从Sézary综合征患者外周血中分离单个核细胞及CD4+ T细胞用于转录组分析

本方案使我们能够从患有该疾病的患者中分离出淋巴细胞T细胞，用于研究其分子缺陷和免疫缺陷。该方法可分离出具有疾病异常特征的活细胞，进而从这些患者中纯化RNA、DNA和蛋白质，从而帮助我们表征分子缺陷，以理解在发病机制中起重要作用的通路异常。该方法适用于外周血的分离，所获得的细胞可进一步分选，用于研究正常状态下的血细胞，以及具有免疫异常的疾病患者的血细胞。

本实验操作将由来自我实验室的医学专业研究生研究员 Alanna 演示。采集外周血样本后，将其分装至五支含有抗凝剂的 10 毫升离心管中，随后将 10 至 15 毫升血液转移至已标记受试者编号的 50 毫升分离管中，并用 HBSS 将每管样本至少稀释两倍，总体积不超过 35 毫升。每管中缓慢且小心地加入约 13 毫升密度分离介质，形成下层液面；当移液器内液体即将排尽时即停止操作，以避免产生气泡。

缓慢移除移液管，避免混匀血液与密度介质层，并小心将装有液体的分离管转移至离心机中，注意不要扰动各层。离心分离细胞后，除去血浆上层液中除最后10毫升以外的全部液体，然后仔细且缓慢地收集白膜层。将两个分离管中的白膜层合并至一个已标记的无菌50毫升离心管中，并用新鲜的HBSS将PBMC至少稀释两倍，每管总体积达到50毫升。

收集完所有血沉棕黄层后，通过离心使细胞成团，尽可能吸除每支试管中的上清液。轻敲试管底部以松动沉淀物，并将沉淀物重新悬浮于每管每原始10毫升血液样本体积使用1至2毫升ACK裂解缓冲液中。精确孵育5分钟后，向每支试管中加入等体积或更大体积的HBSS以终止裂解反应，并将每管体积调整至50毫升。

离心后，弃去上清液，汇集同一供体的细胞，并用新鲜的HBSS将体积补至50毫升，进行再次离心。然后将细胞重悬于10毫升37°C的RP10F培养基中，进行细胞计数。对于CD4+CD45RO+ T细胞的纯化，将细胞离心沉淀后，用分选缓冲液将PBMC稀释至每毫升含5×10⁷个细胞的浓度。

将细胞转移至一个5毫升圆底聚苯乙烯管中，每1毫升样本加入50微升抗体混合液，轻轻混匀。室温孵育5分钟后，高速涡旋磁性颗粒30秒，然后每1毫升样本向管中加入50微升磁性颗粒，轻轻混匀。用新鲜的筛选缓冲液补足体积至2.5毫升，并轻轻混匀，将试管置于磁力架上静置2.5分钟。

孵育结束后，取下磁铁，连续不断地将试管倒置，将富集的细胞悬液转移至新的无菌试管中。为提高细胞回收率，向试管中加入2.5毫升筛选缓冲液，在磁铁上继续孵育2.5分钟，注意不要扰动固定的磁珠，然后将洗涤液加入收集管中。使用血细胞计数板对活细胞数量进行计数，并通过流式细胞术确认细胞纯度。为激活细胞，将CD4+CD45RO+ T细胞调整至每毫升含5×10⁶个细胞的浓度，使用37°C的RP10F培养基，将细胞接种至适当大小的培养皿中。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的加湿培养箱中静置过夜。次日早晨，通过离心收集静置后的细胞，并将细胞沉淀重悬于37摄氏度的RP10F培养基中，浓度为每毫升5×10⁶个细胞。将细胞悬液分装至三个无菌螺口管中，每管含5×10⁶至10×10⁶个细胞，并在第二管中加入PMA，第三管中加入A23187，轻轻混匀以刺激细胞。

向第一支试管中加入等体积的二甲基亚砜，作为溶剂对照，并将管盖稍松的试管放入培养箱中进行适当的活化孵育。孵育结束后，通过离心收集细胞，并尽可能多地弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。随后按照商品化RNA提取试剂盒的说明裂解细胞，并根据制造商的指导分离RNA。

通过该阴性筛选方案获得的CD4+CD45RO+T细胞，其活力和纯度始终较高。从SS PBMC的白细胞减少系统腔室中获得的CD4+CD45RO+T细胞得率通常约为75%，而来自正常供体PBMC的得率约为16%。与正常供体T细胞和PBMC相比，SS记忆T细胞和SS PBMC对细胞因子及其他免疫应答基因的表达水平较低。

此外，在静息状态及受到刺激后，许多在正常供体T细胞中通常不表达的基因在SS T细胞中均呈现高表达。良好的无菌操作技术和稳定一致的操作流程对于该技术的成功至关重要。在叠加Ficoll时，使用具有精细控制功能的自动移液器，并密切注意Ficoll叠加的速度，这一点也极为重要。

采用该方法分离的细胞具有活性，可用于毒性研究、信号转导通路表征的分子生化研究、流式细胞术以及基因表达研究。该方法可用于从患有疾病（包括炎症性疾病及其他疾病，如癌症）的患者体内分离细胞，以进行直接研究。这些疾病的示例包括银屑病和特应性皮炎。