Na⁺/K⁺泵在节律性簇状放电中的作用：基于建模与动态钳分析的研究

动态钳技术可以修改或向神经元中引入任意的膜电流。我们在医用水蛭的活体心脏中间神经元中引入并修改了钠钾泵电流和持续性钠电流。利用动态钳技术，可以通过按键实时完全控制引入神经元的任何电流的动力学特性和幅度。

实时交互系统（如动态钳技术）的发展是所有脑机接口研究的基础。在神经元和神经网络电活动的细胞层面研究中，所有方面都有可能从动态钳技术的应用中受益。该技术的主要挑战在于建立神经元的实时模型，以及针对所选研究神经元校准动态钳的调节参数。

为了从医用水蛭的腹神经索中分离第7神经节，将一个黑色树脂制解剖皿中加入约一厘米厚的冷生理盐水，该生理盐水由氯化钠、氯化钾、氯化钙、D-葡萄糖和HEPES溶于去离子水中配制而成，并将经低温麻醉的水蛭背侧朝上固定于解剖皿内。使用体视显微镜在20倍放大倍数下，配合斜向导光照明，并用5毫米弹簧剪刀在身体前段三分之一区域的体壁上做一条至少三厘米长的纵向切口。用大头针将体壁组织向两侧拉开，以暴露内部器官，并吸除血液以获得更清晰的视野。

分离单个中段神经节7。使用5号精细镊子辅助引导切割并夹住窦腔，用剪刀切开容纳神经索的窦腔，注意沿背侧和腹侧切开窦腔。保持窦腔与从神经节发出的两条侧向神经根相连，切断头侧和尾侧的联合神经束，将神经节从体内取出，并在神经根自窦腔伸出的外侧位置将其切断。

使用旧的钝头5号镊子将窦条和疏松组织固定在衬有透明树脂的培养皿中，腹面朝上，并用截短的昆虫针固定。尽可能远离神经节处固定头端和尾端连接部，并牢固固定神经根。将体视显微镜的放大倍数增加至40倍或更高，并调节斜照明，使神经节腹面神经外膜下方的神经元胞体清晰可见。

使用显微剪刀，从神经瘤一侧根部之间的疏松腓肠神经鞘处开始剪开，沿横向继续向另一侧剪开，注意保持剪刀刀片位于表层，避免损伤鞘膜下方的神经元胞体。从侧向切口沿中线向尾侧做一类似的浅层切口，用精细的5号镊子一次将一侧尾端的鞘膜瓣轻轻拉开，使其与神经瘤分离，以便将其切除。当两个瓣膜均被移除后，两个心脏中间神经元应完全暴露。

将培养皿放入记录装置中，并以每分钟五毫升的流速在室温下用生理盐水灌流样本。为了在记录装置中识别中间神经元，选择50至100倍的放大倍数，采用下方暗场照明，根据HN7神经元在第七中段神经节后外侧的典型位置，定位双侧成对中的一个HN7神经元。接着，使用显微操作器将充满2摩尔醋酸钾和20毫摩尔氯化钾的尖锐微电极移至目标细胞体附近，并使用神经生理学电位仪持续监测所记录的电位。

将该电位设为零毫伏，使用操纵器沿微电极长轴缓慢推进，将其插入神经元。启用100毫秒的电位计蜂鸣功能，直至观察到膜电位出现负向偏移及强烈的放电活动。将电位计设为至少3千赫兹的断续电流钳模式，以便在向神经元施加电流的同时记录膜电位。

使用示波器监测电极状态，并使用稳流注射器注入 -0.1 纳安的稳定电流，持续一到两分钟，以稳定记录。HN 7 神经元可通过其特征性的峰电位波形和微弱的簇状放电活动来识别。对于动态钳导电性和电流的实现，需打开为数字信号处理板定制的动态钳软件程序。

在模型运行的同时，将泵电流的最大值设为 0.1 至 0.2 纳安，并逐步增加持续性钠电流的最大电导，直至出现规律性簇状放电。以 0.1 纳安为步长系统性地改变泵电流的最大输出值，同时以 1 纳西门子为步长改变持续性钠电流的最大电导，评估这些变化对动作电位频率、簇间间隔、簇持续时间和簇周期的影响。将钠电流的最大电导固定于某一特定值，以 1 纳安为步长扫描一系列最大泵电流值，以支持规律性簇状放电活动；随后将钠电导的固定值增加 1 纳西门子，并再次扫描另一组最大泵电流值。

针对每一对已设定的参数，需采集至少包含八个簇放电的数据，以便可靠地计算出峰电位频率、簇间间隔、簇持续时间及簇周期的平均值。随后，按照上述方法再采集多个其他神经元的数据，以生成复合图。在此模型中，随着胞内钠离子浓度围绕基线水平变化，外向泵电流在整个簇放电周期中持续振荡。

这种泵电流在爆发期的爆发终止过程中起重要作用。泵电流产生的超极化在爆发间期激活了超极化激活的内向电流。实时心脏节律神经元模型表明，心脏节律神经元中的持续性钠电流导致了大部分钠离子内流，显著影响细胞内钠离子浓度，从而影响泵电流。

由于持续性钠电流在相对负的膜电位下仍具有活性，因此在簇状放电和簇间静息期间，它均会对抗钠钾泵电流。如图所示，通过动态钳技术同时引入持续性钠电流和钠钾泵电流，可恢复心脏中间神经元的持续性簇状放电。初步结果表明，这两种电流之间存在强烈的复杂相互作用，可通过该模型进一步探究。

实验的成功取决于神经节良好的去鞘处理，以及对微电极精确的驱动、穿刺和振动操作。我们通过引入一种依赖钠离子的泵电流来增强动态钳技术，该电流通过估算细胞内离子浓度来计算得出。此类估算可用于向神经元注入任意依赖离子的电流。