MCF7细胞单层中细胞基质粘附面积和细胞形状分布的定量

该协议允许从二维图像中量化细胞内结构的面积、周长和形状。这种技术是快速和容易的，只需要标准的实验室设置和共和显微镜，并使用开源软件。演示这个程序的将是安娜·巴尔塞拉克，一个博士学生从我的实验室。

首先，在四井胶原蛋白一个涂层室幻灯片中，每井在 0.5 毫升培养培养基中播种四倍至第五细胞，在 37 摄氏度和 5 度二氧化碳培养箱中进行 24 小时培养。第二天早上，使用光学倒置显微镜验证是否存在至少90%的汇合单层，并使用共和显微镜获得单片Z切片图像。对于焦距粘附分析，请在 ImageJ 中打开图像并选择分析、设置比例、移除比例和全局以像素为单位设置图像比例。

若要在测量选项中包括文件名和感兴趣区域的区域，请单击分析和设置测量值，并检查区域并显示标签选项。要减去背景，请选择过程并减去背景。将滚动球半径设置为 50 像素，并检查滑动抛物线。

要确定最小感兴趣区域的区域，请勾勒出最小的单个焦点粘附，然后单击分析和测量以测量该区域。当至少选择并测量了 20 个感兴趣区域时，计算并保存获得的结果的均值。将上边界设置为典型单元格区域的 25%。

若要将图像授予二进制图像，请单击图像、调整和阈值，并检查默认、黑白和深色背景。要测量感兴趣区域的数量和面积，请选择分析粒子并检查像素单位、显示结果、明确结果和汇总。将切片、计数和总面积平均大小数据从摘要窗口传输到所选的数据管理程序。

对于焦粘附定量，打开焦粘附 ImageJ 宏，进入最小感兴趣区域的区域作为最小感兴趣区域参数的区域。将阈值类型值设置为手动或自动，并保存更改。然后从 ImageJ 调用宏并选择要处理的图像。

对于手动单元格形状分析，请在适当的图像处理软件程序中打开图像，然后选择要测量的参数。使用徒手选择工具手动划定由所选的结蛋白标记的细胞边框。将自动计算每个单元格的选定参数。

概述所有单元格后，选择编辑、选择并添加到管理器。只应选择具有不间断边框的完整完全可见的单元格。要进行测量，请标记兴趣管理器区域左侧框中显示的所有数字，然后单击"度量"。

结果将显示在结果框中，并可以导入到首选电子表格。自动细胞分析有助于定量大量细胞。对于每个新的单元格类型，首先运行宏以建立参数。

宏完成后，选择设置单元格大小边界。单击最小和最大单元格的标签，然后单击度量值。设置最小单元格和最大单元格变量的值并保存更改。

关闭所有宏窗口，然后选择要以灰度处理的图像。然后再次运行宏。宏将提供一个结果表，其中包括单元格形状索引、纵横比和兴趣选择区域列表数据。

在这里，可以观察到与 ImageJ 一起计数的焦粘附的代表性图像，包括最终编号的轮廓和焦粘附轮廓与原始图像的叠加，用于控制和击倒细胞系。如本分析所示，与控制细胞系细胞相比，击倒细胞表明每个细胞的粘附数以及较大的粘附量。在这些图像中，显示了未经治疗和化疗的细胞单层代表性区域。

轮廓细胞的特征是按照其细胞形状指数值，例如，在此分析中，与未经治疗的对控相比，显示最后一个 bin 的增加和药物治疗细胞的主要峰值的扁平化。然后可以为每个单元培养生成频率分布和累积分布。所演示的单层灰度成像允许对来自12个视场的512个细胞进行分析和定量，揭示细胞形状指数的相对频率分布。

对于此协议来说，使用尽可能高质量的图像非常重要。适当的细胞播种、染色和成像应确保图像具有足够的实验质量。