使用 循环介质等温扩 增检测灌溉水中的植物浮肿

植物病原检测是植物病管理的关键一步。该协议为灌溉水污染提供了一种快速检测方法，该方法由一种常见的水性战斗机病原体引起。利用这种技术，特定的病原体，如植物性病原体，可以处理，并快速检测从我们大量的灌溉水，同时留在现场。

演示这个程序的将是欧文哈德森，一个硕士学生从我的实验室，和苏米亚瓦利乌拉，博士后研究员从博士平西G的实验室，建立一个泵和过滤器现场植物托波拉卡皮奇检测灌溉水。将滤瓶连接到连接到手泵的管子上，并将布赫纳漏斗安装到过滤瓶口的橡胶塞中。然后将一块大小合适的滤纸放入漏斗中，其保留尺寸为 15 微米。

获取水样，从目标水源收集灌溉水。水可能有少量的碎屑，但沉淀物或土壤并不明显。在使用手泵形成吸力以将水通过漏斗时，将 50 到 1000 毫升的试水缓慢地倒在漏斗内的过滤纸上。

过滤所有水后，使用钳子从漏斗中取出滤纸。用无菌剪刀把纸剪成小块。将8至12张纸在400微升的萃取缓冲液中，在1.5毫升的管子中，在室温下孵育5分钟。

漩涡或以其他方式每分钟搅拌纸张10秒。在孵育结束时，使用钳子用尽可能少的缓冲液取出纸张。然后用下一组滤纸重复许可证。

在从滤纸样本中提取DNA时，将20微升蛋白酶K和10微升每微升RNA10纳米图添加到样品中，并在室温下孵育溶液15分钟，每三分钟进行涡流或摇动。在孵化结束时，在样品中加入500微升的磁珠，通过摇动混合。在室温下五分钟后，将管子和磁性分离器机架放置两分钟，然后取出并丢弃上经剂。

从磁性分离器上拆下管，并在 500 微升洗涤缓冲液中大力重新悬浮磁珠。30 秒后，将管子返回磁铁，等待两分钟，然后丢弃上经剂。使用 500 微升的洗涤缓冲液和 500 微升的 80% 乙醇重复洗涤，正如刚刚证明的。

空气在室温下驱动磁珠颗粒15分钟。在孵化结束时，将珠子重新悬浮在50微升洗脱缓冲液中，并移液1分钟，然后将管子放回磁铁上两分钟，以便收集上经剂。如表所示，在准备LAMP底流器混合后，在2.5微升的底材混合12.5微升的熔岩LAMP主混合一微升提取的DNA和9微升的双蒸馏水到PCR管，并设置一个正和一阴性对照。

在64摄氏度的热博客中孵育所有样品45分钟，或在孵化结束时将精灵三个扩增仪器孵育，每个放大样品的5微升负载到1%的加糖凝胶上，并在紫外线成像机器上成像结果波段。如果使用热量测量染料，则查看颜色变化以确定结果为正或负。如果使用便携式放大仪器，请查看屏幕上的放大图以确定结果。

在64度运行LAMS检测的光学时间是45分钟，因为检测结果为正的最低浓度直到40分钟才被放大，而高浓度在20分钟内被放大。扩增可以在标有核酸污渍的 1%agarose 凝胶上确认。如图所示，传统 PCR 的灵敏度比 LAMP 小 40 倍。

检测4.8倍10至第三动物园孔每毫升浓度最低。在这项分析中，从佐治亚州蒂夫特县用于商业蔬菜生产的七个池塘中采集了水样。其中三个显示了积极的LAMLAM结果。

然而，当用传统的PCR测试样品时，只在三个阳性样本中的一个中检测到动物孔隙。在表中，总结了使用灵敏度、时间、所需准备、材料和成本等变量的检测方法之间的差异。LAMP 是测试方法中成本较低的方法，也是最快的方法，与传统 PCR 扩增相比，只需 30 到 60 分钟的放大时间。

使用该协议从密切相关的UMI种子病原体中提取的DNA导致任何样品的检测，确认底源的特异性。确保不要过快地倒出样品水，在将提取的DNA添加到LAMS管以限制污染时要小心。一旦其他水性病原体已经开发出其特定的底套，过滤和灯酸方法就可以适应其他病原体。