水生甲壳虫中的RNA干扰是特定发育时间点操纵基因表达的有力工具

尽管基因编辑在研究非模型生物体的分子遗传学方面已经流行起来，但RNAi仍然是一个强大的协同工具。该技术的主要优点是，它可以应用于不同的发展阶段。此外，部分敲击可用于研究这些整个基因。

手术的成功取决于DSR的注射和最小的伤害。这需要练习，所以不要气馁，如果它需要几次尝试得到它的权利。要准备早期胚胎进行微注射，首先将煮沸的20%的气糖倒入小培养皿中，并在液体加糖凝固之前将三根一至两毫米宽的塑料管放在液体加糖的表面。

一旦气糖凝固，使用一对钝钳去除管子，用500微升的分压蒸馏水覆盖由此产生的凹痕。当收集容器准备好使用精细的自然发漆刷，将五个八小时老的T.marmoratus胚胎从甲虫筑巢地点转移到一个玻璃腔盘中，在立体显微镜下装满自 <3>开瓶蒸馏水。使用显微镜和精细的解剖钳从两侧抓住每个胚胎的胆小精，撕开胆小子，使胚胎轻轻地从组织中滑出。

从所有收集的胚胎中去除两个胆小板后，使用画笔小心地将胚胎从玻璃腔盘中转移到准备好的琼糖板的凹槽中。给早期胚胎注射基因特异性双绞合RNA，首先在针头脉冲上准备显微注射针，并使用立体显微镜找到钳子，将每个尖端断裂到锋利的边缘。将感兴趣的纯化库存双链RNA抛在冰上后，在产生的溶液中加入一个10X注射缓冲液的微升，并使用双蒸馏水将溶液的乙烯基体积达到10微升。

使用 P10 移液器将一个已准备好的微注射针头与工作双绞合 RNA 溶液进行回填，然后将针头装入连接到使用压力喷射技术的微注射系统的微针支架中。打开微喷射系统和加压空气供应，并使用微喷射系统的微阀将喷射压力设置为每平方英寸 15 磅压力，然后使用时间调节旋钮将喷射持续时间设置为秒。为了校准注射针，评估注射到空气中时在针头尖端形成的液体气泡的体积，使用最佳气泡大小为 100 到 200 微米。

如果以每平方英寸 15 磅的压力达到最佳气泡，注射持续时间约为 3 秒，注射针质量良好。当针头准备好时，将针头对齐在胚胎的红玫瑰板上，使针头以 45 到 60 度角接近胚胎。使用微操纵器缓慢移动微针，直到尖端接触一个胚胎中间的表面，然后小心地向前移动针头，直到它穿透胚胎表面。

一旦针头进入胚胎内部，请小心地按下微喷油剂注射按钮，将一至两个纳米光的双绞合RNA送入胚胎。当所有RNA被交付时，缓慢地从胚胎中收回针头，而不会导致胚胎破裂。成功注射的胚胎可以通过注射部位存在有色斑点来识别。

当所有胚胎被小心地注射时，将培养皿放入25摄氏度的培养箱中的湿度室，设定为14小时光10小时黑暗周期，为期4至5天。每天在立体显微镜下监测胚胎发育进度，以识别形态上可见的击倒表型。使用高分辨率数码相机记录开发过程。

取出任何死去的胚胎，每天补充黄玫瑰板上的水，以避免在孵化期间干燥和微生物污染扩散到其他存活的胚胎。在收集幼虫之前，首先将60至70摄氏度的2%液体阿加罗斯加入到小培养皿中。当阿加罗斯凝固使用钝钳，使一个浅群每幼虫被注射到阿加罗斯和轻轻地从幼虫培养杯中排出水。

麻醉后，使用柔软的端钳小心地将幼虫放在固定板上，颈部和身体位于凹槽中，但尾部位于阿加罗斯表面上方。当所有的幼虫被放置时，用一层厚厚的气糖覆盖每个熔岩，这些熔岩仍然是液体，但不是危险的热，并释放任何被意外覆盖的故事，必要时。对于双链RNA微注射负荷的微需要与基因特异性双链RNA工作溶液的兴趣如所证明。

将手动控制的微注射注射器的柱塞重新拉上，将针头加载到微注射系统中。将固定化的幼虫置于立体显微镜下，使注射部位以相对平坦的角度与微注射针的轨迹对齐。使用微型操纵器小心地将针尖移入幼虫，然后缓慢而小心地向注射器施加压力，根据针头中彩色注射液的移动调整注射压力。

当所有RNA被注射时，使用软钳子将幼虫从红糖中释放，并在25至28摄氏度和14小时光10小时黑暗周期下将幼虫放入新的室温水容器中。在这个代表性的分析中，三个不同的基因在太阳爆发潜水甲虫T.marmoratus的不同发育阶段被击倒。RNA干扰在胚胎形成的早期阶段通过注射双链RNA来表现。

一些胚胎不能生存的过程，变成坏死。在这些图像中，它们可以控制个体，并且可以观察到眼睛颜色稍浅的个人。在这个个体中，一个更严重的敲击，其中集群的更腹的谎言是完全未感染，但做盟友仍然显示一些色素沉着可以观察到。

这里举了另一个人的例子，他们基本上在所有的眼睛中完全失去了色素。Lac2在幼虫中被击倒导致一个色素较少的角质层，较轻的成年个体，由于组织异常柔软，翅膀可能有些变形。一定要敏锐地观察你每天注射的动物，并立即清除任何死亡的个体。

这项技术的用力是它可以应用于许多不同的生物体的基因。该技术也广泛而成功地应用于进化发育生物学。