量化原代小鼠中脑神经元中自发性 Ca²⁺ 流及其下游效应

本方案可定量测定在帕金森病中丢失的多巴胺能神经元中的钙流。这有助于理解异常钙如何导致帕金森病中的多巴胺能神经元丢失。我们首次在培养的原代中脑神经元中展示了自发性钙流。

该方法可用于解析钙介导的凋亡过程中特定受体的作用。我们的方法为高内涵药物筛选提供了途径，以发现针对帕金森病的特异且有效的神经保护化合物。这些神经保护化合物可防止多巴胺能神经元中钙介导的凋亡。

每皿加入含一微升 hSyn-GCaMP6f AAV 的一毫升无血清 DMEM 培养基。吸除各皿中的细胞培养基，替换为一毫升含 hSyn-GCaMP6f 的上述 DMEM 培养基。将培养皿放回 37 °C 培养箱中孵育一小时。

孵育后，吸除含 AAV 的培养基，更换为三毫升细胞培养基。将培养皿置于 37 摄氏度孵育 5 至 7 天，在此病毒感染期间每 2 至 3 天更换一次培养基。

根据文稿说明，配制1升HEPES记录缓冲液、200毫升20微摩尔谷氨酸记录缓冲液和200毫升10微摩尔NBQX记录缓冲液。用3毫升记录缓冲液填充一个无菌的35毫米培养皿。从培养箱中取出含有感染培养物的培养皿，然后用尖头镊子小心夹住一张盖玻片的边缘，将其转移至盛有记录缓冲液的培养皿中。

将剩余的盖玻片连同培养基放回37摄氏度培养箱中，并将含有记录缓冲液的培养皿转移至共聚焦显微镜。启动成像软件。在软件初始化的同时，开启蠕动泵并将管路放入记录缓冲液中。

然后将流速校准至每分钟2毫升。用精细镊子将感染的盖玻片从培养皿转移至记录浴槽中。使用10倍水浸物镜和明场照明，找到焦平面并寻找神经元胞体密度较高的区域，随后切换至40倍物镜并对样品重新调焦。

在染料列表窗口中选择并应用 AlexaFluor 488。为防止荧光染料过度曝光和光漂白，应从较低的高压（HV）和激光功率设置开始。对于 AlexaFluor 488 通道，将高压（HV）设为 500，增益设为 1x，偏移设为零。

将488激光线的功率设置为5%。将针孔尺寸增大至300微米，并使用聚焦x2扫描选项，以将发射信号最佳调整至未饱和水平。随后可针对每个通道的最优可见性进一步调整设置。

显微镜参数优化后，移动载物台以定位一个包含多个呈现GCaMP6f荧光自发变化的细胞区域，并聚焦于所需的成像平面。使用裁剪矩形工具将成像帧裁剪至可实现略低于1秒帧间隔的尺寸。将时间间隔设为1.0，窗口数量设为600。

要采集时间序列电影，请选择“时间”选项，然后使用 Xyt 扫描模式开始成像。观察成像进度条，并在适当的时间点将移液管从 HEPES 记录缓冲液移入 20 µM 谷氨酸记录缓冲液。成像完成后，点击“序列完成”按钮，并保存最终的时间序列电影。

继续灌注谷氨酸额外五分钟，使神经元培养物暴露于谷氨酸的总时长达到10分钟。对每一张待成像的盖玻片重复此过程。实验结束后可立即观察钙信号轨迹和神经元胞体。

使用椭圆工具在神经元胞体周围绘制所需数量的感兴趣区域（ROI）。然后使用系列分析按钮来可视化信号轨迹。在额外暴露于谷氨酸五分钟之后，用精细镊子将盖玻片从浴槽中取出，并放回含有记录缓冲液的培养皿中，直至完成全部成像。

成像当天，VM 培养物分别用谷氨酸或谷氨酸与 NBQX 的联合溶液处理。在两种条件下均观察到 GCaMP6f 荧光的异质性和自发性变化，表明存在自发性钙离子流。施加谷氨酸可在自发性活跃和静息状态的神经元中均引发显著且持续的钙反应。

应用NBQX降低了自发性活动，并部分阻断了谷氨酸反应。通过计算曲线下面积、峰值幅度以及反应潜伏期，对每种条件下谷氨酸应用所激发的钙反应程度进行了量化。在NBQX与谷氨酸共同作用条件下，反应潜伏期延长。

为了检测谷氨酸介导的细胞凋亡，对细胞进行固定并使用抗Caspase-3抗体染色。与未处理的对照组相比，两种处理条件下的平均Caspase-3强度均显著升高。通过计数对照组和谷氨酸处理条件下酪氨酸羟化酶免疫染色阳性的多巴胺能神经元数量，可对兴奋性毒性细胞死亡进行更深入的分析。

该技术为理解多巴胺能神经元中钙介导的凋亡所涉及的不同受体和铁通道的相对作用奠定了基础。