MCF7细胞单层中细胞基质粘附面积和细胞形状分布的定量
June 24th, 2020
本文描述了1）焦点粘附的大小和数量，2）细胞形状指数及其分布从MCF7细胞的汇合单层共聚焦图像。
该协议允许从二维图像中量化细胞内结构的面积、周长和形状。这种技术是快速和容易的，只需要标准的实验室设置和共和显微镜，并使用开源软件。演示这个程序的将是安娜·巴尔塞拉克，一个博士学生从我的实验室。
首先，在四井胶原蛋白一个涂层室幻灯片中，每井在 0.5 毫升培养培养基中播种四倍至第五细胞，在 37 摄氏度和 5 度二氧化碳培养箱中进行 24 小时培养。第二天早上，使用光学倒置显微镜验证是否存在至少90%的汇合单层，并使用共和显微镜获得单片Z切片图像。对于焦距粘附分析，请在 ImageJ 中打开图像并选择分析、设置比例、移除比例和全局以像素为单位设置图像比例。
若要在测量选项中包括文件名和感兴趣区域的区域，请单击分析和设置测量值，并检查区域并显示标签选项。要减去背景，请选择过程并减去背景。将滚动球半径设置为 50 像素，并检查滑动抛物线。
要确定最小感兴趣区域的区域，请勾勒出最小的单个焦点粘附，然后单击分析和测量以测量该区域。当至少选择并测量了 20 个感兴趣区域时，计算并保存获得的结果的均值。将上边界设置为典型单元格区域的 25%。
若要将图像授予二进制图像，请单击图像、调整和阈值，并检查默认、黑白和深色背景。要测量感兴趣区域的数量和面积，请选择分析粒子并检查像素单位、显示结果、明确结果和汇总。将切片、计数和总面积平均大小数据从摘要窗口传输到所选的数据管理程序。
对于焦粘附定量，打开焦粘附 ImageJ 宏，进入最小感兴趣区域的区域作为最小感兴趣区域参数的区域。将阈值类型值设置为手动或自动，并保存更改。然后从 ImageJ 调用宏并选择要处理的图像。
对于手动单元格形状分析，请在适当的图像处理软件程序中打开图像，然后选择要测量的参数。使用徒手选择工具手动划定由所选的结蛋白标记的细胞边框。将自动计算每个单元格的选定参数。
概述所有单元格后，选择编辑、选择并添加到管理器。只应选择具有不间断边框的完整完全可见的单元格。要进行测量，请标记兴趣管理器区域左侧框中显示的所有数字，然后单击"度量"。
结果将显示在结果框中，并可以导入到首选电子表格。自动细胞分析有助于定量大量细胞。对于每个新的单元格类型，首先运行宏以建立参数。
宏完成后，选择设置单元格大小边界。单击最小和最大单元格的标签，然后单击度量值。设置最小单元格和最大单元格变量的值并保存更改。
关闭所有宏窗口，然后选择要以灰度处理的图像。然后再次运行宏。宏将提供一个结果表，其中包括单元格形状索引、纵横比和兴趣选择区域列表数据。
在这里，可以观察到与 ImageJ 一起计数的焦粘附的代表性图像，包括最终编号的轮廓和焦粘附轮廓与原始图像的叠加，用于控制和击倒细胞系。如本分析所示，与控制细胞系细胞相比，击倒细胞表明每个细胞的粘附数以及较大的粘附量。在这些图像中，显示了未经治疗和化疗的细胞单层代表性区域。
轮廓细胞的特征是按照其细胞形状指数值，例如，在此分析中，与未经治疗的对控相比，显示最后一个 bin 的增加和药物治疗细胞的主要峰值的扁平化。然后可以为每个单元培养生成频率分布和累积分布。所演示的单层灰度成像允许对来自12个视场的512个细胞进行分析和定量，揭示细胞形状指数的相对频率分布。
对于此协议来说，使用尽可能高质量的图像非常重要。适当的细胞播种、染色和成像应确保图像具有足够的实验质量。
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概览
本文详细介绍了一种协议，用于使用共聚焦成像技术量化MCF7细胞全息单层中的局灶性黏附和细胞形状指数。该研究强调了如何通过可获得的成像技术分析黏附和细胞形状的变化。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 局灶性黏附分析
- 细胞形状量化
背景
- 局灶性黏附对于细胞黏附和信号传导至关重要。
- 了解细胞形状和黏附可以影响癌症生物学的研究。
- MCF7细胞作为乳腺癌研究的模型系统。
使用的方法
- 共聚焦显微镜用于成像细胞结构。
- ImageJ软件用于分析局灶性黏附区域和细胞形状指数。
- 手动和自动分析协议用于高效的数据收集。
主要结果
- 与对照相比，敲低细胞中观察到更多且更大的局灶性黏附。
- 未经处理的细胞和药物处理的细胞之间的细胞形状指数存在差异。
- 稳健的方法论允许分析大样本量，增强了统计相关性。
结论
- 本研究提供了一种可靠的协议，用于分析细胞形态和黏附特性。
- 这些发现有助于理解细胞的机械性质，这在癌症研究和开发中相关。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying focal adhesion dynamics and cell shape distributions provides mechanistic insights into cancer cell behavior, supporting target validation in oncology drug discovery. This protocol enables reproducible, image-based assessment of adhesion and morphology, facilitating phenotypic screening and preclinical model characterization. The approach supports data-driven go/no-go decisions by linking molecular perturbations to functional cellular outputs relevant to therapeutic response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying changes in focal adhesion number and size as functional readouts of target modulation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, image-based metrics that correlate molecular interventions with cellular phenotypes.
- Predictive Value: Generates quantitative adhesion and shape data that enhance confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated, quantitative outputs (adhesion area, count, shape index) suitable for high-content screening workflows.
- Reproducibility: Uses standardized staining, imaging, and open-source analysis to ensure consistent results across experiments and laboratories.
- Scalability: Automated macro-based analysis allows processing of large cell populations, supporting assay miniaturization and throughput.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to breast cancer models using MCF7 cells, enabling mechanistic de-risking of oncology targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing quantifiable, morphology-based biomarkers of drug response.
- Risk-Adjusted Advancement: Shape and adhesion distributions inform predictive models for cellular behavior in therapeutic contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly in cancer mechanobiology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in adhesion and morphology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative image outputs that enable reliable compound effect assessment in adherent monolayers.
- Analytics: Provides numerical readouts (focal adhesion count, size, cell shape index) that facilitate condition comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through morphology-based biomarkers that reflect drug-induced cellular changes.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other cellular structures (e.g., mitochondria, nuclei) and cell types, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic links between targets and cellular phenotypes.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined staining, imaging, and analysis parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing objective, quantifiable phenotypic data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional adhesion and shape outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, immunofluorescence staining, and confocal microscopy operation.
- Dependent on access to confocal microscopes and computers capable of running ImageJ and associated macros.
- Necessitates standardization of image acquisition settings (z-slice, lighting, focus) across users and experiments.
- Adaptation to new cell types or structures requires initial parameter optimization (e.g., size thresholds, staining validation).
- Limited to 2D image analysis; does not capture 3D adhesion dynamics or subcellular localization without modification.
