Name: 使用洗涤剂和酶无酶方法从整个组织进行核分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 了解无洗涤剂和酶的单细胞核分离方法，用于斑马鱼脑组织的高通量表观基因组和转录组分析。该快速方案可在30分钟内获得完整细胞核，减少技术噪音并提高下游应用准确性。

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感谢Sabine Costagliola博士和Singh实验室成员对本文手稿的评论。本工作由比利时科学基金研究基金会（Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS）资助，资助编号为34772792 – MISU，授予S.P.S.。

以下所有操作均按照布鲁塞尔自由大学（Université Libre de Bruxelles (ULB)）的机构规定以及国家伦理和动物福利指南与法规进行，并已获得布鲁塞尔自由大学动物福利伦理委员会（CEBEA）的批准（方案编号 578N-579N）。
1. 组织解剖前的准备
<ol>
	<li>在 PBS 中配制 0.2% 三卡因溶液，用于处死斑马鱼。将该溶液置于冰上预冷。</li>
	<li>准备一个 30 mm 的培养皿，用于切碎组织。</li>
	<li>准备冰浴的 1× PBS（每份组织样本 10 mL）。</li>
	<li>将离心机预冷至 4 °C。</li>
	<li>进行细胞核分离时，使用无去污剂的细胞核分离试剂盒（材料表）。</li>
	<li>在开始实验前，将试剂盒中提供的缓冲液 A 和缓冲液 B 置于冰上预冷至少 30 分钟。</li>
	<li>为便于处理分离的细胞核，需用 5% BSA 溶液对塑料器皿（如离心管和移液器吸头）进行包被。配制方法：将 2 g BSA 溶解于 40 mL PBS 中。用 5% BSA 包被塑料器皿可减少细胞核黏附于塑料表面，从而提高细胞核回收率。</li>
	<li>通过反复吸取 5% BSA 溶液 2–3 次对移液器吸头进行包被，然后在空气中干燥 2 小时。每份样本准备 10 个包被好的塑料吸头。</li>
	<li>用 5% BSA 溶液填充用于收集细胞核的离心管，倒置管子 3 次以确保包被均匀。倒出溶液后，将管子倒置放在干净的纸巾上晾干 2 小时。每份样本使用试剂盒中提供的一根收集管进行包被。此外，为流式细胞分选（FACS）后的细胞核收集，另准备包被好的 1.5 mL 离心管。 
	注意：强烈推荐使用玻璃吸头替代塑料移液器吸头，以最大程度减少细胞核黏附。</li>
</ol>
2. 斑马鱼脑组织的解剖
<ol>
	<li>为处死斑马鱼，准备一个含有25 mL冰上预冷Tricaine溶液的90 mm培养皿。</li>
	<li>使用捞网小心地将斑马鱼从养殖缸中取出，并放入培养皿中。</li>
	<li>将鱼置于Tricaine溶液中5分钟以实施安乐死。</li>
	<li>使用锋利的剃刀刀片将动物头部切除。</li>
	<li>用镊子轻轻打开颅骨，并从颅骨的腹侧和背侧去除软组织、皮肤和骨骼。</li>
	<li>小心地将脑组织转移至一个新的含有冰上预冷PBS的30 mm培养皿中。</li>
	<li>使用剃刀刀片将脑组织切成小块，以便于样品在离心柱上的加样。</li>
</ol>
3. 单核分离
<ol>
	<li>将剪碎的组织转移至核分离试剂盒中提供的滤器卡盒中，并加入 200 µL 冷的缓冲液 A 以使组织敏感化。使用试剂盒提供的塑料棒研磨组织 2 分钟。</li>
	<li>加入 300 µL 冷的缓冲液 A，并将滤器卡盒敞口置于冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>盖上卡盒盖子，通过倒置管子 5 次重悬组织。</li>
	<li>在 16,000 x g 条件下离心 30 秒。在此步骤中，细胞在通过滤膜时发生破裂，并受到高速离心力作用。穿滤液中含有完整的细胞核，这些细胞核在管底形成沉淀。</li>
	<li>弃去滤器，并通过剧烈涡旋振荡 10 秒重悬沉淀。</li>
	<li>以 500 x g 离心 3 分钟使细胞核沉淀。小心弃去上清液，因为细胞核沉淀无色。</li>
	<li>将沉淀重悬于 0.8 mL 冷的缓冲液 B 中，并在 600 x g 条件下离心 10 分钟。在此步骤中，细胞核与膜碎片分离。所得无色沉淀即为分离的细胞核。</li>
	<li>将分离的细胞核重悬于 500 µL 含 5% BSA 的 PBS 中。将细胞核悬液置于冰上保存，待定量后进行 FACS 分析。</li>
</ol>
4. 细胞核形态的可视化
<ol>
	<li>通过 Hoechst 染色确认细胞核形态。具体操作为：使用经 BSA 包被的枪头，取 100 µL 单细胞核悬液至新离心管中。为染色细胞核，加入 0.1 µL Hoechst（1 mg/mL），轻轻涡旋混匀。</li>
	<li>将细胞核悬液转移至玻璃底培养皿中用于成像。</li>
	<li>使用荧光显微镜，设置激光激发波长约为 405 nm（紫色），对细胞核进行成像。</li>
</ol>
5. 基于流式细胞分选的细胞核富集
<ol>
	<li>进行FACS之前，使用40 µm细胞滤筛将细胞核过滤至BSA包被的试管中。</li>
	<li>用含5% BSA的PBS稀释过滤后的悬液，终体积为1,000 µL。</li>
	<li>标记两个圆底FACS管，分别标注为“对照”和“染色”。“对照”管中将含有未染色的细胞核，而“染色”管中将加入Hoechst染色的细胞核。</li>
	<li>使用BSA包被的移液枪头将250 µL细胞核悬液转移至“对照”管中。</li>
	<li>将剩余的750 µL溶液转移至标记为“染色”的FACS管中，并加入1 µL Hoechst染料以染色细胞核。通过缓慢涡旋混匀。</li>
	<li>将未染色的对照样品上机至细胞分选仪，记录5000个事件。</li>
	<li>将染色样品上机并记录5000个事件。</li>
	<li>设置FACS门控以识别单个细胞核。可通过比较对照样品与染色样品之间的Hoechst荧光信号来选择细胞核。</li>
	<li>从“染色”管中分选Hoechst阳性细胞核至新的含有50 µL含5% BSA的PBS的1.5 mL离心管中。 
	注：根据下游应用的需求，分离的细胞核可收集至所需的介质中。</li>
</ol>

<ol><li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).</li>
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<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).</li>
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<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Birnie, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Nuclei+from+Animal+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture.</a> Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).</li>
<li>Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+intact+mitochondria+and+nuclei+from+the+same+homogenate%2C+and+the+influence+of+mitochondrial+destruction+on+the+properties+of+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1 (2), 139-153 (1955).</li>
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<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents%3A+Triton+X-100%2C+Tween-20%2C+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More.</a> Materials and Methods. 3, (2013).</li>
<li>Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+Optimised+methodology+for+isolation+of+nuclei+from+leaves+of+species+in+the+Solanaceae+and+Rosaceae+families%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families.</a> Plant Methods. 9 (1), 31(2013).</li>
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</ol>

作者无利益冲突。本文开放获取的费用由美国Invent Biotechnologies Inc.支付。

在单细胞分辨率下对转录组和表观基因组进行分析，已彻底改变了生物系统的研究方式。针对实体组织的单细胞研究依赖于将器官解离为单个细胞或细胞核。解离是一种具有破坏性的操作，可能引入技术性人为假象，从而妨碍对生物系统真实状态的准确刻画5,6。例如，酶解法可能损伤具有复杂形态的细胞（如神经元或足细胞），并诱导应激反应和热休克反应相关基因的表达7,12。此外，解离过程中使用去垢剂可能导致核膜破裂并引发聚集现象23,25。因此，优化解离流程以获得最高质量的单细胞或单细胞核悬液，对于高通量分析实验的成功至关重要。
本文展示了一种无需使用去污剂和酶的细胞核分离方法，可在20分钟内从斑马鱼脑组织中提取完整的细胞核。该方案获得的细胞核具有典型的形态和良好的完整性（图2）。从一个重约6 mg的斑马鱼脑组织中，通过血细胞计数板计数，可获得总计约60,000个细胞核。所分离的细胞核可用于多种下游应用，包括单核RNA测序（snRNA-seq）、ATAC-seq以及免疫染色。分离得到的细胞核样品中可能含有来自细胞质组分的交叉污染，特别是内质网和线粒体成分。对于高通量分析实验，强烈建议清除细胞碎片，尤其是线粒体。流式细胞术（图3）可作为细胞核纯化的有效手段。此外，也可采用蔗糖梯度离心法去除碎片。
该方案已在小鼠甲状腺组织上进行测试（数据未显示），结果与斑马鱼脑组织相似。总体而言，该方案为单细胞核悬液的制备提供了一种稳健、可重复且通用的方法，有助于简化高通量分析实验的实验流程。

单细胞RNA测序（scRNA-Seq）和ATAC-seq是研究复杂生物系统的多功能工具，可在单细胞分辨率下进行分析。这些技术被广泛用于定义细胞亚型和状态、基因调控网络以及评估细胞异质性。进行scRNA-seq的前提是通过组织解离制备单细胞悬液。由于不同组织的细胞外基质组成和机械特性存在差异，各自需要优化解离方案以制备单细胞悬液。
将组织解离为单细胞通常需要在37 °C下使用消化酶（包括胶原酶、分散酶或胰蛋白酶）进行处理1,2,3,4。由于转录机制在37 °C时仍保持活性，酶解过程可能引入mRNA表达的人为假象和噪声5,6。值得注意的是，长时间孵育可能以非均一的方式诱导应激响应基因和热休克反应，从而导致实验中的技术变异性7。
制备单细胞悬液的另一个缺点是难以获得具有复杂形态的、有活力且完整的细胞类型。特别是神经元、脂肪细胞和足细胞的分离具有挑战性8,9,10,11。例如，Wu 及其同事证明了在成年小鼠肾脏的单细胞RNA测序谱中缺乏肾小球足细胞12。关于从脑组织中回收相互连接的神经元，也存在类似的非理想结果8,13,14。总之，解离方案可能引入检测偏差，倾向于更容易解离的细胞类型，从而导致对器官细胞结构的错误表征。
为了克服单细胞RNA测序（scRNA-Seq）样本制备过程中引入的技术噪声和偏差，分离并分析细胞核提供了一种有吸引力的替代方案。由于不同细胞类型的细胞核形态相似，细胞核的分离避免了因细胞形态复杂而难以获得完整且具有活性的单细胞的问题。例如，Wu 及其同事利用成年小鼠肾脏的单细胞核RNA测序（snRNA-Seq）成功实现了肾小球足细胞的测序分析，而这些细胞在scRNA-Seq中未能被检测到12。有趣的是，单细胞与单细胞核RNA测序的比较研究提示，snRNA-Seq可减少应激和热休克反应相关基因的诱导表达12。这些研究还表明，两种方法检测到的基因之间具有高度相关性。然而，最近一项针对人类小胶质细胞的研究未能检测到阿尔茨海默病中的基因激活现象15。因此，在某些特定情况下，snRNA-Seq是scRNA-Seq的合适替代方法16,17。此外，细胞核分离还可用于单细胞ATAC-Seq，从而提供有关单个细胞中开放染色质区域的信息。
细胞核分离的实验方案包括三个主要步骤：i）利用去垢剂裂解细胞膜以释放细胞核；ii）使用Dounce匀浆器对组织进行匀浆；iii）通过梯度离心或流式细胞术富集细胞核并去除细胞碎片18,19,20,21,22。其中，前两个步骤依赖于组织类型，需根据经验进行优化。去垢剂浓度过低会导致细胞膜部分破裂，从而降低细胞核从组织中释放的效率23；而过高的去垢剂浓度或剧烈的匀浆处理则会引起核膜破裂，造成细胞核丢失24,25。破裂的细胞核容易聚集形成团块，若未及时去除，可能在后续的分析实验中产生假象。
为避免与去垢剂优化相关的细胞核分离问题，我们介绍一种无需去垢剂且基于离心柱的完整细胞核分离方案，适用于新鲜样品。该方案可在20分钟内从整个器官中获得细胞核，最大限度减少人为转录的诱导。分离得到的细胞核可通过流式细胞分选（FACS）进行富集，用于单核RNA测序（single-nuclei RNA-Seq）和ATAC-seq分析，提供一种简单通用的方法，实现稳定、可重复的高通量分析。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Carl Roth</td><td>90604-29-8</td><td>白蛋白第五组分</td></tr><tr><td>细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSAria III</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Sartorius</td><td>A-14C</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管（1.5 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管（15 mL）</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>聚丙烯离心管</td></tr><tr><td>Falcon 管（5 mL）</td><td>Corning</td><td>352052</td><td>聚苯乙烯圆底试管</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi 细胞筛（40 &amp;mu;m）</td><td>Sigma</td><td>BAH136800040</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>玻璃瓶（250 mL）</td><td>VWR</td><td>215-1593</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD3510-100</td><td>Fluorodish 35 mm</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管</td><td>VWR</td><td>612-1701</td><td></td></tr><tr><td>玻璃移液管接头</td><td>Carl Roth</td><td>388.1</td><td>移液辅助器 pi-pump 2500</td></tr><tr><td>Hoechst 染色液</td><td>Abcam</td><td>ab228551</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Minute 无去污剂细胞核提取试剂盒</td><td>Invent Biotechnologies</td><td>NI-024</td><td></td></tr><tr><td>PBS（10X）</td><td>ThermoFisher</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（30 mm）</td><td>FisherScientific</td><td>11333704</td><td>Pyrex</td></tr><tr><td>培养皿（90 mm）</td><td>Corning</td><td>758-10178-CS</td><td>Gosselin</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>VWR</td><td>89079</td><td>10 &amp;mu;L、200 &amp;mu;L、1000 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td>Pipetman</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Swann-Morton</td><td>7981809</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（Tricaine methane sulfonate）</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex-Genie 2</td></tr></tbody></table>

使用去污剂和酶解-free方法从完整组织中分离细胞核

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

高通量转录组和表观基因组分析需要制备单细胞或单细胞核悬液。该悬液的制备需满足&#160;完整细胞或细胞核的分离涉及解离和透化步骤，这些步骤可能引入不必要的噪声和不可控的损伤。特别是某些细胞类型（如神经元）难以有效解离为单个细胞。此外，为释放细胞核而进行的细胞膜透化过程通常需要通过反复试错进行优化，耗时较长、劳动强度大且成本较高。为提高高通量测序样品制备的稳健性和可重复性，本文介绍一种快速、无需酶解和去垢剂的基于层析柱的细胞核分离方法。该方案可在20分钟内高效地从整只斑马鱼脑组织中分离出细胞核。所获得的细胞核具有完整的核形态，且不易发生聚集。进一步通过流式细胞术可实现细胞核的富集及细胞碎片的清除，适用于后续实验。该方法适用于软组织和培养细胞，提供了一种简便且易于操作的样品制备方案，可用于高通量分析，简化了单细胞核RNA测序（single-nuclei RNA-seq）和ATAC-seq实验所需的操作步骤。

——上述方案用于直接从斑马鱼脑组织制备单细胞核悬液。该分离过程通常需要20分钟，且无需使用去污剂或消化酶。文中提供了总结该方案各个步骤的示意图（图1），可供打印以作为操作指导。
<img alt="鱼类组织处理示意图；包括匀浆、离心和上清液处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：基于去垢剂-free离心柱法分离细胞核的示意图。 
从新鲜斑马鱼脑组织中提取细胞核过程中各步骤的图示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
细胞核形态的可视化
为定性确认细胞核形态，使用Hoechst对分离的细胞核进行染色，并通过荧光显微镜观察。细胞核呈现完整、圆形且彼此分离良好（图2）。重要的是，未见细胞核聚集现象，表明细胞核膜未发生破裂。
<img alt="荧光核显微图像；10 µm 比例尺；蓝色染色；细胞生物学可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：斑马鱼脑组织中单核的分离。 
Hoechst 染色细胞核的荧光显微图像，显示其完整的形态结构。比例尺：10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
基于FACS的完整细胞核富集
通过流式细胞术对分离的细胞核进行富集并去除细胞碎片，方法是根据Hoechst荧光信号的存在进行设门。Hoechst信号在使用紫色405 nm激光（Brilliant Violet 421 – BV421）激发时被检测到。未染色的细胞核显示背景荧光（图3A，补充图1A），而染色后的细胞核则表现出强烈的荧光信号（图3B，补充图1B）。如图3C所示，未染色和Hoechst染色的细胞核在紫色通道中明显分离。
<img alt="流式细胞术直方图；数据分析；BV421-A 事件计数；实验比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：分离的细胞核在流式细胞术中显示出强而特异的Hoechst荧光信号。 
单细胞核悬液的直方图，显示Hoechst染色的分布情况。Hoechst由紫色激光（405 nm）激发（Brilliant Violet 421 – BV421）。未染色样本（A）的信号范围为100-103，而Hoechst染色的细胞核（B）发出的信号在103-105范围内。未染色（灰色）和染色（蓝色）样本荧光强度叠加图（C）显示两个群体之间有明显分离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="散点图和直方图的流式细胞术分析；细胞核鉴定、数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61471/61471supfig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
补充图1：分离细胞核的流式细胞术设门策略。 分离细胞核悬液的代表性流式图。采用前向散射光和激发Hoechst（405 nm）的紫激光BV421对分离的细胞核进行分析。未染色样本（A）的BV421信号分布在100-103范围内。在13130个事件中，根据FSC-A识别出141个单细胞核事件（占总数的1.07%），而基于BV421信号未检测到未染色细胞核事件（占总数的0%）。Hoechst染色的细胞核（B）其BV421信号分布在103-105范围内。在50000个事件中，根据FSC-A识别出2418个单细胞核事件（占总数的4.84%），基于BV421信号识别出2414个Hoechst阳性细胞核事件（占总数的4.83%）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61471/61471supfig01.jpg" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>

单个细胞核的分离依赖于细胞膜的解离和基于去垢剂的透化处理，这些步骤需要优化，且容易引入技术性假象。我们展示了一种无需去垢剂和酶的快速分离完整细胞核的方案，可直接从完整组织中获取适用于单细胞核RNA测序（snRNA-Seq）或ATAC-seq的细胞核。

高通量转录组和表观基因组分析需要制备单细胞或单细胞核悬液。该悬液的制备……

制备单细胞或单细胞核悬液是进行高通量转录组和表观基因组分析的关键步骤。本方案提供了一种简单、可重复且通用的单细胞核分离方法。与其他需要使用去污剂进行细胞核分离的方法不同，本方案基于柱式分离技术，无需使用去污剂和酶。可在不到30分钟内完成细胞核的分离。我们的方案简化了细胞核分离过程，提供了一种从难以解离的组织制备单细胞核悬液的可靠方法。首先，将无去污剂细胞核提取试剂盒中的缓冲液A和缓冲液B置于冰上预冷至少30分钟。用5% BSA溶液对离心管和移液器吸头进行包被处理，以提高细胞核的回收率。包被移液器吸头时，用其反复吸取5% BSA溶液两到三次，并在空气中干燥两小时。为包被试管，向其中加入BSA并倒置三次。移除溶液后，将试管倒置在干净的纸巾上，室温晾干两小时。每个样本需包被一个收集管和一个1.5毫升试管。使用镊子轻轻打开颅骨，并从颅骨的腹侧和背侧去除软组织、皮肤和骨骼。然后将脑组织轻轻转移至含有冰冷 PBS 的 30 毫米培养皿中，用刀片将脑组织切碎成小块。为分离单个细胞核，将切碎的组织转移至细胞核分离试剂盒提供的滤管中，去除多余液体后加入 200 微升冰冷的缓冲液 A。用塑料研磨棒研磨组织 2 分钟。向过滤柱中加入 300 微升预冷的缓冲液 A，敞盖后在冰上孵育 10 分钟。然后盖上柱子，通过倒置管体 5 次重悬组织。将样品管在 16,000 × g 离心 30 秒以裂解细胞。流穿液中含有完整的细胞核，会在管底形成无色沉淀。弃去滤膜，然后通过剧烈涡旋振荡10秒重新悬浮沉淀。再次以500 × g离心3分钟，使细胞核沉淀。然后小心弃去上清液。用移液器将沉淀重悬于 0.8 毫升预冷的缓冲液 B 中，反复吹打两到三次，随后以 600 × g 离心 10 分钟，使细胞核与膜碎片分离。小心弃去上清液。将分离的细胞核重悬于500微升含5% BSA的PBS中，置于冰上直至进行流式细胞分选（FACS）。为通过HEX染色确认细胞核形态，使用BSA包被的枪头取100微升单细胞核悬液转移至新离心管中。加入0.1微升HEX染料，轻轻涡旋混匀以对细胞核进行染色。将细胞核悬液转移至玻璃底培养皿中，并使用激光激发波长为405纳米的荧光显微镜观察细胞核。进行FACS前，用40微米细胞滤网将细胞核过滤至经BSA包被的离心管中。通过加入含5% BSA的PBS，将过滤后的悬液稀释至终体积为1,000微升。用BSA包被的移液枪头吸取250微升细胞核悬液，加入标记为“对照”的圆底FACS管中。将剩余的750微升溶液转移至标记为“染色”的FACS管中，并加入1微升HEX染料以染色细胞核。随后通过缓慢涡旋混匀。将未染色的对照样品加入细胞分选仪，记录 5,000 个事件。然后加入染色样品，记录 5,000 个事件。绘制 FACS 门控以鉴定单个细胞核。可通过比较对照样本与染色样本之间的HEX荧光信号来筛选细胞核。然后将染色管中HEX阳性的细胞核分选至一个新的含有50微升含5% BSA的PBS的1.5毫升离心管中。本方案用于直接从斑马鱼脑组织制备单细胞核悬液。分离的细胞核经HEX染色后通过荧光显微镜观察。细胞核形态完整、呈圆形且分布均匀。重要的是，未见细胞核聚集现象。通过检测HEX荧光信号的存在，利用流式细胞术对分离的细胞核进行富集。未染色的细胞核显示背景荧光，而染色的细胞核则表现出强烈的荧光信号。未染色和染色的细胞核在紫色通道中明显分离。在进行该实验方案时，需注意单个细胞核容易黏附在塑料材料上。为防止细胞核的潜在损失并提高实验效率，强烈建议对塑料材料进行基础包被处理。分离得到的单细胞核悬液可进一步用于单细胞核RNA测序。该技术能够揭示复杂生物系统中的细胞异质性，并有助于定义细胞亚群及基因调控网络。采用去污剂和酶免法可记录样本制备过程中引入的技术噪声和偏差。该方法已开发出一种简化且便于操作的单核分离流程。

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科研

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生物学

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