Name: 定量自发 Ca2+ 通量及其在原发性小鼠中脑神经元中的下游效应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 了解使用GCaMP6f钙成像技术定量分析原代小鼠中脑神经元自发Ca²⁺通量的方法。该技术可解析钙介导细胞凋亡的受体机制，为帕金森病神经保护药物筛选提供高通量平台。

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由美国帕金森病协会（American Parkinson Disease Association, APDA）和美国国立卫生研究院（NIH R01NS115809-01）向 RS 提供的资助支持。我们感谢德克萨斯农工大学（Texas A&amp;感谢#38;M基因组医学研究所（TIGM）提供配孕小鼠，用于建立原代多巴胺能神经元培养。

<ol><li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+Parkinson%27s+disease+across+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21(2018).</li>
<li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).</li>
<li>Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxicity%3A+bridge+to+various+triggers+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders.</a> European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).</li>
<li>Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+further+update+on+the+role+of+excitotoxicity+in+the+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Transmission+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).</li>
<li>Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+excitotoxicity+and+their+relevance+to+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmaceutica+Sinica+B%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).</li>
<li>Vieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxicity+through+Ca2%2B-permeable+AMPA+receptors+requires+Ca2%2B-dependent+JNK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation.</a> Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).</li>
<li>Sebe, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29-Permeable+AMPARs+Mediate+Glutamatergic+Transmission+and+Excitotoxic+Damage+at+the+Hair+Cell+Ribbon+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse.</a> Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).</li>
<li>Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNQX+increases+GABA-mediated+synaptic+transmission+in+the+cerebellum+by+an+AMPA%2Fkainate+receptor-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism.</a> Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li>
<li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+Identification+of+Living+Dopaminergic+Neurons+in+Midbrain+Cultures+Using+RNA+Sequencing+and+TH-promoter-driven+eGFP+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54981(2017).</li>
<li>Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+promotion+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+depolarizing+concentrations+of+K%2B+requires+concurrent+inactivation+of+NMDA+or+AMPA%2Fkainate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors.</a> Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).</li>
<li>Lavaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noble+gas+xenon+provides+protection+and+trophic+stimulation+to+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).</li>
<li>Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines%3A+a+comparative%2Fcollective+analysis%2Fstudy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91(2015).</li>
<li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li>
<li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).</li>
<li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks%3A+an+integrative+view%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li>
<li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+pacemaking+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了一种长期原代腹侧中脑（VM）细胞培养系统，用于对谷氨酸介导的神经元凋亡进行高内涵分析。已有研究采用原代中脑多巴胺能神经元培养体系，以阐明帕金森病（PD）模型背景下兴奋性毒性的作用机制11,12。在本研究中，我们采用一种组合方法，利用基因编码的钙离子指示剂（GECIs）检测Ca2+活性，并进一步将该活性与下游分子变化（如凋亡信号级联的启动）相关联4。该方法相较于其他类似的细胞培养系统具有多项优势。由于我们特别关注帕金森病背景下的兴奋性毒性，使用原代VM细胞培养体系尤为理想。通过采用不同的视野重定位技术，例如带网格的盖玻片或结合酪氨酸羟化酶（TH）免疫染色的电动XY显微镜载物台，我们能够直接研究谷氨酸介导的凋亡在腹侧中脑神经元中对特定细胞类型的效应。此外，为期三周的细胞培养模型使神经元能够发育出完整且成熟的分子特征，更接近成年多巴胺能（DA）神经元9。以往的方法主要集中在谷氨酸介导的兴奋性毒性后发生的分子变化13,14。本模型的独特之处在于，能够在已鉴定的细胞类型中将神经元生理的急性变化与下游分子事件进行关联分析。该原代培养模型的一个局限性在于，解剖技术获取的是整个腹侧中脑区域，其中包括多巴胺能神经元和GABA能神经元，以及来自黑质致密部（SNc）和腹侧被盖区（VTA）的神经元。现有证据表明，与邻近VTA的多巴胺能神经元相比，SNc的多巴胺能神经元对钙离子具有选择性易损性，并更易发生最终的细胞死亡15。遗憾的是，在胚胎期培养体系中区分SNc与VTA来源的神经元一直存在困难，因胚胎脑中可用于界定这些结构的解剖学标志极少。
我们证明，原代培养技术可用于量化异质性自发性Ca2+ 活性（图1因此，这是一个研究持续活跃细胞的理想细胞培养系统模型，例如中脑的起搏型多巴胺能神经元、新皮层神经元以及视交叉上核（SCN）的GABA能神经元。16,17. 在大多数应用中，Ca2+ 成像技术无法达到电生理学相同的 temporal 分辨率。因此，单个 Ca2+ 事件类似于神经元动作电位的爆发。这可以解释为 Ca2+ 成像技术能够相对准确地测量起搏细胞中的异常爆发样电活动，因此适用于钙信号相关的高内涵筛选2+-介导的兴奋性毒性细胞死亡。
为了实现并维持细胞的自发性 Ca2+ 活动，实验方案中需重点关注两个关键点。第一是解剖后细胞的接种密度。对于原代腹侧中脑（VM）神经元，以往研究通常采用约 100,000 个细胞/cm2 的密度9,10。我们已对该方案进行调整，将接种密度设为 200,000 个细胞/cm2，这能够产生多样化的自发性活动模式，并增加每张盖玻片上多巴胺能 VM 神经元的数量。由于不同起搏神经元具有不同的放电特性16，因此接种密度需根据所研究的细胞类型进行个性化设置，并优化至理想的自发性活动水平。第二点是腺相关病毒（AAV）感染后的孵育时间。与接种密度类似，该时间取决于具体的研究问题及所使用的 AAV 类型。对于本实验中使用的特定 AAV，病毒感染后孵育 5 天可达到理想的蛋白表达水平，从而实现 GCaMP 荧光的动态变化，以便记录 Ca2+ 活动。多种因素会影响 AAV 表达其携带蛋白的速度和效率，其中许多因素超出了本方法的范围；但简要而言，需重点考虑启动子活性以及目的蛋白成熟和折叠的速率。
该方法的另一个优势在于，它在实验设计、表达载体、成像设备的使用以及可解决的科学问题范围方面具有相当大的灵活性。此外，该方法可用于探究围绕帕金森病（PD）中谷氨酸介导的兴奋性毒性以及其他神经系统功能障碍模型的一系列具体问题。例如，谷氨酸介导的兴奋性毒性涉及多种受体和信号级联反应5。通过使用该方法，并如图1中AMPAR阻断剂NBQX所示，可以在生理学和分子水平上解析兴奋性毒性谷氨酸反应的特定组分。理论上，采用第二信使系统的抑制剂进行类似实验，可用来确定这些通路对兴奋性毒性的贡献。此外，本研究中使用的AAV可被改造，以在细胞特异性启动子驱动下表达GECIs&#160;，或表达AAV介导的光遗传学传感器，用于检测其他参数，如神经递质的释放。
除了初级胚胎解剖和共聚焦成像外，本实验方案的大部分步骤均使用基础的实验室技术，无需特殊培训。因此，该模型的局限性主要包括胚胎解剖技术的难度、细胞培养至成熟所需的时间较长，以及需要具备共聚焦显微镜或类似的成像设备。尽管存在这些限制，该方法的诸多优势和灵活性仍远超其不足，使其成为研究谷氨酸介导的兴奋性毒性在神经系统疾病中作用的理想模型。最后，该模型还可作为有效工具，用于筛选具有抗凋亡效应及能够维持多巴胺能神经元健康的新化合物。

帕金森病（Parkinson’s Disease, PD）是全球第二常见的神经退行性疾病，目前尚无已知的治愈方法。据估计，帕金森病的患病率将持续上升，仅在美国，到2030年预计确诊人数将超过100万1。由于目前可用于对抗帕金森病的有效治疗手段有限，迫切需要开发更有效的疗法。帕金森病的特征是中脑多巴胺（DA）神经元迅速且进行性地丧失2。帕金森病中神经退行性变的潜在机制尚不明确。现有证据表明，多种机制可能共同作用，例如氧化应激和&#160;线粒体功能障碍等，这些因素可引发凋亡信号级联反应，最终导致细胞死亡3。
一种类似的汇聚机制——谷氨酸介导的兴奋性毒性，已被认为与多种神经退行性疾病相关，包括帕金森病（PD）4尽管谷氨酸介导的兴奋性毒性主要被认为通过过度激活NMDA受体导致细胞内Ca²⁺浓度异常升高而发挥作用2+ 浓度升高并最终启动细胞凋亡，Ca2+通透性AMPA受体也已被证实在兴奋性毒性反应中发挥作用5,6,7因此，研究AMPA受体在帕金森病模型中对谷氨酸介导的细胞凋亡的贡献具有重要意义。可通过使用NBQX（一种AMPA和海人藻酸受体阻断剂）实现该目的，NBQX在微摩尔浓度下对AMPA受体具有选择性&#160;受体8谷氨酸介导的兴奋性毒性及凋亡信号级联反应是衡量细胞死亡程度的理想下游靶点，也是潜在的治疗干预靶点。因此，建立一种高内涵方法，用于评估谷氨酸介导的原代腹侧中脑（VM）神经元钙活性及其相关下游信号通路的调控作用，将有助于筛选能够保护神经元健康的新治疗方法。
在此，我们建立了一种实验方案，利用AAV2/5载体并结合人源突触素（hSyn）启动子表达遗传编码的钙离子指示剂（GECI）GCaMP6f，以检测小鼠中脑（VM）原代神经元在谷氨酸刺激下产生的Ca2+活性，该活性可在生理学和分子水平上进行测量。该高内涵筛选方法可用于发现能够调节Ca2+活性、从而保护VM神经元健康的药物或治疗手段。我们提出，该原代培养模型是一种有效的筛选新干预策略的方法，可用于评估其保护VM神经元健康及延缓帕金森病（PD）进展的能力。

<table><tbody><tr><td>10% 甲醛/PBS</td><td>VWR</td><td>100496-506</td><td></td></tr><tr><td>10倍物镜，数值孔径（NA）0.3，水浸式</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 圆形盖玻片，1号</td><td>Phenix Research Products</td><td>MS20-121</td><td></td></tr><tr><td>20倍物镜，数值孔径（NA）0.85，油浸式</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO20XO</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 未包被塑料细胞培养皿</td><td>VWR</td><td>25382-348</td><td></td></tr><tr><td>40倍物镜，数值孔径（NA）0.3，水浸式</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>60倍物镜，数值孔径（NA）1.35，油浸式</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XO</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素（钠盐）</td><td>Gold Bio</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td>50倍储存液</td></tr><tr><td>双目光学显微镜</td><td>Kent Scientific</td><td>KSCXTS-1121</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;），无水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>鸡多克隆抗酪氨酸羟化酶抗体</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I（DNase）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖，无水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX 培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>马血清</td><td>ThermoFisher</td><td>26050088</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>光纤照明系统，100V</td><td>Kent Scientific</td><td>KSC5410</td><td></td></tr><tr><td>滤器系统，PES 22 µm 250 mL</td><td>VWR</td><td>28199-764</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 1000 共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 1200 共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗鸡 Alexa Fluor 594 多克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab150176</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa Fluor 594 多克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>1倍汉克平衡盐溶液（HBSS）</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>101170-478</td><td></td></tr><tr><td>HeraCell 150 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Heraeus (ThermoFisher)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ v1.52e</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRIS 细剪刀（圆头型）-不锈钢直剪，31×8 mm，13 cm</td><td>RWD</td><td>S12014-13</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素单硫酸盐</td><td>Gold Bio</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>VWR</td><td>97061-634</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;），无水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MPII 微型蠕动泵，115/230 VAC，50/60 Hz</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>MULLER 显微镊子-直头，0.15 mm 尖端，11 cm</td><td>RWD</td><td>F11014-11</td><td></td></tr><tr><td>NBQX</td><td>Hello Bio</td><td>HB0443</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS）</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Origin 2020</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Addgene</td><td>100837-AAV1</td><td>滴度：1.00E+13 gc/mL</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington Biomedical Corporation</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>1倍磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl），无水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>MPII 泵头管路组件</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-4148</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆抗caspase-3抗体</td><td>Abcam</td><td>ab32351</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl），无水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td>BioXtra，&amp;ge;99.5%（GC）</td></tr><tr><td>妊娠雌性 C57BL/6 小鼠</td><td>Texas A&amp;amp;M Institue for Genomic Medicine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>宽口蓝色 P1000 移液器吸头</td><td>VWR</td><td>83007-380</td><td></td></tr></tbody></table>

量化原代小鼠中脑神经元中自发性 ca2+ 流及其下游效应

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

帕金森病（PD）是一种由多巴胺能（DA）神经元变性引起的严重神经退行性疾病。由于谷氨酸受体异常激活导致过量的Ca2+内流，引发DA神经元兴奋性毒性，已被确认为DA神经元丢失的重要机制。在本研究中，我们从ED14小鼠胚胎的腹侧中脑（VM）分离、解离并培养中脑神经元。随后，我们用一种腺相关病毒（AAV）感染长期培养的原代小鼠中脑神经元，该病毒在人神经元特异性突触素启动子（hSyn）调控下表达基因编码的钙指示蛋白GCaMP6f。通过活细胞共聚焦成像，我们显示，由AAV-hSyn-GCaMP6f检测到培养的小鼠中脑神经元存在自发性Ca2+波动。向中脑培养物中施加谷氨酸会引起神经元内Ca2+浓度异常升高，并伴随DA神经元中caspase-3的激活，免疫染色结果证实了这一点。鉴定谷氨酸介导的原代小鼠DA神经元凋亡的技术，在筛选保护DA神经元健康的高通量药物方面具有重要应用价值。

细胞初次培养后，我们在14天体外培养（DIV）时对VM培养皿进行处理 1 µL 注射AAV hSyn-GCaMP6f并允许病毒表达5天。成像当天新鲜配制HEPES记录缓冲液。我们使用了两种条件：一种条件下 20 µM 谷氨酸作用10分钟，而在另一条件下为5分钟 10 µM NBQX 应用先于10分钟的共同应用 10 µM NBQX + 20 µM 谷氨酸。在两种条件下，我们均观察到GCaMP6f荧光的异质性且自发的变化，表明存在自发的Ca2+ 通量，如代表性轨迹图所示（图1A,B, 补充影片 1-2）。应用 20 µM 谷氨酸诱导产生强烈且持续的Ca2+ 在自发活跃和静息状态的神经元中均有反应（图1A, 补充视频 1）。应用 10 µM NBQX 减少了自发活动，并部分阻断了谷氨酸反应（图1B, 补充影片 2). 谷氨酸处理刺激Ca2+ 每种条件下的反应通过曲线下面积、峰值振幅和反应潜伏期进行量化。谷氨酸处理组与NBQX + 谷氨酸处理组的曲线下面积和峰值振幅均相似（图1C），而NBQX + 谷氨酸条件下反应潜伏期显著延长（图2A,B). 除了定量 Ca2+ 为检测对谷氨酸处理的反应，我们使用抗caspase-3抗体对样本进行固定和染色，以评估谷氨酸介导的细胞凋亡。在不同条件下观察到不同程度的caspase-3激活图3A，B通过测量caspase-3活化区域面积及其平均荧光强度来定量分析caspase-3的活化情况。与未处理的对照组细胞相比，在谷氨酸以及NBQX + 谷氨酸处理条件下，发生caspase-3活化的细胞面积平均值趋于显著性差异（图3B）。与未处理对照组相比，谷氨酸组及NBQX + 谷氨酸组的caspase-3平均强度显著升高（图3B）。综上所述，这些结果展示了一种高内涵分析框架，可通过定量Ca2+ 对兴奋性毒性物质的反应，并在同一批培养物中进一步分析下游凋亡事件，如caspase-3的活化。
<img alt="钙信号事件分析图；谷氨酸和NBQX对Ca²⁺动态的影响" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：培养的腹侧中脑神经元表现出自发性Ca2+活动，并对谷氨酸刺激产生强烈反应。（A）腹侧中脑神经元中自发性Ca2+活动的代表性轨迹及其对20 µM谷氨酸刺激的反应。（B）腹侧中脑神经元中自发性Ca2+活动的代表性轨迹及其对10 µM NBQX + 20 µM谷氨酸刺激的反应。（C）群体数据分析，显示Ca2+轨迹曲线下面积与峰值振幅。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="谷氨酸反应的潜伏期变化；AMPAR阻断图示；ΔF/F₀幅度；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：使用NBQX阻断AMPAR延迟了培养的腹侧中脑神经元对谷氨酸刺激的反应。（A）谷氨酸（灰色）和NBQX+谷氨酸（蓝色）诱发的Ca2+信号代表性轨迹。叠加显示了谷氨酸（黑色）和NBQX+谷氨酸（红色）的平均Ca2+信号轨迹。（B）群体数据展示谷氨酸与NBQX+谷氨酸诱发反应的反应潜伏期。右侧图示显示谷氨酸条件与NBQX+谷氨酸条件之间的百分比变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="神经元凋亡分析；Caspase-3、TH荧光显微图像；多巴胺能神经元区域图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：谷氨酸处理可增加酪氨酸羟化酶（TH）阳性腹侧中脑神经元中caspase-3的表达。（A）腹侧中脑培养物的代表性共聚焦图像，经caspase-3（绿色）和TH（红色）免疫染色，比例尺 = 10 µm。（B）群体数据分析，显示各实验条件下多巴胺能神经元的面积及caspase-3表达的平均灰度值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
补充视频 1：自发性 Ca2+ 活动及对谷氨酸施加的反应。 
在 HEPES 记录缓冲液存在条件下观察到的自发性 Ca2+ 流动（0–300 秒），随后施加 20 µM 谷氨酸（301–600 秒）。比例尺 = 50 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 2：自发性 Ca2+ 活性及对 NBQX + 谷氨酸应用的反应。 
在 HEPES 记录缓冲液存在下记录的自发性 Ca2+ 流动（0–300 秒），随后应用 10 µM NBQX（301–600 秒）以及 10 µM NBQX + 20 µM 谷氨酸（601–900 秒）。比例尺 = 50 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本文介绍了一种利用原代小鼠中脑神经元培养物，在体外检测中脑神经元内Ca2+流及其对caspase-3下游效应的方法。该模型可用于研究与中脑神经元Ca2+活动异常相关的病理生理变化，并用于筛选具有抗凋亡特性的新型治疗药物。

量化原代小鼠中脑神经元中自发性 Ca2+ 流及其下游效应

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种由多巴胺能（dopaminergic, DA）神经元变性引起的破坏性神经退行性疾病。过量的 Ca2+ 内流……

本方案可定量测定在帕金森病中丢失的多巴胺能神经元中的钙流。这有助于理解异常钙如何导致帕金森病中的多巴胺能神经元丢失。我们首次在培养的原代中脑神经元中展示了自发性钙流。该方法可用于解析钙介导的凋亡过程中特定受体的作用。我们的方法为高内涵药物筛选提供了途径，以发现针对帕金森病的特异且有效的神经保护化合物。这些神经保护化合物可防止多巴胺能神经元中钙介导的凋亡。每皿加入含一微升 hSyn-GCaMP6f AAV 的一毫升无血清 DMEM 培养基。吸除各皿中的细胞培养基，替换为一毫升含 hSyn-GCaMP6f 的上述 DMEM 培养基。将培养皿放回 37 °C 培养箱中孵育一小时。孵育后，吸除含 AAV 的培养基，更换为三毫升细胞培养基。将培养皿置于 37 摄氏度孵育 5 至 7 天，在此病毒感染期间每 2 至 3 天更换一次培养基。根据文稿说明，配制1升HEPES记录缓冲液、200毫升20微摩尔谷氨酸记录缓冲液和200毫升10微摩尔NBQX记录缓冲液。用3毫升记录缓冲液填充一个无菌的35毫米培养皿。从培养箱中取出含有感染培养物的培养皿，然后用尖头镊子小心夹住一张盖玻片的边缘，将其转移至盛有记录缓冲液的培养皿中。将剩余的盖玻片连同培养基放回37摄氏度培养箱中，并将含有记录缓冲液的培养皿转移至共聚焦显微镜。启动成像软件。在软件初始化的同时，开启蠕动泵并将管路放入记录缓冲液中。然后将流速校准至每分钟2毫升。用精细镊子将感染的盖玻片从培养皿转移至记录浴槽中。使用10倍水浸物镜和明场照明，找到焦平面并寻找神经元胞体密度较高的区域，随后切换至40倍物镜并对样品重新调焦。在染料列表窗口中选择并应用 AlexaFluor 488。为防止荧光染料过度曝光和光漂白，应从较低的高压（HV）和激光功率设置开始。对于 AlexaFluor 488 通道，将高压（HV）设为 500，增益设为 1x，偏移设为零。将488激光线的功率设置为5%。将针孔尺寸增大至300微米，并使用聚焦x2扫描选项，以将发射信号最佳调整至未饱和水平。随后可针对每个通道的最优可见性进一步调整设置。显微镜参数优化后，移动载物台以定位一个包含多个呈现GCaMP6f荧光自发变化的细胞区域，并聚焦于所需的成像平面。使用裁剪矩形工具将成像帧裁剪至可实现略低于1秒帧间隔的尺寸。将时间间隔设为1.0，窗口数量设为600。要采集时间序列电影，请选择“时间”选项，然后使用 Xyt 扫描模式开始成像。观察成像进度条，并在适当的时间点将移液管从 HEPES 记录缓冲液移入 20 µM 谷氨酸记录缓冲液。成像完成后，点击“序列完成”按钮，并保存最终的时间序列电影。继续灌注谷氨酸额外五分钟，使神经元培养物暴露于谷氨酸的总时长达到10分钟。对每一张待成像的盖玻片重复此过程。实验结束后可立即观察钙信号轨迹和神经元胞体。使用椭圆工具在神经元胞体周围绘制所需数量的感兴趣区域（ROI）。然后使用系列分析按钮来可视化信号轨迹。在额外暴露于谷氨酸五分钟之后，用精细镊子将盖玻片从浴槽中取出，并放回含有记录缓冲液的培养皿中，直至完成全部成像。成像当天，VM 培养物分别用谷氨酸或谷氨酸与 NBQX 的联合溶液处理。在两种条件下均观察到 GCaMP6f 荧光的异质性和自发性变化，表明存在自发性钙离子流。施加谷氨酸可在自发性活跃和静息状态的神经元中均引发显著且持续的钙反应。应用NBQX降低了自发性活动，并部分阻断了谷氨酸反应。通过计算曲线下面积、峰值幅度以及反应潜伏期，对每种条件下谷氨酸应用所激发的钙反应程度进行了量化。在NBQX与谷氨酸共同作用条件下，反应潜伏期延长。为了检测谷氨酸介导的细胞凋亡，对细胞进行固定并使用抗Caspase-3抗体染色。与未处理的对照组相比，两种处理条件下的平均Caspase-3强度均显著升高。通过计数对照组和谷氨酸处理条件下酪氨酸羟化酶免疫染色阳性的多巴胺能神经元数量，可对兴奋性毒性细胞死亡进行更深入的分析。该技术为理解多巴胺能神经元中钙介导的凋亡所涉及的不同受体和铁通道的相对作用奠定了基础。

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定量自发 Ca2+ 通量及其在原发性小鼠中脑神经元中的下游效应

本方案详细介绍了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物和脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记突触前终末以及突触后特化位点。我们将突触定义为这些标记物产生的信号之间共定位的位点。...

量化突触：一种基于免疫细胞化学的突触数量检测方法

本视频展示了使用携带荧光钙指示剂的腺相关病毒对原代小鼠中脑神经元进行感染。该指示剂的荧光可证实感染成功，并实现对神经元感染的实时监测。...

利用基因工程改造的腺相关病毒转导原代小鼠中脑神经元

来源： Bancroft, E. A., et al. 定量分析原代小鼠中脑神经元中的自发性 Ca2+ 流动及其下游效应. J. Vis. Exp. (2020)...

小鼠胚胎来源腹侧中脑神经元中钙离子内流的可视化

我们描述了一种通过双侧初级躯体感觉皮层（S1）上方的双光窗记录神经元活动的实验方法 Thy1- 使用双光子（2P）显微镜的GCaMP6s转基因小鼠 体内.

使用 Thy1-GCaMP6s 转基因小鼠对初级躯体感觉皮层中的神经活动进行成像

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。...

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

我们提出了一项分为两个部分的实验方案，该方案结合了荧光钙成像与原位杂交技术，使实验人员能够在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达谱相关联。...

荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 Xenopus laevis

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

本方案描述了背根神经节（DRG）的手术暴露过程，随后在对同侧后爪施加多种刺激的同时，利用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行GCaMP3（基因编码的Ca2+指示剂；绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）Ca2+成像。...

体内完整背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

发育过程中，新皮层的初级感觉区表现出独特的自发性活动。本文介绍了如何在新生小鼠中可视化单个神经元活动及初级感觉区，以分析特定脑区的同步活动 体内.

活体单神经元分辨率下新生小鼠感觉皮层自发活动的可视化

本方案描述了 体内 完整三叉神经节（TG）神经元的GCaMP钙成像。该描述包括TG暴露手术， 体内 共聚焦显微镜成像三叉神经节神经元、在三叉神经节神经元显微成像期间施加体感刺激，以及分析 体内 GCaMP...

体内完整三叉神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

了解使用GCaMP6f钙成像技术定量分析原代小鼠中脑神经元自发Ca²⁺通量的方法。该技术可解析钙介导细胞凋亡的受体机制，为帕金森病神经保护药物筛选提供高通量平台。

量化原代小鼠中脑神经元中自发性 Ca²⁺ 流及其下游效应

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