Name: 从Sézary综合征患者中分离人外周血单核细胞和CD4 + T细胞以进行转录组学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学习从Sézary综合征患者外周血中分离单核细胞并纯化CD4+ T细胞的方法，用于转录组学分析。该技术可获得高纯度活性细胞，支持基因表达和免疫机制研究。

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我们感谢参与本研究的患者和志愿者。

人体细胞可能具有传染性。因此，实验必须严格遵循职业安全与健康管理局（OSHA）规定的预防措施和操作程序，并使用个人防护装备（PPE）。
1. 从全血中分离外周血单个核细胞
<ol>
	<li>从表1中收集所有所需材料，并将其恢复至室温（RT）。将RP10F预热至37 °C。将离心机调节至室温。除离心和细胞计数外，所有操作均应在生物安全柜中使用活细胞进行。</li>
	<li>采集含抗凝剂的全血，分装于五个10 mL离心管中（所需量）。将全血储存在环境温度（18‒24 °C）下。用待处理血液样本对应的人体研究对象编号标记50 mL分离管。</li>
	<li>将10‒15 mL血液转移至对应编号的分离管中。用Hank’s平衡盐溶液（HBSS）至少稀释2倍。每管中稀释后血液体积不得超过35 mL。</li>
	<li>在血液下方小心缓慢地加入约13 mL密度介质。透过透明的密度介质观察管底，当移液器即将排空时停止加样（防止产生气泡）。小心取出移液器，避免混合血液与密度介质层。</li>
	<li>小心将装有液体的分离管转移至离心机中，避免扰动各层。</li>
	<li>以500 x g离心30分钟，关闭离心机制动（减速设为零）。 
	注意：若离心机仅显示转速（rpm），请参考转子规格，估算相当于500 x g的rpm值。</li>
	<li>从离心机中小心取出分离管，避免扰动各层。观察位于密度介质层与血浆层之间的白膜层（buffy coat）。</li>
	<li>从上层开始吸除并弃去大部分血浆，保留约10 mL血浆在白膜层上方。小心缓慢地收集白膜层。将两个分离管中的白膜层转移至一个新的预先标记且无菌的50 mL离心管中，如图1所示。</li>
	<li>用HBSS至少稀释2倍&#160;，将每根新离心管中的体积补至50 mL。记得将离心机制动调至最大。以400 x g离心10分钟，沉淀外周血单个核细胞（PBMCs）。尽可能吸除上清液，并轻敲管底以松动沉淀。</li>
	<li>为裂解残留的红细胞（RBC），每10 mL原始血液体积对应的细胞沉淀中加入1‒2 mL氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液，重悬细胞。准确孵育5分钟。立即加入等体积或更大体积的HBSS终止裂解反应，并将总体积调整至50 mL。以400 x g离心10分钟。</li>
	<li>吸除上清液，轻敲管底以松动细胞沉淀。合并同一供体的细胞。用HBSS将体积补至50 mL。以400 x g离心10分钟。</li>
	<li>吸除上清液，轻敲管底以松动细胞沉淀。将细胞重悬于10 mL预热的RP10F培养基中，并取一部分样品，用台盼蓝染色进行活细胞计数。</li>
	<li>使用血细胞计数板计算每个样本中的总细胞数。</li>
</ol>
2. 从外周血单个核细胞中纯化 CD4+CD45RO+ T 细胞
注意：CD4+CD45RO+ T 细胞从外周血单个核细胞（PBMC）中的纯化采用市售的磁性分离试剂盒（见材料表），并进行了少量修改。建议遵循试剂盒说明书中的孵育时间，因为不同商业试剂盒的说明可能有所不同。
<ol>
	<li>用10 mL分选缓冲液洗涤所需数量的PBMCs，400 × g 离心10分钟。弃去上清液，轻敲管底以松动沉淀。</li>
	<li>将PBMCs用分选缓冲液稀释至5 × 107 个细胞/mL，并转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底管（12 × 75 mm）中。</li>
	<li>每1 mL样品加入50 µL抗体混合液，轻轻混匀。室温孵育5分钟。</li>
	<li>使用前立即高速涡旋磁性颗粒30秒。每1 mL样品向含有PBMCs的管中加入50 µL磁性颗粒，轻轻混匀。</li>
	<li>用分选缓冲液将体积补至2.5 mL，轻轻混匀。将管子（不加盖）放入磁架中，室温孵育2.5分钟。</li>
	<li>拿起磁架，连续动作将磁架和管子一同翻转，将富集的细胞悬液倒入一个新的无菌管中。</li>
	<li>为提高回收率，向磁架中残留的管内加入2.5 mL分选缓冲液，注意不要扰动固定的磁珠。继续置于磁架中2.5分钟，重复步骤2.6以回收更多细胞。</li>
	<li>取一部分细胞样品，用台盼蓝染色进行活细胞计数。使用血细胞计数板或细胞计数仪计算总细胞数。</li>
	<li>通过流式细胞术确认纯度（图3）。</li>
</ol>
3. 化学激活
<ol>
	<li>用预热的 RP10F 培养基将 CD4+CD45RO+ T 细胞调整至 5 × 106 个细胞/mL，并将细胞分装至所需规格的培养皿中。在 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中静置过夜。</li>
	<li>以 400 × g 离心 10 分钟收集静置后的细胞，弃去上清液，轻敲管底以松动细胞沉淀。</li>
	<li>用预热的 RP10F 培养基将细胞浓度调整至 5 × 106 个细胞/mL，并将 0.5–1 × 107 个细胞分装至三个无菌螺口管中。 
	注意：若细胞数量充足，可在实验设计中设置重复刺激组或增加额外的时间点。</li>
	<li>用 PMA 和 A23187 刺激第 2 和第 3 管中的细胞。加入 PMA 至终浓度为 25 ng/mL，A23187 至终浓度为 500 ng/mL，轻轻混匀。向作为溶剂对照（对照组）的第 1 管细胞中加入等体积的二甲基亚砜（DMSO）。例如，若使用 1 µL PMA 和 1 µL A23187，则向对照管中加入 2 µL DMSO。所有管中 DMSO 的终浓度应低于 0.5%。</li>
	<li>略微松开管盖，将第 2 管细胞放回 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中孵育 2 小时，第 1 和第 3 管孵育 6 小时。在指定时间点，以 500 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>裂解前，尽可能弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>立即按照商品化 RNA 提取试剂盒的说明书进行细胞裂解&#160;（参见材料表）。随后直接进行 RNA 提取，或在 -80 °C 冻存裂解液，以便后续与其他样本一同处理。 
	注意：可使用&#160;微毛细管电泳法检测 RNA 的纯度和完整性。</li>
	<li>可选步骤：为彻底去除纯化 RNA 样品中残留的 DNA，可根据生产商说明书使用 RNA 纯化试剂盒（参见材料表）。&#160;</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。
伦理声明： 
本研究方案已获得阿肯色大学医学科学学院（UAMS，美国阿肯色州小石城）机构审查委员会（IRB）的批准。本研究中呈现的微阵列数据所使用的样本，系在亨利·福特医院（美国密歇根州底特律）机构审查委员会（IRB）批准的研究方案下招募的。

已开发出多种分离外周血单个核细胞（PBMCs）的方法，每种方法均有其各自的优势与局限性28。我们常规使用含抗凝剂的五支10 mL试管，共采集最多50 mL血液。用于PBMC分离的血液体积取决于多个因素，如研究对象的健康状况和年龄，以及采血人员的技术水平。本方案中的一个关键操作步骤是形成密度梯度。分层操作不当可能导致PBMC在界面处部分或完全无法沉淀。我们更倾向于采用此处所述的底层加样法，因其更易于形成底层。为确保将所有密度介质完全置于血液下方，使用无漏气的移液辅助装置至关重要。通过仔细且一致地收集白膜层，可最大限度减少非目标细胞类型对PBMC组分的污染，且每次分离操作均应以相同方式进行。若PBMC无需进一步分选，则应避免在不同分离过程中收集不同体积的密度梯度层和血浆层。进行红细胞裂解的目的是尽量减少污染性红细胞和网织红细胞来源的RNA对后续基因表达分析的潜在影响。过量的等渗&#160;缓冲液会抑制低渗裂解作用。
进一步分离T细胞亚群对于分子学研究具有重要意义。本文描述了&#160;通过阴性分选去除不需要的细胞类型，从而实现后续的CD4+CD45RO+ T细胞筛选。阴性分选依赖于识别所有非目标细胞表面特异性标记物的抗体，抗体标记的细胞随后通过磁珠去除。该分选方案可在去除不需要的细胞的同时，保持目标细胞未受接触且未被激活，处于游离状态，这对于基因激活研究至关重要。然而，操作过程中需注意避免细胞结团，这会&#160;降低所选CD4+ CD45RO+ T细胞的最终纯度。分选缓冲液中含有的乙二胺四乙酸（EDTA）可减少细胞聚集。T细胞的得率取决于初始血液体积、患者等因素&#160;变量包括患者接受的治疗方案以及采样时的疾病阶段。患者接受的治疗可能影响细胞活力。此外，在光分离置换术等任何操作之前采集样本，对CD4+CD45RO+ T细胞的纯度具有积极影响。我们观察到，光分离置换术治疗后采集样本会对CD4+CD45RO+ T细胞的得率产生负面影响。
皮肤T细胞淋巴瘤（SS）患者的肿瘤性T细胞克隆最常表达与成熟记忆性CD4 T细胞表型一致的表面标志物29,30。然而，偶尔也观察到在CD4、CD45RO、CD45RA、CD7和/或CD26等表面标志物上存在表型可塑性31。先前的研究还表明，SS患者之间在CD45RO和CD45RA的表达上具有异质性29，尽管大多数SS病例仍为CD45RO阳性。Roelens等31还发现，SS可能在个体间和个体内均表现出异质性，包含初始T细胞（TN）、中央记忆T细胞（TCM）、过渡记忆T细胞（TTM）、效应记忆T细胞（TEM）以及终末效应记忆T细胞（TEMRA）等多种亚群的混合群体。然而，他们的结果明确显示，大多数SS细胞具有TCM表型。本研究聚焦于SS患者中最常见的CD45RO+表面免疫表型&#160;，并通过流式细胞术确认了该表型。在规划针对患者T细胞亚群的研究时，必须考虑所研究疾病的表型异质性，因此可根据需要调整细胞纯化策略，以获得用于分析的目标T细胞群体。
有多种方法可用于刺激T细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）以检测功能基因表达。我们倾向于使用化学激活法（PMA + A23187离子载体），因为我们关注的是细胞核内的基因调控。对于这一目的而言，化学激活是最佳选择，因为它是一种广谱激活剂，且相较于抗原特异性刺激更为均一&#160;。PMA是一种小分子有机化合物，可穿过细胞膜进入细胞质，并直接激活蛋白激酶C。A23187则允许钙离子跨膜转运。这些化合物绕过了细胞表面受体，共同模拟了T细胞受体与CD28介导的共刺激相结合所产生的效应。这些化学物质可激活多条细胞内信号通路，导致核转录因子的活化以及可被转录激活的细胞因子&#160;基因上调。尽管&#160;在正常细胞中，化学激活与CD3/CD28交联所产生的全基因组表达谱极为相似32，但由于Sézary综合征（SS）T细胞可能丢失包括TCR组分在内的表面受体表达33，因此使用PMA + A23187进行化学激活是更合适的选择。Chong等22比较了来自正常人、早期MF/CTCL及晚期MF/CTCL患者的PBMCs中，PMA/A23187与抗CD3和抗CD28抗体对细胞因子基因的激活效果。他们报告指出，与抗CD3/CD28刺激相比，PMA/A23187&#160;诱导&#160;IL-2&#160;基因的激活更快且更强。此外，他们还表明，抗CD3/CD28抗体引起的较慢激活动力学可能源于刺激所需的交联作用及膜信号传导过程。进一步地，在不同细胞群体中所观察到的细胞因子表达趋势在PMA/A23187刺激下得以保留。由于我们关注的是基因表达的激活，化学刺激是一种理想的方法，因其作为广谱激活剂，相较于抗原特异性刺激更具一致性。CD3/CD28交联则更适合用于研究膜相关信号转导中的关键通路。此外，化学激活成本较低，且无需特殊设备。在本研究中，PMA + A23187显著激活了正常供体（ND）T细胞中的细胞因子基因，但在SS T细胞中未见此效应，提示SS T细胞在TCR下游存在功能&#160;缺陷。
综上所述，本方案可从珍贵的患者来源血液中获得表型纯度高的T细胞，并提供一种评估全基因组范围内功能基因表达变化的方法。我们证明，与正常CD45RO+ T细胞相比，皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）患者新鲜人源T细胞的转录组分析揭示了基因激活方面显著的差异。这些研究将有助于开发针对CTCL中新标志物的诊断生物标志物和治疗策略。此外，该研究策略和实验方案在原代人源T细胞研究中的应用，也可为其他T细胞介导疾病的研究所借鉴。

皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）包括最常见的亚型蕈样肉芽肿（MF）和Sézary综合征（SS），是一组来源于成熟皮肤归巢T细胞发生转化和不受控增殖所致的异质性疾病1,2。肿瘤性T细胞具有成熟的CD4+CD45RO+记忆表型3，并表达皮肤归巢黏附分子，从而增强向表皮迁移的特性4，临床上常表现为皮疹，尤其在疾病早期明显。MF在常规医疗管理下病程通常较为惰性，但部分患者可进展为更晚期的疾病。在这些MF病例中，皮肤病变会增大并增厚形成较大的肿瘤，肿瘤性T细胞可能播散至淋巴结和内脏器官。相比之下，SS是一种更具侵袭性的白血病样CTCL亚型5，其特征为三联征：泛发性红皮病（定义为累及&#62;80%体表面积）、淋巴结肿大以及外周血中存在超过1000/mm3具有脑回状核的克隆性非典型T细胞，即所谓的Sézary细胞6,7。SS患者的预后显著差于MF患者。SS较为罕见，发病率为0.1/100,000，约占所有CTCL病例的3%8,9。CTCL通常发生于老年人群，中位发病年龄约为60岁10。CTCL的发病率曾呈上升趋势，尽管其原因尚不明确，但自1998年以来发病率已趋于稳定11,12。
皮肤T细胞淋巴瘤（SS）的分子发病机制仍不明确。遗传学、表观遗传学和基因表达研究已产生大量新数据，但由于所研究的患者队列规模较小2，以及实验设计和对照人群存在差异13,14，目前仍存在不一致&#160;的研究结果&#160;。更深入的基因组和转录组学特征分析可能有助于揭示疾病的发病机制以及尚未被探索的治疗靶点。因此，需要基于更大患者群体的研究，以更全面地理解这种异质性恶性肿瘤。在某一SS队列中具有高敏感性和特异性的生物标志物组合，在其他队列中的表现则不够一致15，这成为开发可靠诊断和预后生物标志物的重大障碍16。理想的诊断生物标志物应在恶性T细胞中持续且高度过表达，而在正常T细胞中缺失或几乎不表达17。发现疾病特异性的生物标志物对于推动SS诊断和治疗方案的进步至关重要。
高质量的恶性与正常T细胞转录组数据需要高效且可靠的样本制备方法。本文将介绍一种详细而简便的策略，用于获取与Sézary综合征（SS）相关T细胞群体的RNA样本。我们将讨论如何从全血中分离外周血单个核细胞（PBMC），通过阴性磁珠分选富集与疾病相关的CD4+CD45RO+ T细胞亚群，以及采用化学激活方法以揭示&#160;功能反应的差异，以及用于转录组分析的RNA制备。在本方案中，采用佛波酯（phorbol myristate acetate, PMA）和钙离子载体（A23187）进行化学激活18,19，因为先前的研究表明CTCL中存在T细胞受体信号传导缺陷，且使用PMA/A23187刺激&#160;绕过T细胞受体20,21。此外，PMA/A23187&#160;可更直接地激活细胞核内启动细胞因子基因表达所需的信号通路。最后，对T细胞进行刺激能够提供额外层面的基因表达调控信息，而这些信息在缺乏动态变化的静息T细胞中是无法获得的。&#160;

<table><tbody><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 一次性塑料移液管</td><td>Thermo Scientific</td><td>170356</td><td></td></tr><tr><td>1000 µl 移液器吸头</td><td>VWR</td><td>10017-038</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 一次性塑料移液管</td><td>Thermo Scientific</td><td>170357</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 一次性塑料移液管</td><td>Thermo Scientific</td><td>170355</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>A23187 离子载体</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP595</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-5x5ml</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人记忆性 CD4+ T 细胞富集试剂盒</td><td>StemCell</td><td>19157</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>KHCO₃</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>淋巴细胞分离液</td><td>Corning</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>Na₂EDTA</td><td>ACROS</td><td>10378-23-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>NH₄Cl</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇12-十四烷酰13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma</td><td>P-8139</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+</td><td>RAININ</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-10XLS+</td><td>RAININ</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+</td><td>RAININ</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+</td><td>RAININ</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>2024-10</td><td></td></tr></tbody></table>

从sézary综合征患者外周血中分离单个核细胞及cd4+ t细胞用于转录组分析

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）源于成熟皮肤归巢T细胞的转化和不受控制的增殖，其中蕈样肉芽肿（MF）和 Sézary 综合征（SS）是最常见的亚型。尽管已有大量研究致力于描述CTCL的基因表达、遗传改变及表观遗传异常，但MF/SS的分子发病机制仍不明确。MF是较为常见的CTCL亚型，主要累及皮肤，通常局限于皮肤；而&#160;SS是一种侵袭性白血病型CTCL，具有广泛的皮肤受累，其特征是肿瘤细胞主要分布于血液、皮肤和淋巴结。从临床实践出发，识别基因表达生物标志物&#160;在改善MF/SS诊断与治疗方面具有巨大潜力。事实上，近期的转录组学研究已通过正常T细胞与恶性T细胞之间基因表达差异，鉴定出潜在的诊断生物标志物，这有助于加深对SS生物学特性的理解，并揭示潜在的治疗靶点。本文描述了一种详细且可重复的操作流程，用于从确诊为SS患者的鲜全血中分离外周血单个核细胞，分选CD4+记忆T细胞（CD4+CD45RO+ T细胞），进行化学刺激，并制备适用于转录组分析的RNA，以发现新的预后分子标志物，进一步揭示疾病的病因学机制。采用化学激动剂刺激以激活核内调控，可更特异性地评估在动态转录调控和基因表达中起重要作用的信号通路，同时消除因细胞膜表面TCR抗原丢失所导致的上游信号缺陷带来的干扰。通过比较未刺激与刺激后SS T细胞的转录组数据，可揭示在静息未刺激细胞分析中无法察觉的功能性调控基因表达缺陷。此外，本方法还可推广应用于研究其他T细胞免疫疾病中的T细胞基因表达异常。

本方案包括从 Sézary 综合征（SS）血液中分离外周血单个核细胞（PBMC）、通过阴性选择法纯化 CD4+CD45RO+ T 细胞、刺激纯化的 T 细胞，以及提取总 RNA 用于转录组分析。图 1 描述了从全血中分离 PBMC 的流程。请注意，SS 患者 PBMC 的总产量会因起始血量及每位患者的循环肿瘤负荷而异。在本实验室中，SS PBMC 的平均产量为每毫升全血 4.6 × 106 个细胞（7 例 SS 患者范围为 1.85 × 106 – 3.25 × 107 个细胞/毫升）。分离所得 PBMC 的平均活率为 95‒99%。图 2 显示所选 CD4+CD45RO+ 记忆 T 细胞具有高纯度和高活率。从 SS PBMC 中获得 CD4+CD45RO+ T 细胞的平均产量为 75%（75.6% – 84%），而来自白细胞减少系统（LRS）装置获取的健康供者（ND）PBMC 中该细胞比例仅为 15.9%（3% – 30%）。通过本阴性选择方案获得的 CD4+CD45RO+ T 细胞，其活率和纯度始终维持在较高水平（图 3）。
我们先前将上述激活方案与微阵列技术结合，用于研究SS和ND T细胞转录组的功能变化，结果表明，与ND T细胞和PBMCs相比，SS记忆T细胞和SS PBMCs在细胞因子及其他免疫应答基因的表达水平上明显偏低19,22,23. 图4 显示多种细胞因子基因的强烈激活，包括 IL4, IL 10, IL13 和 IL22 在ND T细胞中存在，但在SS T细胞中不存在。SS T细胞中这种功能性基因表达缺陷此后已被其他研究团队证实24此外，许多在正常情况下于未致敏T细胞中不表达的基因，在SS T细胞中无论静息状态还是刺激后均呈现高表达（图 4）。这些包括先前描述的 SS 生物标志物基因 DNM3, PLS3, TOX 和 TWIST125,26,27以及 ANK1 和 SGCE，这些阳性生物标志物最初由我组首次报道。这些标志物在SS中高度表达，而在ND中不表达，且避免了与阴性生物标志物相关的技术陷阱。
<img alt="从血液中分离PBMC；密度梯度离心；白细胞分离示意图；RPMI培养基。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：从全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分离过程；抗体磁激活流程图，包含孵育步骤；免疫磁分离装置示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：从分离的外周血单个核细胞中进行CD4+记忆T细胞的阴性筛选。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞群体的流式细胞术图谱：SSC-A 对 FSC-A、活性、CD45RA 标记物分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：通过流式细胞术确认 CD4+CD45RO+ T 细胞的纯度。 淋巴细胞通过光散射设门（A），活淋巴细胞排除 eFluor780 活性染料染色（B），（C）代表未经选择的正常供体（ND）。负向选择在正常供体（ND）（D）和干燥综合征（SS）患者（E）中均获得了近乎纯的 CD45RO+ T 细胞群体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达热图、层次聚类；Z分数；RNA测序；对照与处理时间点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61470/61470fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：干燥综合征（SS）与非干燥症（ND）患者静息和活化CD4+CD45RO+记忆T细胞中的差异基因表达。 基因表达的Z分数以颜色梯度表示，红色代表高表达，绿色代表低表达。热图顶部的彩色条形表示细胞处理方式：模拟/对照处理（红色）、刺激2小时（蓝色）和刺激6小时（黄色）。与非干燥症（ND）T细胞相比，多个干燥综合征（SS）生物标志物基因在SS T细胞中高表达，而细胞因子基因表达水平较低。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61470/61470fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>密度介质</td>
			<td>Lymphocyte Separation Medium、Ficoll-Hypaque 或密度为 1.077–1.080 g/ml（20oC 时）的等效密度介质。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>1× Hank's 平衡盐溶液，4.2 mM NaHCO3，10 mM HEPES，pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP10F</td>
			<td>RPMI 1640 培养基，10% 经热灭活的胎牛血清（FBS），1× 青霉素-链霉素溶液，pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK 裂解缓冲液</td>
			<td>155 mM NH4Cl，10 mM KHCO3，0.1 mM Na2EDTA，无需调节 pH，应约为 7.3。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分选缓冲液</td>
			<td>1× HBSS，2% FBS，2 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）</td>
			<td>50 µg/ml 溶于 DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A23187 离子载体</td>
			<td>500 µg/ml 溶于 DMSO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：试剂。

我们介绍一种简单的方案，用于从确诊为塞扎里综合征患者的全血中分离外周血单个核细胞，随后富集CD4+ T细胞，用佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯和离子霉素A23187进行刺激，并提取RNA以进行转录组分析。

从Sézary综合征患者外周血中分离单个核细胞及CD4+ T细胞用于转录组分析

皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）源于成熟的皮肤归巢T细胞发生转化及不受控制的增殖，其中蕈样肉芽肿……

本方案使我们能够从患有该疾病的患者中分离出淋巴细胞T细胞，用于研究其分子缺陷和免疫缺陷。该方法可分离出具有疾病异常特征的活细胞，进而从这些患者中纯化RNA、DNA和蛋白质，从而帮助我们表征分子缺陷，以理解在发病机制中起重要作用的通路异常。该方法适用于外周血的分离，所获得的细胞可进一步分选，用于研究正常状态下的血细胞，以及具有免疫异常的疾病患者的血细胞。本实验操作将由来自我实验室的医学专业研究生研究员 Alanna 演示。采集外周血样本后，将其分装至五支含有抗凝剂的 10 毫升离心管中，随后将 10 至 15 毫升血液转移至已标记受试者编号的 50 毫升分离管中，并用 HBSS 将每管样本至少稀释两倍，总体积不超过 35 毫升。每管中缓慢且小心地加入约 13 毫升密度分离介质，形成下层液面；当移液器内液体即将排尽时即停止操作，以避免产生气泡。缓慢移除移液管，避免混匀血液与密度介质层，并小心将装有液体的分离管转移至离心机中，注意不要扰动各层。离心分离细胞后，除去血浆上层液中除最后10毫升以外的全部液体，然后仔细且缓慢地收集白膜层。将两个分离管中的白膜层合并至一个已标记的无菌50毫升离心管中，并用新鲜的HBSS将PBMC至少稀释两倍，每管总体积达到50毫升。收集完所有血沉棕黄层后，通过离心使细胞成团，尽可能吸除每支试管中的上清液。轻敲试管底部以松动沉淀物，并将沉淀物重新悬浮于每管每原始10毫升血液样本体积使用1至2毫升ACK裂解缓冲液中。精确孵育5分钟后，向每支试管中加入等体积或更大体积的HBSS以终止裂解反应，并将每管体积调整至50毫升。离心后，弃去上清液，汇集同一供体的细胞，并用新鲜的HBSS将体积补至50毫升，进行再次离心。然后将细胞重悬于10毫升37°C的RP10F培养基中，进行细胞计数。对于CD4+CD45RO+ T细胞的纯化，将细胞离心沉淀后，用分选缓冲液将PBMC稀释至每毫升含5×10⁷个细胞的浓度。将细胞转移至一个5毫升圆底聚苯乙烯管中，每1毫升样本加入50微升抗体混合液，轻轻混匀。室温孵育5分钟后，高速涡旋磁性颗粒30秒，然后每1毫升样本向管中加入50微升磁性颗粒，轻轻混匀。用新鲜的筛选缓冲液补足体积至2.5毫升，并轻轻混匀，将试管置于磁力架上静置2.5分钟。孵育结束后，取下磁铁，连续不断地将试管倒置，将富集的细胞悬液转移至新的无菌试管中。为提高细胞回收率，向试管中加入2.5毫升筛选缓冲液，在磁铁上继续孵育2.5分钟，注意不要扰动固定的磁珠，然后将洗涤液加入收集管中。使用血细胞计数板对活细胞数量进行计数，并通过流式细胞术确认细胞纯度。为激活细胞，将CD4+CD45RO+ T细胞调整至每毫升含5×10⁶个细胞的浓度，使用37°C的RP10F培养基，将细胞接种至适当大小的培养皿中。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的加湿培养箱中静置过夜。次日早晨，通过离心收集静置后的细胞，并将细胞沉淀重悬于37摄氏度的RP10F培养基中，浓度为每毫升5×10⁶个细胞。将细胞悬液分装至三个无菌螺口管中，每管含5×10⁶至10×10⁶个细胞，并在第二管中加入PMA，第三管中加入A23187，轻轻混匀以刺激细胞。向第一支试管中加入等体积的二甲基亚砜，作为溶剂对照，并将管盖稍松的试管放入培养箱中进行适当的活化孵育。孵育结束后，通过离心收集细胞，并尽可能多地弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。随后按照商品化RNA提取试剂盒的说明裂解细胞，并根据制造商的指导分离RNA。通过该阴性筛选方案获得的CD4+CD45RO+T细胞，其活力和纯度始终较高。从SS PBMC的白细胞减少系统腔室中获得的CD4+CD45RO+T细胞得率通常约为75%，而来自正常供体PBMC的得率约为16%。与正常供体T细胞和PBMC相比，SS记忆T细胞和SS PBMC对细胞因子及其他免疫应答基因的表达水平较低。此外，在静息状态及受到刺激后，许多在正常供体T细胞中通常不表达的基因在SS T细胞中均呈现高表达。良好的无菌操作技术和稳定一致的操作流程对于该技术的成功至关重要。在叠加Ficoll时，使用具有精细控制功能的自动移液器，并密切注意Ficoll叠加的速度，这一点也极为重要。采用该方法分离的细胞具有活性，可用于毒性研究、信号转导通路表征的分子生化研究、流式细胞术以及基因表达研究。该方法可用于从患有疾病（包括炎症性疾病及其他疾病，如癌症）的患者体内分离细胞，以进行直接研究。这些疾病的示例包括银屑病和特应性皮炎。

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科研

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Cancer Research

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本文介绍了一种利用聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PIPAAm）包被的微滤膜有效捕获活体循环肿瘤细胞（CTC）并实现温度响应性释放的实验方案。该方法可从患者血液中捕获CTC，并随后释放具有活性的CTC，用于后续的芯片外培养、分析与表征。...

从血液中捕获并释放可存活的循环肿瘤细胞

学习从Sézary综合征患者外周血中分离单核细胞并纯化CD4+ T细胞的方法，用于转录组学分析。该技术可获得高纯度活性细胞，支持基因表达和免疫机制研究。

从Sézary综合征患者外周血中分离单个核细胞及CD4+ T细胞用于转录组分析

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