kappa;，亲和纯化</td><td>BioLegend</td><td>118213</td><td></td></tr><tr><td>BB515 大鼠抗小鼠 CD45，大鼠单克隆抗体，IgG2b &amp;kappa;，克隆 30-F11</td><td>BD 生物科学</td><td>564590</td><td></td></tr><tr><td>BONN 显微解剖镊，直型，1×2 齿，3.75&quot; 长度，0.3 mm 尖端宽度，0.12 mm 齿部</td><td>ROBOZ 外科器械公司</td><td>RS-5172</td><td>ROBOZ 外科器械公司，美国马里兰州盖瑟斯堡</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>2115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>CASTROVIEJO 显微缝合针持，直型带锁扣，5.75&quot; 长度</td><td>ROBOZ 外科器械公司</td><td>RS-6412</td><td>ROBOZ外科器械公司，美国马里兰州盖瑟斯堡</td></tr><tr><td>细胞计数试剂盒，30个双腔载玻片，可进行60次计数，含台盼蓝</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1450003</td><td></td></tr><tr><td>细胞染色缓冲液</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>产气荚膜梭菌胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>III型胶原酶</td><td>沃辛顿生化公司</td><td>LS004182</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶，6型</td><td>沃辛顿生化公司</td><td>LS005319</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Alexa Fluor 488 凋亡与死细胞检测试剂盒 &amp;碘化丙啶（PI）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>V13241</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>恩诺沙星（Baytril）</td><td>拜耳医药保健有限责任公司</td><td>NADA # 140-913 获美国食品药品监督管理局（FDA）批准。批号：AH01CGP</td><td>2.27%注射液</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）抗体，大鼠单克隆，IgG2a &amp;kappa;，亲和纯化</td><td>BioLegend</td><td>122505</td><td></td></tr><tr><td>来自绵羊睾丸的透明质酸酶，II型</td><td>Sigma</td><td>H2126</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainer（100 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-110-917</td><td></td></tr><tr><td>麦克弗森-范恩斯微型解剖弹簧剪，直头，4号&quot; 长度，0.15 mm 尖端宽度</td><td>ROBOZ 外科器械公司</td><td>RS-5630</td><td>ROBOZ外科器械公司，美国马里兰州盖瑟斯堡</td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-7959</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 抗小鼠 CD19 抗体，大鼠单克隆，IgG2a &amp;kappa;，亲和纯化</td><td>BioLegend</td><td>115509</td><td>废液通道</td></tr><tr><td>PE/Cy5 抗小鼠 CD3&amp;epsilon; 抗体， Armenian hamster 单克隆，IgG，亲和纯化</td><td>BioLegend</td><td>100309</td><td>废液通道</td></tr><tr><td>PE/Cy5 抗小鼠 CD4 抗体，大鼠单克隆，IgG2b &amp;kappa;，亲和纯化</td><td>BioLegend</td><td>100409</td><td>废液通道</td></tr><tr><td>PE/Cy5 抗小鼠 CD8a 抗体，大鼠单克隆，IgG2a &amp;kappa;，亲和纯化</td><td>BioLegend</td><td>100709</td><td>倾倒通道</td></tr><tr><td>PE/Cy5 抗小鼠 NK-1.1 抗体，小鼠单克隆，IgG2a &amp;kappa;，亲和纯化</td><td>BioLegend</td><td>108715</td><td>废液通道</td></tr><tr><td>PE/Cy5 抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体，IgG2b &amp;kappa;，亲和纯化</td><td>BioLegend</td><td>116209</td><td>倾倒通道</td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体），大鼠单克隆抗体，IgG2b &amp;kappa;，克隆 2.4G2</td><td>BD 生物科学</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>RBC裂解缓冲液（10X）</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液 1x</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>螺口微量离心管，1.5 ml</td><td>VWR</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自动细胞计数仪</td><td>伯乐（Biorad）</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>三种抗生素软膏（新霉素/多粘菌素B/杆菌肽）</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-7216</td><td>皮肤保护剂</td></tr><tr><td>TrypLE Select 酶（10 倍浓度），无酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>维他霉素眼膏</td><td>德克拉动物保健产品</td><td>NADA # 065-016，已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准。</td><td>麻醉期间保护眼睛</td></tr></tbody></table>

脊髓损伤后小鼠膀胱分子分析的单细胞解离方法

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

我们描述了在小鼠中实施脊髓损伤以诱导逼尿肌-括约肌协同失调的方法，这是一种功能性膀胱出口梗阻，并可导致后续的膀胱壁重塑。为了便于评估未损伤对照小鼠和脊髓损伤小鼠膀胱壁的细胞组成，我们开发了一种优化的组织解离方案，该方案可维持高细胞活性，并支持通过流式细胞术检测出离散的细胞亚群。
通过完全横断胸段脊髓来建立脊髓损伤模型。在组织取材时，动物在深度麻醉下用磷酸盐缓冲液灌流，膀胱组织则采集至Tyrode缓冲液中。根据公共基因表达数据库中对小鼠膀胱胶原含量的分析结果，优化了消化缓冲液的组成，组织在该缓冲液中孵育前先进行机械剪碎。在获得单细胞悬液后，通过流式细胞术分析细胞活力、细胞数量及特定亚群。我们证明该方法获得的细胞群体活力超过90%，且能有效富集来源于间充质和上皮的细胞。该方法将有助于对小鼠膀胱中不同类型细胞进行精确的下游分析，并可能适用于其他器官。

手术操作 
胸段脊髓横断手术的成功与否需通过多项参数进行评估，其中最明显的是后肢瘫痪。动物仅能使用前肢移动，后肢则拖行。除此之外，其活动水平（包括进食、理毛和警觉性）通常保持正常。此外，动物会失去自主的膀胱控制能力，因此需要研究人员每12小时手动排空膀胱一次，直至损伤后10至14天反射性排尿功能恢复。在实施安乐死后，评估损伤成功的其他指标主要表现为膀胱与体重比值的增加，提示组织重塑的发生。组织学分析显示尿路上皮和平滑肌层均出现增生3。
单细胞悬液的制备 
利用公开的表达数据，确定了膀胱组织中细胞外基质蛋白的富集情况（图2），并据此指导消化液配方的设计。由于胶原蛋白是膀胱壁的关键组分11,12，我们首先利用小鼠ENCODE项目生成的小鼠（Mus musculus）RNA测序数据集13，确定小鼠膀胱中最丰富的胶原蛋白类型。分析结果显示，I型胶原α1链（Collagen 1A1）、III型胶原α1链（collagen 3A1）、I型胶原α2链（collagen 1A2）以及VI型胶原α1链（collagen 6A1）是小鼠膀胱中最丰富的胶原蛋白类型（图2A）。我们还利用Tabula Muris（小鼠单细胞转录组数据汇编）8分析了I型、III型、VI型胶原蛋白以及透明质酸（hyaluronan）的mRNA表达水平。该数据集允许对不同组织中共有的细胞类型进行直接且受控的基因表达比较。该分析表明，这些细胞外基质组分的表达在间充质细胞类型中比尿路上皮细胞更为显著（图2B）。
解离对膀胱来源分离细胞活力的影响 
流式细胞术分析表明，使用4种不同方案进行酶消化后，细胞活力分别为83%、86%、93%和90%。因此，第3节所述方案在维持细胞活力方面被认为最具优势。我们还观察到约4%的细胞处于坏死状态（PI+/Annexin V-）（图4A）。这些结果凸显了该消化方案的高效性及其对细胞活力的积极影响。
脊髓损伤对膀胱中不同细胞群体的影响 
我们观察到，与对照组相比，脊髓损伤（SCI）小鼠膀胱中的总细胞数量显著增加。来自SCI小鼠膀胱的点图分布模式也略有不同，这与脊髓损伤引起的膀胱持续性器官重塑一致（图4B：第一列）。与对照组相比，SCI动物的膀胱中CD45阳性细胞显著增多。
<img alt="小鼠腹部手术，肝脏暴露；实验设置、器官研究、实验室操作比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：肝脏颜色变浅，代表灌注完成。（A）显示灌注开始时的肝脏颜色。（B）显示灌注结束时肝脏颜色变浅。A组小鼠在灌注前两周接受了脊髓横断术，导致膀胱肥大并突出骨盆，而B组小鼠未发生脊髓损伤，其膀胱较小且隐藏于骨盆内。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胶原蛋白表达分析图、RPKM 数据、小鼠膀胱；显示细胞类型分布的小提琴图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠膀胱中细胞外基质（ECM）组分的转录组表达。（A）43 种不同胶原蛋白类型的柱状图。表达量以每百万映射读长每千碱基转录本的读数（RPKM）表示（数据来源于 BioProject：PRJNA66167）14。（B）通过对雄性和雌性解离的尿膀胱样本混合物进行微流控液滴式 3’端计数所获得的各细胞类型中基因表达的小提琴图（雄性和雌性）。对每个细胞的计数采用自然对数 ln(CPM+1) 进行对数归一化处理，其中 CPM 为每百万计数8。取对数前添加了 1 CPM 的伪计数值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞染色、抗体偶联和凋亡分析的流式细胞术示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：确定荧光扩散的设门策略与FMO对照。（A）细胞群体的选择。（B）单细胞设门策略。（C）利用PI和Annexin V抗体对坏死细胞、早期和晚期凋亡细胞进行设门。（D‒F）多色流式细胞术的示意图（例如，与荧光染料A、B、C、D偶联的抗体 + Annexin V和PI）。该图显示了FMO对照中荧光扩散至荧光染料A通道的情况，与未染色对照相比。橙色虚线表示FMO设门边界，红色虚线表示未染色对照的边界。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；散点图、直方图；annexin V、PI、FITC、APC 标记；细胞凋亡。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：膀胱中不同类型细胞的流式细胞术分析。（A）Annexin V/PI 双染流式图。每种方案所使用的不同酶与化学试剂组合显示在相应活力图前方。这些数据表明，采用第 3 节方案时获得的细胞活力最高。（B）代表性直方图，显示在单通道中检测到的 Ly-6A/E (Sca-1) 和 CD326 (Ep-CAM) 的荧光强度。（C）脊髓损伤（SCI）对小鼠膀胱细胞群体的影响。上图显示来自未进行手术的对照小鼠的三个分离膀胱的染色结果，下图显示来自三只 SCI 小鼠的染色结果。第一列为总细胞群体，第二列为单细胞门控选择，第三列为对 B 细胞、T 细胞和 NK 细胞呈阴性的活细胞亚群，第四列为对 CD45 呈阳性的活细胞染色结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>用量（500 mL）</td>
			<td>摩尔浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0.186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>0.0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-葡萄糖</td>
			<td>0.9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>1.19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Tyrode溶液配制组分。 所列组分为配制500 mL Tyrode溶液所需。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>用量</td>
			<td>实验方案第1部分</td>
			<td>实验方案第2部分</td>
			<td>实验方案第3部分</td>
			<td>实验方案第4部分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>0.03 mM</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶原酶 I 型</td>
			<td>132.5 units</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶原酶 III 型</td>
			<td>96.4 units</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶原酶 VI 型</td>
			<td>50 units</td>
			<td>否</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
			<td>否</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>10 units</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>否</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>木瓜蛋白酶</td>
			<td>115 units</td>
			<td>否</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>广谱胶原酶</td>
			<td>50 units</td>
			<td>否</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>透明质酸酶</td>
			<td>10.5 units</td>
			<td>否</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中性蛋白酶 II</td>
			<td>1.25 units</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>否</td>
			<td>否</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞解离液</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>是</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
			<td>否</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重组酶</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：消化缓冲液制备组分。 表中所列组分为配制2.5 mL消化混合液所需（1 U指在37 °C下每分钟催化1 µmol底物水解的酶量。各酶活性单位定义请参考相应产品说明书）。

本实验方案的目的是将优化的组织解离方法应用于脊髓损伤的小鼠模型，并通过流式细胞术对单细胞分析进行方法学验证。

我们描述了在小鼠中实施脊髓损伤以诱发逼尿肌-括约肌协同失调（detrusor-sphincter dyssynergia），即一种功能性膀胱出口梗阻，以及……

本方案具有重要意义，因为它利用生物学信息促进生成高细胞活力的单细胞悬液。该技术的主要优势在于能够制备出保持高细胞活力并适当代表所分离细胞类型的单细胞悬液。手术操作将由本实验室的在研人员 Hussein Atta 演示。组织解离步骤将由 Ali Hashemi 演示，FACS 分析将由 Yaser Heshmati 演示。在确认成年麻醉小鼠无足底反射反应后，触诊胸椎中最突出的棘突。手术前给予镇痛剂和抗生素。在小鼠背部从颈部下端至最突出的棘突下方，沿中线两侧各一厘米处，剃除一个纵向矩形区域的毛发。用10%聚维酮碘和70%乙醇棉片依次以环形方式从切口位置向外周擦拭，对暴露的皮肤消毒三次。最后一次擦拭后，用一块无菌的4英寸×4英寸纱布海绵覆盖小鼠，纱布中央剪出窗口，暴露手术区域。为诱导脊髓损伤，首先在背部正中做一个1.5厘米的切口，使用锐性钝性分离技术将肌肉从T9、T10和T11椎骨的棘突和椎板上分离。使用精细剪刀锐性切开T9与T10以及T10与T11之间的棘间韧带，然后对T10棘突进行双侧椎板切除术。当椎板被完全切除后，使用剪刀横断脊髓。为完全切断侧柱，需用精细剪刀的尖端在两侧轻柔地扫切。使用无菌棉签压迫止血。止血完成后，用7-0聚乳酸-羟基乙酸连续缝合关闭皮肤，并皮下注射1毫升生理盐水以预防术后脱水，随后将动物放回清洁笼具中，持续监测直至完全恢复卧位。每12小时一次，用一只手固定动物，另一只手按摩其下腹部，用食指和拇指定位膨胀的膀胱，并轻轻按压，以刺激手动排尿，直至动物能够自主排尿。为进行后续感兴趣的膀胱细胞类型的分析，在适当的实验时间点，待动物充分麻醉后，从骨盆至横膈膜行腹正中切口，并将横膈膜从肋骨上剪离。沿胸骨旁的骨软骨交界处，自横膈膜开始沿两侧肋骨向第一肋方向切开胸腔。将动物头部上方的前胸壁固定后，用精细剪刀剪除心包膜，并将23号针头连接至灌注装置。将针头插入左心室，缓慢推进至主动脉，注意不要刺破组织。当针头就位后，以每分钟15毫升的流速开始用PBS灌注组织，同时用精细剪刀的尖端迅速在右心房上剪开一个小切口。当灌注液变得澄清且肝脏颜色变浅时，停止灌注，将膀胱从血管蒂和尿道分离，随后将其放入含有冰冻 Tyrode 溶液的微量离心管中。为制备单细胞悬液，待所有膀胱收集完毕后，撕开一个含有 100 µL Tyrode 溶液的 1.5 mL 微量离心管。称重后，在含有 100 µL Tyrode 溶液的 10 cm 培养皿中将膀胱组织剪碎，并使用宽孔移液枪头将组织碎片转移至每膀胱 2.5 mL 消化缓冲液中。将组织置于37摄氏度的Nutator摇床上孵育40分钟，然后使用5毫升移液器吹打样本1分钟，再通过离心收集解离的细胞和组织。将沉淀重悬于1毫升细胞解离溶液中，并将细胞置于Nutator摇床上继续孵育10分钟。孵育结束后，再次通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中。一分钟后，加入九毫升磷酸盐缓冲液（PBS）终止裂解，将细胞通过70微米细胞筛过滤至50毫升离心管中，再次离心后，将细胞沉淀重悬于200微升含有FC阻断剂的染色缓冲液中。冰上孵育10分钟后，离心收集细胞，并将沉淀重悬于适量体积的荧光染料标记抗体主混合液中，避光冰上孵育20分钟。孵育结束后，用一毫升细胞染色缓冲液洗涤细胞，再将沉淀重悬于100微升新鲜细胞染色缓冲液中，其中添加5微升FITC标记的Annexin V和1微升碘化丙啶（propidium iodide）。室温孵育15分钟后，向细胞中加入400微升Annexin结合缓冲液，通过倒置混匀。进行流式细胞术分析时，首先使用未染色的细胞样本设定细胞的侧向散射和前向散射参数，然后在530纳米处以及大于575纳米处检测荧光发射，以排除死细胞。利用每个点图上的网格确定第一衰变中的阴性细胞群，并使用减去一荧光对照校正光谱重叠，直至阴性与阳性细胞群的中位值对齐。然后，针对具有特定目标标记物的细胞，检测100,000个细胞事件，并根据需要设定目标细胞群体的门控。当所有样本检测完成后，使用相应的流式细胞术分析软件对数据进行分析。在小鼠膀胱中，I型胶原α1链（collagen 1A1）、III型胶原α1链（collagen 3A1）、I型胶原α2链（collagen 1A2）和VI型胶原α1链（collagen 6A1）是含量最丰富的胶原类型。通过分析胶原蛋白I型、III型、VI型以及透明质酸的mRNA表达水平，结果显示这些细胞外基质组分在间充质细胞群体中的表达比尿路上皮更为丰富。流式细胞术分析表明，多种不同的酶消化方案均可获得高活力的细胞群体，其中本研究所采用的第三种消化方案在细胞保存方面效果最佳。利用该方法，可从脊髓损伤小鼠膀胱中分离出显著增加的细胞总数，从而与对照组膀胱进行比较。与对照组相比，脊髓损伤动物的膀胱中CD45阳性细胞数量也显著增加。步骤7.1对于鉴定心肌细胞群体非常重要。设门策略应根据所关注的细胞类型来确定。来自脊髓损伤动物的膀胱具有独特的细胞群体。本方案可用于细胞分选、原代细胞培养、单细胞测序以及其他需要活单细胞的分子和细胞下游实验。本方案可获得高细胞活性，从而减少细胞群体的损失，这对于单细胞分析技术（如单细胞RNA测序）至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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了解用于脊髓损伤小鼠膀胱单细胞分析的组织解离方法。该技术通过流式细胞术生成高活力单细胞悬液，准确反映细胞类型，适用于单细胞测序等下游研究。

脊髓损伤后小鼠膀胱分子分析的单细胞解离方法

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