定量自发 Ca2+ 通量及其在原发性小鼠中脑神经元中的下游效应
September 9th, 2020
在这里，我们提出了一个协议，测量体外Ca 2+ 通量在中脑神经元及其下游影响卡斯帕塞-3使用原发性小鼠中脑培养。该模型可用于研究与中脑神经元异常Ca2+ 活性相关的病理生理变化，并筛选抗凋亡特性的新疗法。
该协议量化多巴胺能神经元中的钙通量，这些神经元在帕金森病中丢失。这对于了解异常钙如何导致帕金森病多巴胺神经元损失非常有用。我们首次展示了培养的原发性中脑神经元中的自发钙通量。
此方法可用于解剖钙中质凋亡中涉及的特定受体贡献。我们的方法为高含量药物筛选提供了一个途径，以发现帕金森病的特定和有效的神经保护化合物。这些神经保护化合物将防止多巴胺神经元中钙介质凋亡。
首先准备一毫升无血清DMEM介质，每盘一粒hSyn-GCaMP6f AAV。从每道菜中吸出细胞培养基，用 hSyn-GCaMP6f 将其替换为一毫升的已准备好的 DMEM。将盘子放回37摄氏度的孵化器中一小时。
孵育后，用AAV吸升培养，代之以三毫升细胞培养培养。在37摄氏度下孵化5至7天。在整个病毒感染期间，每两到三天更换一次介质。
根据稿稿说明，准备一升 HEPES 记录缓冲液、200 毫升 20 微摩尔谷氨酸记录缓冲液和 200 毫升 10 微摩尔 NBQX 记录缓冲液。用三毫升的录音缓冲液填充无菌的35毫米培养皿。从培养箱中取出与受感染培养物的培养皿，然后用细尖钳小心地抓住一个盖滑的边缘，然后用记录缓冲器将其转移到培养皿中。
将剩余的盖滑中移回 37 摄氏度的培养箱，然后将带记录缓冲液的培养皿运送到共合显微镜中。启动映像软件。初始化时，启动近位泵，将管路放入记录缓冲区。
然后将流量校准为每分钟两毫升。将受感染的盖滑从培养皿转移到带细钳的录音浴。使用 10X 水浸目标和亮场光，找到焦点平面并查找神经元细胞体高密度区域，然后切换到 40 倍目标并重新聚焦样本。
在"染料"列表窗口中选择并应用 AlexaFluor 488。为了防止荧光团过度曝光和照片漂白，请从低高压和激光功率设置开始。对于 AlexaFluor 488 通道，将 HV 设置为 500，将增益设置为 1 倍，将偏移设置为零。
将 488 激光线的功率设置为 5%。将针孔尺寸增加至 300 微米，并使用对焦 x2 扫描选项以最佳方式将发射信号调整到饱和水平。然后可以调整设置，以优化每个通道的可见性。
显微镜设置优化后，移动舞台以定位具有多个细胞的区域，该区域在 GCaMP6f 荧光中显示自发变化，并专注于所需的平面进行成像。使用"剪辑"工具将成像帧剪辑到可达到不到一秒的帧间隔的大小。将间隔窗口设置为值 1.0，将 Num 窗口设置为 600。
要捕获 t 系列影片，请选择"时间"选项，然后使用 Xyt 扫描选项开始成像。观看成像进度条，并在适当的时间点将线从 HEPES 记录缓冲区移动到 20 微摩尔谷氨酸记录缓冲区。完成成像后，选择完成序列的按钮并保存完成的 t 系列影片。
继续多用谷氨酸五分钟，使神经元的培养被谷氨酸接触共10分钟。对要成像的每个盖单重复此过程。实验后立即可以查看钙的痕迹和神经元细胞体。
使用椭圆工具绘制神经元周围所需的 ROIs 数量。并使用"系列分析"按钮可视化跟踪。在额外五分钟接触谷氨酸后，用细钳从浴缸中取下盖滑，然后用记录缓冲液将其放回培养皿中，直到完成所有成像。
在成像当天，VM 培养物被处理谷氨酸或谷氨酸和 NBQX 的组合。在这两种条件下，观察到GCaMP6f荧光的异质和自发变化，表明自发的钙通量。谷氨酸的应用在自发活性和静止神经元中产生了强大和持续的钙反应。
NBQX的应用减少了自发活性，并部分阻断了谷氨酸反应。谷氨酸应用在每个条件下刺激钙反应的程度使用曲线下的区域、峰值振幅和响应延迟进行量化。在 NBQX 和谷氨酸条件下，响应延迟增加。
为了测量谷氨酸介质的凋亡，这些细胞被固定并染色在抗卡斯帕塞-3抗体中。与未经治疗的对联相比，两种治疗条件下均值的 caspase-3 强度要高得多。通过计算控制和谷氨酸治疗条件下的免疫盐酪氨酸羟基酶阳性多巴胺能神经元的数量，可以更彻底地分析兴奋的毒性细胞死亡。
这项技术为了解多巴胺神经中钙介质凋亡的不同受体和铁通道的相对贡献铺平了道路。
概述
本研究提出了一种使用小鼠原代中脑培养物测量体外钙（Ca2+）通量的协议，以中脑神经元为研究对象。该模型探讨了与异常钙活动相关的病理变化，特别是在帕金森病的背景下，并为筛选潜在的神经保护治疗药物提供了平台。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 神经药理学
背景
- 神经元中的钙通量在许多细胞过程中起着至关重要的作用。
- 多巴胺能神经元丧失是帕金森病的标志。
- 该研究探讨了异常钙水平如何在多巴胺能神经元中诱导细胞凋亡。
- 谷氨酸和NBQX的应用有助于评估钙介导的反应和神经保护效应。
研究目的
- 测量原代中脑神经元培养物中自发的钙通量。
- 了解受体对钙介导的细胞死亡的贡献。
- 促进神经保护化合物的高内容筛选。
使用的方法
- 使用源自小鼠原代中脑神经元的细胞培养物。
- 钙成像使用GCaMP6f监测荧光变化。
- 关键步骤包括培养基的制备和谷氨酸的应用。
- 在显微镜下进行了时间敏感的成像，并仔细设置参数。
- 细胞被处理为谷氨酸或谷氨酸和NBQX的组合。
主要结果
- 钙反应因处理条件而异，显示出自发和谷氨酸诱导的变化。
- 经处理的神经元中的Caspase-3活性显著增高，表明细胞凋亡过程。
- NBQX的应用减少了自发活动并改变了谷氨酸反应。
- 该方法显示了解析受体特异性对神经元死亡贡献的潜力。
结论
- 本研究使得对多巴胺能神经元中的钙介导的细胞凋亡进行详细探索成为可能。
- 该协议作为筛选与帕金森病相关的神经保护剂的有价值工具。
- 研究结果为神经退行性病理机制和治疗靶点提供了见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantification of spontaneous and glutamate-evoked calcium fluxes in primary mouse midbrain neurons, providing a disease-relevant system to model dopaminergic neuron excitotoxicity in Parkinson's disease. By linking calcium dynamics to caspase-3 activation, it supports mechanistic de-risking of neuroprotective compounds through functional readouts of neuronal survival. The approach offers translational continuity from target validation to preclinical screening by enabling high-content assessment of drug effects on calcium-mediated apoptosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses around glutamate receptor-mediated calcium influx in dopaminergic neuron loss.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring calcium flux as a proximal readout of receptor activity.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by linking receptor modulation to downstream apoptotic outcomes via caspase-3 activation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, real-time measurements of intracellular calcium changes as a functional assay output.
- Operational Value: Enables assay standardization through defined glutamate and NBQX treatment conditions and imaging parameters.
- Scalability: Supports high-content screening format via live imaging and automated ROI analysis of neuronal soma.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker: Uses caspase-3 activation as a measurable endpoint of glutamate-induced apoptosis in tyrosine hydroxylase-positive neurons.
- Preclinical Model: Establishes a disease-relevant system using primary ventral mesencephalon neurons to model Parkinson's disease-related excitotoxicity.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables prioritization of compounds based on their ability to suppress calcium flux and downstream caspase-3 activation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing by providing a functional readout of neuronal health in a Parkinson's disease-relevant model.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of glutamate receptor contributions to calcium-mediated apoptosis in dopaminergic neurons.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized calcium flux measurements and apoptosis detection via immunostaining.
- Analytics: Generates quantitative outputs including area under the curve, peak amplitude, and latency to respond for calcium traces, enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects calcium dysregulation to apoptotic cell death in dopaminergic neurons, supporting biomarker alignment with neurodegenerative pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating neuroprotective compounds across multiple screening campaigns targeting calcium homeostasis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating calcium flux as a key driver of dopaminergic neuron apoptosis.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized viral transduction, imaging buffer preparation, and confocal parameter settings.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional evidence of target engagement and neuroprotection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that mitigate calcium-mediated apoptosis in disease-relevant neurons.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuronal culture, viral transduction, and live confocal imaging.
- Dependent on instrumentation including confocal microscope with perfusion system and ROI analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of glutamate exposure timing, NBQX co-application, and caspase-3 staining protocols.
- Involves adaptation considerations when translating from mouse to human neuronal models or alternative disease contexts.
- Limited by variability in primary neuron transfection efficiency and baseline spontaneous activity across preparations.
