脊髓损伤后小鼠膀胱分子分析的单细胞解离方法

本方案具有重要意义，因为它利用生物学信息促进生成高细胞活力的单细胞悬液。该技术的主要优势在于能够制备出保持高细胞活力并适当代表所分离细胞类型的单细胞悬液。手术操作将由本实验室的在研人员 Hussein Atta 演示。

组织解离步骤将由 Ali Hashemi 演示，FACS 分析将由 Yaser Heshmati 演示。在确认成年麻醉小鼠无足底反射反应后，触诊胸椎中最突出的棘突。手术前给予镇痛剂和抗生素。

在小鼠背部从颈部下端至最突出的棘突下方，沿中线两侧各一厘米处，剃除一个纵向矩形区域的毛发。用10%聚维酮碘和70%乙醇棉片依次以环形方式从切口位置向外周擦拭，对暴露的皮肤消毒三次。最后一次擦拭后，用一块无菌的4英寸×4英寸纱布海绵覆盖小鼠，纱布中央剪出窗口，暴露手术区域。

为诱导脊髓损伤，首先在背部正中做一个1.5厘米的切口，使用锐性钝性分离技术将肌肉从T9、T10和T11椎骨的棘突和椎板上分离。使用精细剪刀锐性切开T9与T10以及T10与T11之间的棘间韧带，然后对T10棘突进行双侧椎板切除术。当椎板被完全切除后，使用剪刀横断脊髓。

为完全切断侧柱，需用精细剪刀的尖端在两侧轻柔地扫切。使用无菌棉签压迫止血。止血完成后，用7-0聚乳酸-羟基乙酸连续缝合关闭皮肤，并皮下注射1毫升生理盐水以预防术后脱水，随后将动物放回清洁笼具中，持续监测直至完全恢复卧位。

每12小时一次，用一只手固定动物，另一只手按摩其下腹部，用食指和拇指定位膨胀的膀胱，并轻轻按压，以刺激手动排尿，直至动物能够自主排尿。为进行后续感兴趣的膀胱细胞类型的分析，在适当的实验时间点，待动物充分麻醉后，从骨盆至横膈膜行腹正中切口，并将横膈膜从肋骨上剪离。沿胸骨旁的骨软骨交界处，自横膈膜开始沿两侧肋骨向第一肋方向切开胸腔。

将动物头部上方的前胸壁固定后，用精细剪刀剪除心包膜，并将23号针头连接至灌注装置。将针头插入左心室，缓慢推进至主动脉，注意不要刺破组织。当针头就位后，以每分钟15毫升的流速开始用PBS灌注组织，同时用精细剪刀的尖端迅速在右心房上剪开一个小切口。

当灌注液变得澄清且肝脏颜色变浅时，停止灌注，将膀胱从血管蒂和尿道分离，随后将其放入含有冰冻 Tyrode 溶液的微量离心管中。为制备单细胞悬液，待所有膀胱收集完毕后，撕开一个含有 100 µL Tyrode 溶液的 1.5 mL 微量离心管。称重后，在含有 100 µL Tyrode 溶液的 10 cm 培养皿中将膀胱组织剪碎，并使用宽孔移液枪头将组织碎片转移至每膀胱 2.5 mL 消化缓冲液中。

将组织置于37摄氏度的Nutator摇床上孵育40分钟，然后使用5毫升移液器吹打样本1分钟，再通过离心收集解离的细胞和组织。将沉淀重悬于1毫升细胞解离溶液中，并将细胞置于Nutator摇床上继续孵育10分钟。孵育结束后，再次通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中。

一分钟后，加入九毫升磷酸盐缓冲液（PBS）终止裂解，将细胞通过70微米细胞筛过滤至50毫升离心管中，再次离心后，将细胞沉淀重悬于200微升含有FC阻断剂的染色缓冲液中。冰上孵育10分钟后，离心收集细胞，并将沉淀重悬于适量体积的荧光染料标记抗体主混合液中，避光冰上孵育20分钟。孵育结束后，用一毫升细胞染色缓冲液洗涤细胞，再将沉淀重悬于100微升新鲜细胞染色缓冲液中，其中添加5微升FITC标记的Annexin V和1微升碘化丙啶（propidium iodide）。

室温孵育15分钟后，向细胞中加入400微升Annexin结合缓冲液，通过倒置混匀。进行流式细胞术分析时，首先使用未染色的细胞样本设定细胞的侧向散射和前向散射参数，然后在530纳米处以及大于575纳米处检测荧光发射，以排除死细胞。利用每个点图上的网格确定第一衰变中的阴性细胞群，并使用减去一荧光对照校正光谱重叠，直至阴性与阳性细胞群的中位值对齐。

然后，针对具有特定目标标记物的细胞，检测100,000个细胞事件，并根据需要设定目标细胞群体的门控。当所有样本检测完成后，使用相应的流式细胞术分析软件对数据进行分析。在小鼠膀胱中，I型胶原α1链（collagen 1A1）、III型胶原α1链（collagen 3A1）、I型胶原α2链（collagen 1A2）和VI型胶原α1链（collagen 6A1）是含量最丰富的胶原类型。

通过分析胶原蛋白I型、III型、VI型以及透明质酸的mRNA表达水平，结果显示这些细胞外基质组分在间充质细胞群体中的表达比尿路上皮更为丰富。流式细胞术分析表明，多种不同的酶消化方案均可获得高活力的细胞群体，其中本研究所采用的第三种消化方案在细胞保存方面效果最佳。利用该方法，可从脊髓损伤小鼠膀胱中分离出显著增加的细胞总数，从而与对照组膀胱进行比较。

与对照组相比，脊髓损伤动物的膀胱中CD45阳性细胞数量也显著增加。步骤7.1对于鉴定心肌细胞群体非常重要。设门策略应根据所关注的细胞类型来确定。

来自脊髓损伤动物的膀胱具有独特的细胞群体。本方案可用于细胞分选、原代细胞培养、单细胞测序以及其他需要活单细胞的分子和细胞下游实验。本方案可获得高细胞活性，从而减少细胞群体的损失，这对于单细胞分析技术（如单细胞RNA测序）至关重要。