Name: 近植入阶段人类胚胎中特罗福细胞的单细胞集合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 了解人类胚胎植入期滋养层细胞的单细胞收集方法，用于研究早期胎盘形成和着床机制。该技术有助于揭示早期妊娠失败的原因并改善生殖健康。

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我们谨向科罗拉多生殖医学中心（CCRM）众多慷慨捐赠胚胎用于研究的患者表示感谢。同时，我们还要感谢Karen Maruniak以及CCRM临床实验室在hCG样本处理方面的协助，感谢Sue McCormick及其CCRM临床IVF胚胎学团队在胚胎收集、保存、追踪和捐赠方面提供的帮助。本研究由CCRM提供内部资金支持。

所有人类胚胎均已获得捐赠者同意，可用于科学研究。扩展人类胚胎培养的方案已获得西方机构审查委员会（研究编号：1179872）批准，并遵循国际指南。任何对人类胚胎的使用，均须由采用本方案的研究机构相关的适当伦理与管理机构进行审查。
1. 准备
<ol>
	<li>在胚胎复苏前一天，于无菌超净工作台中配制培养基并制备复苏培养板。
	<ol>
		<li>准备2 mL含10%（v/v）血清蛋白替代物（SPS）的囊胚培养基（BM）。 
		注意：&#160;囊胚培养基可能含有或不含添加的蛋白质。本实验所用培养基需额外添加10%指定的白蛋白。请参照生产商说明，了解该添加成分的具体要求。所有培养基在平衡前均应使用连接无菌注射器的无菌0.22 μM滤器进行过滤。</li>
		<li>在两个中心井器官培养洗涤皿中各加入500 μL含10%（v/v）SPS的BM，并覆盖500 μL胚胎培养级油。</li>
		<li>在60 mm组织培养皿中，加入8 mL胚胎培养油，然后在培养皿底部固定含有10%（v/v）SPS的20 μL BM液滴。每个复苏的胚胎对应一个液滴。 
		注意：可根据需要制备更多的培养基、液滴和洗涤皿。也可在加入油层之前将液滴添加至培养皿中。在油层下固定液滴有助于减少蒸发以及由此引起的渗透压变化。</li>
		<li>用10% v/v SPS平衡BM，并将洗涤板和回收板置于37 °C、6% CO₂的培养箱中2, 5% O₂2 至少 4 小时。</li>
		<li>将一瓶扩展培养基的第一步培养液（IVC1）在4 °C或室温下解冻。</li>
		<li>准备一个含有500 μL IVC1且无油覆盖的洗涤皿。将约4 mL IVC1分装至一个5 mL螺口管中。</li>
		<li>将IVC1洗涤皿和装有IVC1的小螺帽管在37 °C、6% CO₂条件下预平衡2, 和大气中的 O₂2 至少 4 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌超净工作台中，于胚胎复温前一天制备延长培养板。
	<ol>
		<li>将人血清中的纤连蛋白用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至 30 μg/mL。每个胚胎所需的包被液为 250 μL，浓度为 30 μg/mL 纤连蛋白。</li>
		<li>在超净台内打开8孔板盖玻片包装，注意不要触碰孔壁。轻柔地将250 μL浓度为30 μg/mL的纤连蛋白溶液加入每个孔中。</li>
		<li>将盖玻片放回腔室并置于 4 °C 环境中孵育 20–24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在胚胎复温当天早晨准备延长培养板。
	<ol>
		<li>取出带有纤连蛋白的带孔盖玻片，放入超净工作台中。用1 mL移液器吸除纤连蛋白混合液，并弃入废液容器中。</li>
		<li>从小的5 mL旋盖管中取出已预热并平衡的IVC1培养基。</li>
		<li>将300 μL平衡后的IVC1加入每孔中。注意避免液体接触盖子，以免增加污染风险。</li>
		<li>将带腔室的盖玻片连同IVC1放回培养箱，在37 °C、6% CO₂条件下孵育2, 和大气中的 O₂2 直至第4步去除透明带。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 复温玻璃化冷冻的D5人类胚胎
注意：其他生产商可能根据其自身的玻璃化冷冻技术采用略有不同的操作流程。若适用，请参阅生产商提供的使用说明。
<ol>
	<li>将 3.0 mL 复苏液（TS）置于 35 mm 培养皿中，预热至 37 °C。将 300 μL 稀释液（DS）以及 6 孔板中的两个含 300 μL 洗涤液（WS）的孔恢复至室温。</li>
	<li>使用镊子小心移除冷冻装置的保护套管，同时确保玻璃化冷冻胚胎始终浸没于液氮中。</li>
	<li>迅速将冷冻装置从液氮中取出，并将其尖端浸入 37 °C 的复苏液（TS）中。启动计时器计时 1 分钟，保持冷冻装置完全浸没，直至胚胎脱离并落入复苏液中。 
	注意：每次仅复温一个胚胎，以便追踪胚胎身份信息，这些信息可能与后续分析中的患者人口统计学数据相关。</li>
	<li>在复苏液（TS）中孵育的 1 分钟期间，小心取出冷冻装置，轻柔拾取胚胎并将其转移至复苏液培养皿的对侧。 
	注意：若同时培养多个胚胎，务必保持各胚胎彼此分离，以确保其身份信息准确无误。</li>
	<li>1 分钟后，用移液器吸取少量复苏液（TS）（约 2 μL）轻柔拾取胚胎，并将其转移至含 300 μL 稀释液（DS）的孔底部，同时用移液器中的少量 TS 在胚胎上方覆盖一层薄液。设定计时器为 3 分钟，并将 6 孔板置于室温台面上。</li>
	<li>3 分钟后，用少量稀释液（DS）（约 2 μL）拾取胚胎，并将其转移至下一个含 300 μL 洗涤液（WS）的孔底部。再次轻柔地将少量 DS 从移液器中覆盖于胚胎上方。设定计时器为 5 分钟，并将 6 孔板放回室温台面。</li>
	<li>5 分钟后，用极小体积的洗涤液（WS）拾取胚胎，并将其转移至最后一个含 300 μL WS 的孔顶部。胚胎将缓慢下沉并通过洗涤液沉降至孔底。将移液器中残留的 WS 排入一个空孔中。</li>
	<li>用最小体积拾取胚胎，并再次将其转移至同一 300 μL WS 孔的顶部。胚胎将再次缓慢沉降至孔底。设定计时器为 1 分钟，并将 6 孔板放回室温台面。</li>
</ol>
3. 复温胚胎的回收
<ol>
	<li>依次将已预热的胚胎转移至中心凹孔的组织培养皿中，皿内含有500 µL已平衡的BM培养基，其中添加10% v/v SPS，并覆盖500 µL已平衡的胚胎培养级油。</li>
	<li>通过吸取每个胚胎并在培养皿的不同区域移动，同时在移动间隙吹出旧培养基，以洗涤胚胎。随后吸取胚胎并将其转移至单独的20 µL培养液滴中，该液滴为含10% v/v SPS的已平衡BM培养基，并置于油下。</li>
	<li>将预热的胚胎置于37 °C、6% CO2、5% O2的培养箱中恢复培养2小时。</li>
</ol>
4. 透明带去除
<ol>
	<li>经过2小时恢复后，评估胚胎的重新扩张情况，并对每个胚胎拍照。</li>
	<li>将胚胎逐个转移至含有5%（v/v）胎牛血清（FCS）的500 µL MOPS缓冲操作培养基中，用于后续酸性Tyrode's溶液处理。</li>
	<li>将一个胚胎迅速通过300 μL预温的酸性Tyrode's溶液，同时在显微镜下持续观察。透明带将开始出现溶解现象，此过程约需5秒。</li>
	<li>立即将透明带正在溶解的胚胎转移至300 μL预温的MOPS缓冲培养基中，以中和酸性Tyrode's溶液。</li>
	<li>用最小体积的MOPS缓冲培养基将胚胎转移至中心井组织培养皿中，该培养皿含有500 µL已平衡的BM培养基和10% v/v SPS，并覆盖500 µL已平衡的胚胎培养级油，用于洗涤。</li>
	<li>将胚胎返回至步骤3.2中的20 μL恢复液滴中。 
	注意：在去除透明带后通过肉眼检查，若发现仍有残留透明带的胚胎，可根据需要重复步骤4.2–4.6，进一步使用酸性Tyrode's溶液处理。应尽量减少胚胎对Tyrode's溶液的暴露时间。</li>
</ol>
5. 囊胚延长培养
<ol>
	<li>将胚胎逐个从步骤1.1.6中已平衡的IVC1培养基转移至清洗皿中，再小心地将一个胚胎转移至腔室盖玻片的一个孔中，使用已平衡的IVC1培养基，并保持对胚胎的识别。 
	注意：此步骤应尽快完成，以尽量减少培养基蒸发。</li>
	<li>将腔室盖玻片放回设定为37 °C、6% CO2、大气O2的培养箱中培养2天。 
	注意：请确保提前4小时在37 °C、6% CO2、大气O2条件下解冻并平衡用于换液的培养基。</li>
	<li>在出胚第2天（受精后第7天），在显微镜下仔细检查胚胎的贴附情况，并进行培养基更换。
	<ol>
		<li>在更换培养基前，记录哪些胚胎已贴壁。轻轻敲击培养板，在显微镜下观察胚胎是否已牢固贴附于板上。</li>
		<li>打开盖子，小心移除150 μL IVC1培养基并弃去，注意不要扰动已贴壁的胚胎。如果胚胎尚未贴壁，则不要更换培养基，因为IVC1中的血清有助于胚胎贴附。</li>
		<li>用移液器缓慢向每个孔中加入150 μL已平衡的延长培养培养基IVC2，然后盖上腔室盖玻片的盖子。 
		注意：应尽量减少打开腔室盖玻片盖子的时间，以避免培养基蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心地将腔室盖玻片放回培养箱，避免培养基溅到盖子上。在延长培养期间每天重复进行培养基更换和贴附情况检查，直至胚胎准备好用于固定或单细胞消化。</li>
</ol>
6. 可选的用尽培养基收集
<ol>
	<li>可选：在第7天或之后任何一天更换培养基时收集用过的培养基。在步骤5.3.2中，不要丢弃培养基，而是将移除的150 μL IVC1迅速冷冻，放入无菌低吸附的0.5 mL离心管中，以备后续分析。</li>
</ol>
7. 免疫荧光的可选固定步骤
<ol>
	<li>使用 200 μL 移液器，用 PBS 进行 3 次 ½ 培养基更换，清洗胚胎，以去除任何细胞外碎片。洗去多余的碎片和蛋白质有助于提高成像清晰度，并减少免疫荧光图像中的背景信号。</li>
	<li>移除所有培养基，缓慢向孔中加入 200 μL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS。胚胎容易附着在液体表面。在完全移除液体前，使用 200 μL 含 4% PFA 的溶液进行多次 150 μL 清洗，有助于最大限度减少对胚胎的损伤。</li>
	<li>将胚胎在 4% PFA 中孵育 20 分钟以完成固定。</li>
	<li>用 200 μL 新鲜 PBS 中含 0.1% v/v 吐温-20（polysorbate 20）的溶液，每次 10 分钟，清洗胚胎 3 次。</li>
	<li>固定后的胚胎可保存在含 0.1% v/v 吐温-20 的 PBS 中，置于 4 °C，待进行免疫荧光实验时使用。</li>
</ol>
8. 使用胰蛋白酶进行单细胞消化
注意：单细胞消化使用新鲜（未固定）胚胎。
<ol>
	<li>用 200 μL PBS 将胚胎洗涤一次，并向每个孔中加入 200 μL 胰蛋白酶溶液。将带孔盖玻片放回培养箱中孵育 5 分钟。</li>
	<li>从培养箱中取出带孔盖玻片，在体视显微镜下观察胚胎。胚胎边缘的细胞将开始回缩，而磁导向细菌（MTB）应仍附着在培养板上，远离胚胎的位置。</li>
	<li>使用小型移液器或精细拉制的口吸管，在解离整个胚胎之前吸取单个 MTB。跳至步骤 9.1 以保存 MTB，然后在完成步骤 9.3 后返回步骤 8.4。</li>
	<li>使用手持显微操作移液器或口吸管，通过反复吹打轻柔地解离胚胎。</li>
	<li>细胞将开始从整个胚胎中分离。继续使用更小直径的移液器吸头或口吸管轻柔且反复地吹打胚胎，直至胚胎在胰蛋白酶中总孵育时间达到 10 分钟。</li>
</ol>
9. 单细胞挑选与样品收集
<ol>
	<li>使用极少量的胰蛋白酶，小心地将解离的细胞通过三滴20 μL含0.1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的PBS，在胚胎培养油下进行洗涤，注意避免丢失任何细胞。</li>
	<li>洗涤细胞后，用拉制精细的玻璃移液管挑选一个单细胞，并小心地将该单细胞连同极少量PBS+0.1% PVP移入无菌的0.2 mL低吸附离心管中。</li>
	<li>将单细胞在液氮（LN2）中速冻，并于-80 °C保存以备后续使用。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

建立人类胚胎植入后培养的实验方案，使科学家能够探索发育过程中此前未被研究过的关键时期8,9。在此，我们采用延时培养系统对人类胚胎进行体外培养，并在绒毛胎盘形成之前研究早期滋养层细胞的分化过程。本文所述方法使我们能够获取不同的滋养层（TB）亚群细胞，用于后续的单细胞分析。本研究为科学界深入了解人类发育这一关键而神秘的阶段提供了契机，并可能为流产或子痫前期等胎盘相关疾病的治疗开辟新的途径，同时为人类早期发育机制提供新的见解。
本方案要求在胚胎复温、透明带去除和铺板过程中熟练快速地操作胚胎，以尽量减少胚胎在长期培养前受到的应激。在换液过程中尽量缩短暴露时间，以减少培养基蒸发，从而避免培养基渗透压升高，这是至关重要的。在更换培养基和移动培养皿时，注意采用规范的无菌操作技术，有助于最大限度地降低污染风险。当胚胎贴壁后，使用时应固定培养皿，以尽量减少机械扰动，这一点也十分重要。受到应激的胚胎会开始回缩其合胞体突起，并启动凋亡。此外，必须避免培养基的弯月面接触胚胎表面，同时尽量减...

人类着床过程及早期胎盘的形成历来难以研究，很大程度上仍不明确，因为在此阶段妊娠尚无法临床检测，人类组织样本无法获取。动物模型也不足以替代，因为人类胎盘形成具有其他真兽类哺乳动物所不具备的独特特征。例如，人类胎盘会深入侵入蜕膜，部分滋养层细胞可到达子宫肌层的内三分之一区域，同时另一些细胞则重塑子宫螺旋动脉。即便是与我们亲缘关系最近的非人灵长类动物，在胎盘形态以及滋养层细胞与母体蜕膜组织相互作用方面也存在差异1,2,3。在20世纪80年代之前，体外获取着床前人类胚胎是不可能的；直到临床人类体外受精（IVF）成为治疗不孕症的常规手段后，才得以实现4。如今，人类囊胚可在体外培养，用于筛选更具活力的胚胎进行移植，并实现安全的遗传学检测。随着胚胎培养技术的进步以及体外受精的广泛应用，产生了大量患者治疗周期结束后剩余的囊胚。在获得患者知情同意、通过机构审查委员会（IRB）批准并符合特定限制条件的前提下，这些囊胚可用于科学研究。它们已成为极为宝贵的研究资源，曾被用于建立人类胚胎干细胞系5，研究内细胞团向胚胎干细胞转变的过程6,7，以及最近成功地将人类囊胚体外培养至第13天（D13），以模拟人类着床过程8,9。通过应用近年来发展的单细胞组学技术，研究者得以接触这些着床阶段的人类胚胎组织，前所未有地揭示调控这一高度动态的细胞分化过程的分子机制10,11,12,13。
本文描述了我们近期发表的研究中所采用的方法，该研究旨在表征人类着床过程中滋养层细胞分化的动态过程12。本实验方案包括玻璃化冷冻囊胚的复苏、体外受精后长达第12天（D12）的胚胎延时培养、将胚胎通过酶消化法解离为单细胞，以及为后续检测收集细胞（图1）。该延时培养体系可在无母体输入的情况下支持围着床期人类胚胎的发育，并重现了滋养层细胞的分化过程，其结果与多年前基于组织学标本所观察到的现象一致14,15,16,17。在着床过程中，滋养层细胞群体至少包含两种细胞类型：具有类似前体细胞特征的单核细胞——细胞滋养层细胞（cytotrophoblast, CTB），以及终末分化、多核的合体滋养层细胞（syncytiotrophoblast, STB）。经胰蛋白酶消化后，CTB表现为体积较小、形态呈圆形的细胞，其形态学特征与其他细胞谱系难以区分（图2A，左图）。通过单细胞RNA测序揭示的不同转录组特征，可实现CTB与其他细胞谱系（如上胚层和原始内胚层）的有效分离。合体滋养层细胞则表现为形状不规则、体积显著大于其他细胞类型的结构，主要位于胚胎的外周区域，易于识别（图2A，中图；图2B，左图）。迁移性滋养层细胞（migratory trophoblast cells, MTB）是延时培养过程中发现的另一类滋养层亚谱系，其形态表现为似乎正从胚胎主体向外迁移（图2A，右图；图2B，右图）。尽管MTB表达许多与绒毛外滋养层细胞（extra villous trophoblast, EVT）相同的标志物，但由于在这一极早期发育阶段胎盘中的绒毛结构尚未形成，因此不应将其称为EVT。
实验上，我们能够在胚胎于第8天（D8）、第10天（D10）和第12天（D12）被消化为单细胞后，收集到易于区分的小型CTB和大型STB（图2A,B）。迁移型滋养层细胞（MTB）出现在胚胎延时培养的较晚阶段，可在第12天全胚胎酶消化前进行收集（图2A,B）。通过在单细胞分析前根据表型分离这三种滋养层亚群，我们能够鉴定每种细胞类型的特异性转录组标志物，并明确其各自的生物学功能。细胞滋养层细胞（CTB）具有高度增殖性，作为前体细胞为STB和MTB分化谱系提供来源10,11,12,13。合体滋养层细胞（STB）参与胎盘激素的产生以维持妊娠，可能还介导胚胎向子宫内膜的植入10,11,12,13。迁移型滋养层细胞则表现出更强的侵袭性和迁移性表型，可能负责对子宫内膜进行更深入且更广泛的定植10,11,12,13。在定义了每种细胞类型的转录组特征后，聚类分析还揭示出另外两个细胞亚群，它们在形态上与CTB无法区分，但其转录组分别具有STB和MTB的特征12。这些处于中间阶段的细胞很可能正处于从CTB向MTB或STB谱系分化的进程中；若仅将胚胎盲目消化并单纯依据转录组进行细胞分离，则这些细胞将被遗漏。
本文所述方案采用二维（2D）培养系统，可能并非支持三维（3D）结构发育的最佳选择，这一点已由近期一篇描述新开发的3D培养系统的出版物所指出13。然而，在该2D系统中，早期滋养层细胞的分化情况与体内样本的观察结果一致14,15,16,17。本方案也可轻松适用于近期报道的3D培养系统13，仅需极少修改。所有步骤均使用手持显微操作移液器配合 commercially available disposable tips，或使用连接橡胶管、滤器和吹管嘴的细拉玻璃毛细管制成的口吸移液器完成。

<table><tbody><tr><td>NORM JECT 鲁尔锁式无菌注射器</td><td>VWR</td><td>53548-019</td><td>每包 100 支</td></tr><tr><td>3130 或 3110 Forma Series II 水套式 CO2 培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Corning Primaria 组织培养皿</td><td>VWR</td><td>62406-038</td><td>每箱 500 个</td></tr><tr><td>5 mL 带卡扣盖离心管</td><td>VWR</td><td>60819-295</td><td>每包 25 个</td></tr><tr><td>60 mm Corning Primaria 组织培养皿</td><td>VWR</td><td>25382-687</td><td>每箱 200 个</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Agtech Inc.</td><td>D18</td><td>每包 1、10 或 50 个</td></tr><tr><td>酸性 Tyrode 溶液</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1788</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Biotix 1250 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>VWR</td><td>76322-156</td><td>每包 960 个</td></tr><tr><td>Blast，囊胚培养基</td><td>Origio</td><td>83060010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>稀释液</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 × 4 mL</td></tr><tr><td>一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td>5.75 英寸（146 mm）；每箱 720 支</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>胚胎培养石蜡油 OvOil</td><td>Vitrolife</td><td>10029</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR 管 0.2 mL</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>每包 1,000 个</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR 管 0.5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-980</td><td>每箱 500 个</td></tr><tr><td>人血浆来源纤连蛋白，液体，0.1% 溶液</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0895</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Gilson 1 mL 移液器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 个移液器 200–1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Gilson 20 &amp;micro;L 移液器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 个移液器 2–20 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Gilson 200 &amp;micro;L 移液器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 个移液器 50–200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>G-MOPS 操作培养基</td><td>Vitrolife</td><td>10129</td><td>125 mL</td></tr><tr><td>操作培养基</td><td>Origio</td><td>83100060</td><td>60 mL</td></tr><tr><td>Ibidi 8 孔腔室盖玻片</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>每盒 15 片</td></tr><tr><td>IVC1/IVC2</td><td>Cell Guidance Systems</td><td>M11-25/ M12-25</td><td>每份 5 mL，共 5 份</td></tr><tr><td>K System T47 加热板</td><td>Cooper Surgical</td><td>23054</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Millex 带 Durapore PVDF 膜无菌注射式滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGVR33RS</td><td>每包 50 个</td></tr><tr><td>吹嘴</td><td>IVF Store</td><td>MP-001-Y</td><td>100 个</td></tr><tr><td>Oosafe 中心井培养皿</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-CW05-1</td><td>每箱 500 个</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage SPS</td><td>Origio</td><td>ART-3010</td><td>12 × 12 mL</td></tr><tr><td>吹嘴用橡胶乳胶管</td><td>IVF Store</td><td>IVFS-NRL-B-5</td><td>5 英尺</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>剥离吸头</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-275</td><td>每包 20 个，275 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>解冻液</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>2 × 4 mL</td></tr><tr><td>Stripper 微量移液器</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1X），无酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td>1 × 100 mL</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-25ML</td><td>25 mL 瓶装</td></tr><tr><td>VWR 1–20 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>每包 960 个</td></tr><tr><td>VWR 1–200 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>VWR</td><td>89174-526</td><td>每包 960 个</td></tr><tr><td>洗涤液</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 × 4 mL</td></tr></tbody></table>

单细胞收集围植入期人类胚胎中的滋养层细胞

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

人类着床是指胚泡与子宫表面上皮细胞相互靠近并黏附，随后侵入母体蜕膜的过程，这一关键但神秘的生物学事件由于技术和伦理限制，历史上一直难以研究。着床过程始于滋养外胚层发育为早期滋养层细胞，并进一步分化为不同的滋养层亚群。早期滋养层细胞的异常分化可能导致着床失败、胎盘病理、胎儿畸形以及流产。近年来，已有方法被开发出来，可在无母体组织的情况下将人类胚胎体外培养至受精后第13天，这一时间段涵盖了人类着床期。这使得研究人员能够在排除母体干扰并避免体内研究早期胚胎分化事件固有障碍的前提下，探索人类着床过程，并重现这一关键时期滋养层分化的动态变化。为了在着床期间对不同滋养层亚群进行表征，我们采用了现有的二维（2D）延时培养方法，并建立了一种通过酶消化分离不同类型滋养层细胞以用于后续检测的实验流程。在二维条件下培养的胚胎形态相对扁平，可能在模拟体内三维（3D）胚胎结构方面存在不足。然而，延时培养过程中观察到的形态学特征及基因表达变化表明，滋养层分化过程受影响较小。包括细胞滋养层、合体滋养层和迁移性滋养层在内的不同滋养层亚群，可根据其大小、位置和出现时间加以区分，并用于进一步的表征或实验。对这些早期滋养层细胞的研究可能有助于理解人类着床机制、治疗常见胎盘疾病，并降低妊娠丢失的发生率。

健康的胚胎在延长培养过程中表现出持续增殖（图2B）。异常胚胎则从其外缘开始回缩并逐渐解体（图2C）。根据我们的经验，约75%的胚胎在培养48小时时已贴附于纤连蛋白包被培养皿的底部，至72小时时贴附率上升至约90%。胚胎贴附的成功率在很大程度上受囊胚初始质量的影响。若胚胎在72小时时仍未贴附，则很可能无法存活。
受精后第8天（延长培养的第3天），胚胎中的大多数细胞均为表达滋养层标志物GATA3的细胞滋养层细胞（CTB）（图3A）。细胞滋养层细胞已在胚胎周边开始分化为多核的合体滋养层细胞（STB）（图2B，左图，虚线所示）。这些合体滋养层细胞呈片状结构，并对人绒毛膜促性腺激素β亚单位（hCGB）呈阳性染色（图3A，中图）。在D8至D10期间，胚胎迅速生长，提示此阶段细胞滋养层细胞快速增殖。到...

本文介绍了一种方法，用于解冻玻璃化保存的人类囊胚，将其在体外培养至着床时期，消化为单细胞，并收集早期滋养层细胞以供进一步研究。

人类着床是指胚泡与子宫表面上皮细胞相互靠近并黏附，随后侵入母体蜕膜的过程，是……

许多妊娠在受精后约第七或第八天的人类胚胎发育早期即告失败。本方案为研究者提供了在体外培养人类早期胚胎的机会，以研究这一神秘的着床窗口期。这使我们能够理解人类胚胎着床成功及早期胎盘形成背后的关键机制。使用扩展的培养系统在体外培养着床前后阶段的人类胚胎，可能是获得用于研究着床过程及早期滋养层分化的真正材料的唯一途径。这一简便的技术是一种强大的工具，使我们能够回答有关人类早期发育的诸多基础科学问题。采用本方案开展的研究将极大促进对着床早期妊娠丢失、反复着床失败以及胎盘病理学的理解。进行该操作演示的将是来自实验室的博士生 Deirdre Logsdon。在胚胎复苏前一天，于无菌超净工作台中准备培养基和复苏培养皿。取两个中心凹玻片培养皿，每个加入 500 µL 含 10% SPS 的 BM，然后在 BM 上层覆盖 500 µL 胚胎培养级油。在直径16毫米的组织培养皿中，加入8毫升胚胎培养油，并在底部固定20微升含10% SPS的BM液滴。将洗涤培养皿和回收培养板置于37摄氏度、6%二氧化碳和5%氧气的培养箱中平衡至少4小时。取约4毫升IVC 1培养基分装至5毫升带盖离心管中，并准备一个含500微升无油覆盖的IVC 1培养基的洗涤培养皿。将培养皿和试管置于培养箱中平衡至少四小时。用 PBS 将人血清中的纤连蛋白稀释至 30 微克/毫升。打开八孔板盖玻片包装，注意不要触碰孔壁，然后轻轻将 250 微升纤连蛋白溶液加入每个孔中。将盖玻片盖上盖子，并在4°C下孵育20至24小时。在胚胎复苏当天早晨准备延长培养板。取出带有纤连蛋白的带孔盖玻片，并将其放入超净工作台中。然后用1毫升移液器吸除纤连蛋白混合液并弃去。每孔加入300微升平衡后的IVC 1培养基，将盖玻片放入培养箱中，直至去除透明带。将第5天的人类胚胎复温并复苏后，观察其是否重新扩张，并对每个胚胎拍照记录。将每个胚胎转移至500 µL含5% FCS的MOPS缓冲操作液中。随后按照文本稿件中的描述，用酸性Tyrode's溶液处理胚胎。立即将正在溶解透明带的胚胎转移至300 µL预温的MOPS缓冲液中，以中和Tyrode's溶液。然后将胚胎移入含有经平衡的BM液并添加10% SPS的中心孔器官培养皿中，置于胚胎培养级油下。随后将胚胎返回至20微升的回收液滴中。逐个将胚胎转移至含有经平衡的IVC 1培养基的洗涤皿中，然后小心地将每个胚胎移至腔室盖玻片的一个孔中，注意记录胚胎的编号信息。将带孔盖玻片放回培养箱中，在37摄氏度、6%二氧化碳及大气氧条件下培养两天。在孵出第二天，于显微镜下仔细观察胚胎的贴附情况，并更换培养基。通过轻轻敲击培养板来确认哪个胚胎已贴附于培养皿上。更换培养基时，先取下盖子，小心吸出150微升IVC 1培养基，注意不要扰动已贴壁的胚胎。如果胚胎尚未贴壁，则不要更换培养基，因为IVC 1中的血清有助于胚胎贴壁。缓慢将150微升预平衡的延长培养基IVC 2加入每个孔中，然后将盖子重新盖回盖玻片上。小心地将带有细胞的盖玻片放回培养箱。每天重复更换培养基并检查细胞贴壁情况，直至胚胎准备好进行固定或单细胞消化。如果需要收集用过的培养基以进行进一步分析，应将移除的150 µL IVC 1迅速冷冻，放入无菌低吸附的0.5 mL离心管中。用 200 微升 PBS 将每个胚胎洗涤一次，然后向每孔中加入 200 微升胰蛋白酶溶液。将带孔盖玻片放回培养箱中孵育 5 分钟。使用小型移液器或拉制精细的口吸管吸取单个 MTB，再用较大的移液器通过反复吹打轻轻解离胚胎。使用直径较小的移液枪头轻柔且反复地吸取胚胎，直至胚胎在胰蛋白酶中孵育的总时间达到10分钟。进行单细胞筛选时，将解离后的细胞依次通过含有320微升PBS和0.1%PVP的洗涤液滴（置于胚胎培养油下），注意避免丢失任何细胞。洗涤完成后，使用拉制精细的玻璃毛细管移液器挑选一个细胞。用含有少量 PBS 和 PVP 的移液枪小心地将单个细胞转移至无菌的 0.2 毫升低吸附离心管中。将单个细胞在液氮中快速冷冻，并于 -80 摄氏度保存以供后续使用。健康的胚胎在延长培养过程中表现出持续增殖，而异常的胚胎则从其外缘开始回缩并解体。受精后第8天，胚胎中的大多数细胞为细胞滋养层细胞（CTB），表达滋养层标志物GATA-3。在胚胎周边，CTB已开始分化为多核的合体滋养层细胞，呈现片状结构，并对人绒毛膜促性腺激素β亚基（CGB）染色呈阳性。到第10天时，CGB阳性的迁移性滋养层细胞形成达到高峰，此现象也通过此时人绒毛膜促性腺激素（HCG）产量的显著上升得以证实。表达 HLA-G 阳性的迁移型滋养层细胞也开始从胚胎本体中出现并迁移出去。到第 12 天时，合体滋养层细胞（STB）的分化逐渐减少，而迁移型滋养层细胞（MTB）的生成变得更加显著，提示在第 10 天以激素生成为主的功能逐渐转向第 12 天以细胞迁移为主的功能。这些变化可在着床前期的时间推移视频中观察到。视频展示了囊胚腔的塌陷、滋养层细胞（STB）的形成，以及多核滋养层细胞（MTB）最终的分化与迁移过程。进行该操作时最重要的是要牢记，您正在处理的是对温度、渗透压和pH值变化敏感的活体胚胎。尽量减少培养皿离开培养箱的时间，对于维持胚胎的健康至关重要。完成此操作后，研究人员可将分离得到的单细胞用于后续的单细胞组学分析，例如单细胞 RNA 测序和全基因组重亚硫酸盐测序，以更深入地理解人类胚胎着床及早期胎盘形成过程中的表观遗传学和转录组变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

近植入阶段人类胚胎中特罗福细胞的单细胞集合

在本视频中，我们演示了小鼠囊胚的分离以及从囊胚中建立滋养层干细胞的方法。同时介绍了维持干细胞特性的培养条件，以及在体外诱导其分化的方案。...

从小鼠囊胚中分离滋养层干细胞

在本实验方案中，我们描述了在小鼠妊娠第10.5天时分离胎盘组织，并通过Percoll梯度分离滋养层细胞的方法。随后，我们展示了将分离得到的细胞用于Matrigel侵袭实验的操作过程。...

小鼠滋养层细胞的分离及滋养层细胞侵袭实验

本方案描述了一种利用微电穿孔法高效转染新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞中siRNA，并鉴定这些细胞中DNA-蛋白质复合物的方法。在4天的培养期间，可通过Western印迹和EMSA分析对转染细胞进行监测。...

新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞的siRNA转染及EMSA分析

本文介绍了一种通过在十天内过表达 Tfap2c、Gata3、Eomes 和...

小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为滋养层干细胞的实验方案

滋养层巨细胞（TGCs）在胎盘中发挥关键作用，以确保妊娠健康。本文介绍一种通过在植入后胚胎的冷冻切片或胚胎第7天外胚层锥体的短期培养物上进行新生荧光原位杂交，来评估TGCs中基因转录状态的实验方案。...

通过新生RNA荧光原位杂交进行转录分析 体内 滋养层巨细胞或 体外 外植体短时培养的胚外胎盘锥

本文介绍一种利用骨形态发生蛋白4（bone morphogenic protein...

体外 人多能干细胞向滋养层细胞的分化

本文介绍了一种人胎盘绒毛组织取样后分离细胞滋养层细胞用于原代细胞培养的实验方案。用TNFα处理滋养层细胞可模拟肥胖子宫内环境中的炎症状态，有助于发现母体肥胖胎盘中受炎症调控的分子靶点。...

一种原代人类滋养层细胞模型，用于研究母体肥胖相关炎症对胎盘自噬调控的影响

本方案展示了一种从足月胎盘的胎膜中分离原代人蜕膜细胞的方法，该方法可用于多种应用（例如免疫细胞化学、流式细胞术、等），旨在研究不同细胞群体在妊娠并发症中的作用。...

从足月胎盘的胎膜中分离原代人蜕膜细胞

本文介绍了一种简便易行的实验方案，利用三种体外实验方法评估人类滋养层细胞的细胞运动能力：划痕实验、Transwell侵袭实验和细胞增殖实验。...

评估永生化人孕早期滋养层细胞系迁移、侵袭和增殖能力的体外实验方法

本方案可实现对经典方法中形成的管状结构的回收 体外...

从血管生成-管腔形成实验中回收滋养层细胞用于分化标志物表达分析

本方案可实现从人类足月胎盘的底蜕膜和绒毛膜中分离、鉴定和培养原代HLA-G+绒毛外滋养层细胞（EVT）。原代EVT培养物可维持96小时的活力，可用于与配对的母体免疫细胞共培养，并进一步对其相互作用进行流式细胞术和分子分析。...

从人类足月胎盘组织中分离纯化 HLA-G+ 细胞外滋养层细胞用于表型鉴定与功能分析

了解人类胚胎植入期滋养层细胞的单细胞收集方法，用于研究早期胎盘形成和着床机制。该技术有助于揭示早期妊娠失败的原因并改善生殖健康。

单细胞收集围植入期人类胚胎中的滋养层细胞

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