使用去污剂和酶解-free方法从完整组织中分离细胞核

制备单细胞或单细胞核悬液是进行高通量转录组和表观基因组分析的关键步骤。本方案提供了一种简单、可重复且通用的单细胞核分离方法。与其他需要使用去污剂进行细胞核分离的方法不同，本方案基于柱式分离技术，无需使用去污剂和酶。

可在不到30分钟内完成细胞核的分离。我们的方案简化了细胞核分离过程，提供了一种从难以解离的组织制备单细胞核悬液的可靠方法。

首先，将无去污剂细胞核提取试剂盒中的缓冲液A和缓冲液B置于冰上预冷至少30分钟。用5% BSA溶液对离心管和移液器吸头进行包被处理，以提高细胞核的回收率。包被移液器吸头时，用其反复吸取5% BSA溶液两到三次，并在空气中干燥两小时。

为包被试管，向其中加入BSA并倒置三次。移除溶液后，将试管倒置在干净的纸巾上，室温晾干两小时。每个样本需包被一个收集管和一个1.5毫升试管。

使用镊子轻轻打开颅骨，并从颅骨的腹侧和背侧去除软组织、皮肤和骨骼。然后将脑组织轻轻转移至含有冰冷 PBS 的 30 毫米培养皿中，用刀片将脑组织切碎成小块。为分离单个细胞核，将切碎的组织转移至细胞核分离试剂盒提供的滤管中，去除多余液体后加入 200 微升冰冷的缓冲液 A。用塑料研磨棒研磨组织 2 分钟。

向过滤柱中加入 300 微升预冷的缓冲液 A，敞盖后在冰上孵育 10 分钟。然后盖上柱子，通过倒置管体 5 次重悬组织。将样品管在 16,000 × g 离心 30 秒以裂解细胞。

流穿液中含有完整的细胞核，会在管底形成无色沉淀。弃去滤膜，然后通过剧烈涡旋振荡10秒重新悬浮沉淀。再次以500 × g离心3分钟，使细胞核沉淀。

然后小心弃去上清液。用移液器将沉淀重悬于 0.8 毫升预冷的缓冲液 B 中，反复吹打两到三次，随后以 600 × g 离心 10 分钟，使细胞核与膜碎片分离。小心弃去上清液。

将分离的细胞核重悬于500微升含5% BSA的PBS中，置于冰上直至进行流式细胞分选（FACS）。为通过HEX染色确认细胞核形态，使用BSA包被的枪头取100微升单细胞核悬液转移至新离心管中。加入0.1微升HEX染料，轻轻涡旋混匀以对细胞核进行染色。

将细胞核悬液转移至玻璃底培养皿中，并使用激光激发波长为405纳米的荧光显微镜观察细胞核。进行FACS前，用40微米细胞滤网将细胞核过滤至经BSA包被的离心管中。通过加入含5% BSA的PBS，将过滤后的悬液稀释至终体积为1,000微升。

用BSA包被的移液枪头吸取250微升细胞核悬液，加入标记为“对照”的圆底FACS管中。将剩余的750微升溶液转移至标记为“染色”的FACS管中，并加入1微升HEX染料以染色细胞核。随后通过缓慢涡旋混匀。

将未染色的对照样品加入细胞分选仪，记录 5,000 个事件。然后加入染色样品，记录 5,000 个事件。绘制 FACS 门控以鉴定单个细胞核。

可通过比较对照样本与染色样本之间的HEX荧光信号来筛选细胞核。然后将染色管中HEX阳性的细胞核分选至一个新的含有50微升含5% BSA的PBS的1.5毫升离心管中。本方案用于直接从斑马鱼脑组织制备单细胞核悬液。

分离的细胞核经HEX染色后通过荧光显微镜观察。细胞核形态完整、呈圆形且分布均匀。重要的是，未见细胞核聚集现象。

通过检测HEX荧光信号的存在，利用流式细胞术对分离的细胞核进行富集。未染色的细胞核显示背景荧光，而染色的细胞核则表现出强烈的荧光信号。未染色和染色的细胞核在紫色通道中明显分离。

在进行该实验方案时，需注意单个细胞核容易黏附在塑料材料上。为防止细胞核的潜在损失并提高实验效率，强烈建议对塑料材料进行基础包被处理。分离得到的单细胞核悬液可进一步用于单细胞核RNA测序。该技术能够揭示复杂生物系统中的细胞异质性，并有助于定义细胞亚群及基因调控网络。

采用去污剂和酶免法可记录样本制备过程中引入的技术噪声和偏差。该方法已开发出一种简化且便于操作的单核分离流程。