Name: 使用胸苷类似物BrdU分析大鼠细胞增殖和神经发生的免疫组织化学技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习使用BrdU免疫组织化学技术检测大鼠脑组织中细胞增殖与神经发生的方法。该方案涵盖胸苷类似物腹腔注射、组织处理及显微成像等关键步骤，为评估成年海马齿状回神经发生提供可靠手段。

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我们感谢 Miguel Burgos 先生和 Gustavo Lago 提供的技术支持。同时感谢 Clorinda Arias 博士、Karla Hernandez 博士和 Oscar Galicia 博士在试剂和材料方面给予的大力支持。我们还要感谢墨西哥城伊比利亚美洲大学研究与研究生部为本工作的开展提供资金支持，并承担了视频制作的相关费用。

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<li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+%28CldU+and+IdU%29+in+primary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2166(2010).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

成年神经发生是一种主要发生在成年神经前体细胞生态位中的过程，这些细胞具有在其整个生命周期内生成新神经元的潜能。溴脱氧尿苷（BrdU）标记在免疫学中被广泛用于表征成年大脑中新生成细胞的数量。BrdU主要被整合到特定脑区（即神经发生区）的细胞中。这些细胞位于侧脑室下区（SVZ）以及海马齿状回——位于门区与颗粒细胞层之间的颗粒下区（SGZ）1,2,18。 此外，还有一些脑区在成年期具有较低的增殖能力，包括下丘脑、纹状体、新皮层和杏仁核19。如前所述，BrdU染色是成年神经发生研究中常用的检测细胞增殖的方法。然而，将BrdU作为标记物存在局限性和潜在问题。其一是BrdU是一种细胞周期标记物，因此必须进行双重或三重染色以确定细胞命运，并结合细胞标记物来识别被标记细胞所处的特定发育阶段。另一个关于BrdU的问题是，它是一种具有毒性和致突变性的溶液，可能通过改变DNA稳定性而影响细胞功能和细胞周期。在决定给药方案和剂量（50‒600 mg/kg）时，应充分考虑上述信息。另一个关键点是，BrdU是DNA合成的标记物，而非细胞增殖的直接标记物14。因此，有必要将细胞增殖与其他事件区分开来，例如DNA修复、中止性的细胞周期再进入以及基因重复。研究人员必须设置适当的对照，以确保BrdU的正确使用。有关这些问题和局限性的更详细讨论，我们建议参考Taupin的研究工作14。免疫组织化学实验方案的标准化过程可能较为缓慢且具有挑战性。在本研究中，我们已列出成功实施IHC实验所需的所有通用步骤。然而，我们建议每个研究团队在实验前对组织、抗体及实验条件进行测试和评估。测试和评估应针对每种抗体和组织至少在三种不同的孵育时间、洗涤步骤和浓度条件下进行。我们还建议研究人员查阅其他相关实验方案，以便选择最符合其特定需求和要求的最佳方案20,21,22,23,24,25。
如前所述，该操作流程包含多个步骤和方法学上的考量，这些内容在科学文献中经常被提及和使用，后续将对此进行讨论。我们建议研究人员根据技术要求、预算、设备、实验设置以及主要研究目标，谨慎且恰当地选择抗体。抗体必须使用与实验中将要检测的相同类型的组织进行预测试。我们还建议选用已针对相同用途（即免疫组织化学，IHC）验证过的抗体（例如，不仅限于Western blot或流式细胞术），以确认其与固定方法的兼容性。BrdU染色可通过多种途径给予，包括腹腔注射、腹腔输注、口服摄入或脑室内输注（有关每种技术的更详细描述，请参见参考文献26）。如果选择腹腔注射，应确保BrdU被注入腹腔内，并避开肠道区域。因为肠道中含有大量处于增殖状态的细胞，可能会在BrdU到达脑组织之前将其耗尽，从而影响被标记细胞的数量。获得较薄的切片至关重要，因为薄切片有利于溶液更好地渗透。按照Kempermann等人提出的体视学方法27，以头尾方向切割出厚度为40 µm的冠状切片，并将其转移至24孔细胞培养板中。免疫组织化学染色可在载玻片上的贴片组织或游离漂浮切片上进行。由于BrdU位于细胞核内部较深的位置，在游离漂浮切片中溶液更容易渗透，因此可获得更佳的结果以及对目标区域更充分的接触。为了使一抗抗BrdU能够进入，必须打开DNA链（DNA变性）。在本研究中，我们采用盐酸（HCl）孵育来完成这一特定步骤。另一方面，封闭非特异性表位的过程有助于更准确地识别细胞信号。
良好的膜通透性可使抗体充分进入目标区域。在 PBS++ 和 PBS+ 溶液中加入 Triton X-100 等通透剂可改善膜的通透性。本实验方案中可使用 PBS 或 Tris 缓冲盐水（TBS）试剂。从成本角度考虑，TBS 可能相对比 PBS 更便宜。然而，PBS 可能干扰抗磷酸化抗体，并抑制碱性磷酸酶偶联的抗体，因此如果目标蛋白存在翻译后磷酸化修饰（即磷酸化蛋白），应避免使用 PBS。本研究中我们采用了 PBS，发现组织洗涤步骤可获得更特异的信号。我们还建议研究人员使用 TBS 或 PBS 至少进行三次洗涤循环。所有溶液必须新鲜配制。抗原修复（AR）是一种旨在减轻因固定导致抗原性丧失的方法，固定会改变抗原的三级和四级结构，这种改变会使抗原无法被抗体检测到28,29。本方案中采用的热诱导表位修复（HIER）旨在通过高温或强碱性水解（使用其他缓冲液如 pH 8.5 的 EDTA 或 pH 9.5 的 Tris）逆转甲醛与蛋白质之间的化学反应。对于新抗体，必须尝试不同的抗原修复方案进行结果比较，以选择最适合本实验的方案。最后这一步在常规实验中可能是可选的，但我们对组织进行了抗原修复处理，以在本方案中获得更优的结果。
在选择最终的对比染色颜色和复染技术时，必须考虑所使用的初染颜色和方法，以使非染色结构可见，并避免掩盖免疫反应中的初染颜色。对于荧光显微镜观察，DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）是一种广泛使用的细胞核和染色体复染剂，其在结合DNA的AT区域后可发出蓝色荧光（激发波长：360 nm，发射波长：460 nm）。含DAPI的封片介质易于使用且可有效保留荧光信号，有利于图像采集。对于过氧化物反应，免疫组织化学（IHC）可选用多种复染方法，如焦油紫、苏木精、中性红或甲基绿染色。在进行多重免疫染色时，至关重要的是选择与所用固定技术相容的抗体，以避免交叉反应30。当单染过程中出现的问题和困难得到解决后，可根据需要进行另一种颜色的染色。必须严格控制二抗之间的非特异性结合。可通过在使用来自与一抗相同宿主物种的二抗之前，先用该二抗对应的非标记一抗进行封闭来实现饱和。例如，当使用兔来源的抗小鼠二抗和山羊来源的抗兔二抗时，应先使用山羊来源的抗兔二抗，再使用兔来源的抗小鼠二抗。只有在顺序染色方法完全掌握后，方可开始同步免疫染色流程。在此方法中，正确选择二抗尤为关键。理想情况下，所有二抗应来自同一宿主动物，以避免交叉反应。我们建议运行阳性对照，以确认染色方法在出生后海马组织（此阶段神经发生丰富）中能够准确工作。如果阳性对照组织出现染色问题，应重新审查实验步骤，进行修正和调整，并重复实验直至获得良好的染色结果。随后应运行阴性对照，通过省略特定的一抗或以正常血清（与一抗同种属）替代该一抗，来验证抗体的特异性。如引言所述，图像去卷积是一种强大工具，在无法获得共聚焦显微镜时可作为替代方案。该技术可应用于明场透射光、宽场荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜所获取的所有图像。图像去卷积的最终目的是重建原始信号，以弥补成像系统在采集过程中造成的信号退化10。
总之，通过胸腺嘧啶类似物BrdU的免疫检测来鉴定新生成的细胞，是一种复杂但功能强大的技术。本研究旨在帮助科学家——特别是成年海马神经发生领域的研究者——更准确地定量新生细胞。我们希望这项工作能对科学界有所帮助，并使利用免疫组织化学技术精细优化细胞增殖研究变得更加便捷。

几十年来，成年人大脑在一生中持续生成新神经元的观点一直令科学界着迷。科学家通过检测处于分裂状态的细胞，获得了大脑在其整个生命周期中都能产生新神经元的知识1,2。首次在成年大脑中检测到新生神经元的方法是向大鼠颅内注射氚标记的胸腺嘧啶（thymidine-H3），并通过放射自显影技术检测处于细胞周期的细胞1,2。当时报告了胶质细胞的分裂以及神经母细胞的存在，这是关于出生后神经发生现象的首批具有前景的数据之一1。然而，thymidine-H3 的使用和检测涉及放射性物质，可能对操作人员造成危害。1988年，Miller 和 Nowakowski 首次探讨了溴脱氧尿苷（BrdU）免疫组织化学技术在研究神经系统细胞增殖、迁移及来源方面的适用性3。1998年，Eriksson 及其同事发表了一篇论文，显示通过对注射了5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）的患者进行尸检，可在其成年人大脑中观察到新生神经元4。这些患者因标记肿瘤生长而接受了 BrdU 注射（250 mg 静脉注射）4。该技术随后被引入动物模型研究。这些方法的引入标志着该领域的一个里程碑，因其使得无需使用放射性化合物即可检测新生成的细胞。这一技术逐渐成为衡量成年大脑特定微环境中细胞增殖的金标准，推动了该领域后续研究的深入发展。
胸苷类似物技术的局限性在于，它无法确定新生成细胞的细胞身份。然而，免疫组织化学技术使我们能够对同一细胞进行双重或三重标记，从而验证新生成细胞的细胞命运及其成熟阶段，推动了该领域的进一步发展。该方法可用于区分新生成的细胞是胶质细胞、未分化的神经元，还是完全成熟的颗粒细胞，甚至可判断其是否积极参与神经环路活动。该领域另一项突破是利用转基因模型来鉴定巢蛋白（nestin）调控下的未分化细胞。nestin-GFP 转基因小鼠表达增强型绿色荧光蛋白（GFP），该蛋白受 nestin 启动子调控。Nestin 是一种中间丝蛋白，为前体细胞的特征性标志物5。nestin-GFP 转基因小鼠有助于揭示神经发生过程中早期发育阶段的机制6。然而，一个显著的局限性在于，维持 nestin-GFP 转基因小鼠品系需要在实验室设施中提供特殊条件，这对部分科研团队（尤其是来自发展中国家的团队）而言成本较高，难以长期维持。
上述技术各有优缺点。然而，迄今为止，通过免疫组织化学（IHC）鉴定增殖细胞，以及通过免疫荧光进行双标或三标以识别细胞成熟阶段或细胞命运的方法，仍是检测成体神经发生的最可行途径。免疫组织化学的鉴定过程包括使用特异性抗体标记蛋白质、蛋白质结构域或核苷酸，该抗体被称为一抗，可实现对目标分子的识别。一抗随后被二抗识别，二抗偶联有显色剂（如辣根过氧化物酶）或荧光染料（如FITC）。显微镜可检测到显色剂和荧光染料的信号。利用IHC，可以鉴定膜蛋白、细胞骨架蛋白或核内成分（如BrdU）。另一方面，BrdU在S期可竞争性地掺入DNA，因此存在于细胞核中。因此，一个关键步骤是使用HCl进行DNA变性，以打开DNA双链，使BrdU抗体能够接触到DNA中的BrdU。必须注意的是，BrdU在小鼠和大鼠血清中分别于腹腔注射后15分钟和60分钟达到饱和浓度，随后迅速下降，并在60分钟和120分钟时降至无法检测的水平7。
本文介绍了四种不同但密切相关的免疫组化（IHC）技术：使用辣根过氧化物酶（HRP）与DAB（3,3'-二氨基联苯胺）反应进行的无信号放大显色间接检测（步骤4.1）、亲和素-生物素复合物（ABC）放大法（步骤4.1）、无信号放大的间接免疫荧光检测法（步骤4.4）以及标记链霉亲和素-生物素（LSAB）放大法（步骤4.3）。每种方法各有优缺点，适用于特定的组织需求（见表1）。我们选择采用间接免疫组化方法，因其成本较低且操作简便，尤其在使用未标记的一抗时，可灵活地在显色与荧光检测方法之间转换。HRP方法是一种常用的IHC技术，因其成本低、稳定性高、催化效率高且底物易于获取而被广泛使用。然而，我们建议使用阳性对照以确认染色方法的准确性，并使用阴性对照以有效验证抗体的功能。多重免疫染色或多重IHC方法（见步骤6）是单次实验中从组织切片获取大量数据的有力工具，当样本数量有限时，该技术尤为重要。另一优势在于可在保持组织完整性的前提下，同时鉴定在同一细胞区域内共表达的特定蛋白。多重染色可标记在特定增殖阶段表达的不同标志物（如nestin、GFAP、DCX、Ki-67），从而实现更深入的增殖与分化研究8。选择与所用固定方法兼容的抗体至关重要，以避免交叉反应。我们建议对每种新抗体（包括BrdU）单独进行测试，以优化和调整实验条件。随后进行双标顺序染色，最终在完全掌握顺序染色方法后，再开始同步免疫染色流程。为实现该方法，选择合适的二抗至关重要。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>方法</td>
			<td>具体方法</td>
			<td>优点</td>
			<td>缺点</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">间接检测法</td>
			<td>辣根过氧化物酶与DAB反应</td>
			<td>1. 比直接检测法和间接荧光法灵敏度更高。 
			2. 比荧光染料更耐光漂白。 
			3. 比荧光检测法成本更低</td>
			<td>1. 使用较少颜色染料时，多重检测较为困难。 
			2. 对于在同一细胞空间共表达的靶标，检测较复杂。 
			3. 在同一组织上同时检测丰度差异较大的靶标时，动态范围受限。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>荧光法</td>
			<td>1. 使用多种颜色染料进行多重检测时效果最佳且最简便。 
			2. 最适合检测在同一细胞空间共表达的靶标。 
			3. 在同一组织上同时检测丰度差异较大的靶标时，具有更好的动态范围。 
			4. 无需额外步骤。</td>
			<td>1. 灵敏度低于DAB辣根过氧化物酶间接反应法。 
			2. 随时间推移，抗光漂白能力较弱。 
			3. 成本较高。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">信号放大方法</td>
			<td>亲和素-生物素复合物（ABC）</td>
			<td>1. 比直接和间接检测法灵敏度更高。 
			2. 可降低背景信号</td>
			<td>1. 需要额外步骤。 
			2. 比无信号放大方法更昂贵。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>标记链霉亲和素-生物素法（LSAB）</td>
			<td>1. 比直接和间接检测法灵敏度更高。 
			2. 比ABC法具有更强的组织穿透性。 
			3. 可降低背景信号</td>
			<td>1. 需要额外步骤。 
			2. 比ABC法更昂贵。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无额外信号放大方法</td>
			<td>1. 成本较低。 
			2. 无需额外步骤。 
			3. 适用于高丰度靶标检测。</td>
			<td>1. 灵敏度较低：对低丰度靶标检测存在困难。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：免疫组化（IHC）技术的优缺点。 本表列出了间接检测方法（过氧化物酶反应显色法（3,3'-二氨基联苯胺，DAB）和荧光法）以及信号放大方法（亲和素-生物素复合物法（ABC）、标记链霉亲和素-生物素法（LSAB））的优缺点，并包含无额外信号放大方法的比较。
高分辨率图像对于进行准确分析和展示结果至关重要。提高分辨率有两种方法：1）采用更先进的显微镜设计（例如共聚焦显微镜、多光子显微镜）；2）通过去卷积在数值上逆向还原模糊过程，从而增强图像9遗憾的是，由于设备及其维护成本高昂，共聚焦显微镜难以普及。10宽场落射荧光显微镜结合后续对z轴层扫图像的去卷积处理，为共聚焦显微镜提供了一种合适的低成本替代方案8,9如上所述，反卷积的目的是恢复被采集系统削弱的原始信号9通过使用数学去卷积算法，减少由落射荧光显微镜或共聚焦显微镜获取的图像中的模糊、离焦晕影和畸变10获取到的模糊图像可以通过数学方法建模为观察对象与三维点扩散函数（PSF）卷积的结果。PSF 是指显微镜收集的组织样本所发射的点光源的理论衍射图样。PSF 文件需根据每幅图像的具体条件创建，例如相机的 CCD 像元间距、所用介质的折射率、物镜的数值孔径、荧光染料的发射波长、图像尺寸、z 轴堆栈处理中图像的数量及其间距（详见技术规格说明） 表 2）。换句话说，PSF 文件总结了成像系统对显微镜观测结果的影响9然而，我们使用衍射点扩散函数3D插件（Diffraction PSF 3D Plugin，https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D）为每组z轴层析图像（z-stack image）创建特定的PSF文件。z轴层析图像是在同一载玻片XY位置上、从定义深度（z轴方向）获取的一系列数字化光学切片。计算机通过重新分配来自其他焦平面物体的信号，整合来自焦平面的信息以生成图像。为生成z轴层析图像，需从载玻片的不同焦层采集图像（例如，同一XY区域每隔一定距离采集十张不同图像） 1 μm 深度）。然后，我们使用显微镜制造商提供的显微成像软件或 Fiji 软件生成 z-层叠图像或三维图像。结果将是一个单一的层叠图像文件（例如，十张具有不同焦平面的图像）。目前存在多种针对客户定制的工具和软件解决方案，例如用于去卷积显微成像的开源软件。我们将展示使用 DeconvolutionLab2 进行去卷积处理后的输出结果9 即 Fiji11 插件（ImageJ 的分发版本）12）。去卷积将有助于提高最终显微图像的分辨率（参见 图1B，C ）。如需进一步信息和指导，我们强烈建议阅读参考文献13.
<img alt="小鼠脑细胞的荧光显微镜图像，显示 BrdU、DAPI、GFAP 标记；带标注的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：多色通道三维去卷积的代表性图像。（A）低倍镜下的齿状回（DG）。（B）各通道的原始 z 轴层扫图像及合并图像。（C）各通道及合并图像的三维去卷积 z 轴层扫图像。该脑组织来自属于运动组的大鼠。采用标记链霉亲和素-生物素（LSAB）扩增法。结果显示：Cy3 标记的链霉亲和素偶联抗体用于指示 BrdU（红色），DAPI 作为复染剂（蓝色），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞标记物（绿色）。ML = 分子层；GCL = 颗粒细胞层；SGZ = 颗粒下区。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本研究的目的是详细描述免疫染色获得阳性且成功结果的各个步骤，并列出基于BrdU研究中常用的实验流程，且无需使用共聚焦显微镜。BrdU染色是一种需要多个步骤的技术，必须严格遵循操作流程才能获得成功的染色结果。通常，标准化这些染色技术需要数月时间，且耗时耗材。我们预期本文可为刚进入该领域的研究团队提供有用信息，从而减少实验耗时和错误。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;试剂准备与设置&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>供体马血清</td><td>BioWest</td><td>S0900</td><td>PBS中的封闭和孵育溶液</td></tr><tr><td>试剂级多聚甲醛，结晶状（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>有毒，易燃</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436-500G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>J.T Bker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>J.T Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Meyer</td><td>2365-500G</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>腐蚀性，用于校准 pH</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;胸苷类似物BrdU给药&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-溴-2&amp;prime;-脱氧尿苷，BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>有毒的（致突变的，致畸的）</td></tr><tr><td>23&amp;ndash;27G皮下注射针</td><td>BD PrecisionGlide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>PiSA</td><td>30130032</td><td></td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>NIPRO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;组织制备&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 毫升聚丙烯锥形管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯锥形管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>解剖工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>断头台</td><td>斯托尔廷</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>MICROM</td><td>HM525</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 15 mm 聚酯网膜插件</td><td>康宁</td><td>3477</td><td>预装于12孔培养板中</td></tr><tr><td>Netwell 塑料 12 孔板支架套装</td><td>康宁</td><td>3520</td><td>用于15毫米聚酯网膜插件</td></tr><tr><td>Netwell 塑料 6 孔板支架套装</td><td>康宁</td><td>3521</td><td></td></tr><tr><td>灌注泵</td><td>Cole-Parmer</td><td>7553-70</td><td></td></tr><tr><td>振荡器</td><td>IKA</td><td>ROKCER 3D 数字化</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;免疫染色&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>焦宁蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td>1%，对光敏感</td></tr><tr><td>DAB 过氧化物酶（HRP）底物试剂盒（含镍），3,3&amp;rsquo;二氨基联苯胺</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>致癌性，光敏感</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>J.T.Baker</td><td>9535-05</td><td>腐蚀性，用于校准 pH</td></tr><tr><td>过氧化氢，50%</td><td>Meyer</td><td>5375-1L</td><td>有毒，氧化性</td></tr><tr><td>Permount 封片介质</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>光敏感</td></tr><tr><td>VECTASTAIN&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; 精英&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; ABC试剂盒 辣根过氧化物酶（HRP）</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>酶法、基于亲和素/生物素的扩增系统</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;一抗&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔源抗GFAP抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA056030</td><td>1:500</td></tr><tr><td>小鼠源单克隆抗 BrdU 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2531</td><td>1:250</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;二抗&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP（长链间隔）AffiniPure 驴抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，HRP</td><td>Invitrogen</td><td>G-21040</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（全分子），TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5393</td><td>1:250</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附，FITC</td><td>Invitrogen</td><td>F-2765</td><td>1:250</td></tr><tr><td>链霉亲和素，Cy3</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-1300</td><td>1:250</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;成像与分析&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td>戴尔计算机公司</td><td>T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB</td><td>用于控制和监测实验方案&amp;rsquo; 过程</td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Olympus</td><td>UC50</td><td></td></tr><tr><td>CellSens Standard 软件</td><td>Olympus</td><td>cellSens 标准版</td><td>采集软件</td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>高压130 W汞弧灯</td><td>奥林巴斯</td><td>U-HGLGPS</td><td></td></tr><tr><td>低自发荧光浸油</td><td>Olympus</td><td>MOIL-30 型 F</td><td></td></tr><tr><td>微型盖玻片（VWR，货号 48404 454；24&amp;nbsp; 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片（VWR，货号 48323-185；76&amp;nbsp; 26 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-FBW滤光片立方体</td><td>Olympus</td><td>U-FBW</td><td>激发 460 - 495 nm，二向色镜 505 nm，抑制 510 nm</td></tr><tr><td>U-FGW滤光片组</td><td>Olympus</td><td>U-FGW</td><td>激发 530 - 550 nm，二向色镜 570 nm，抑制 575 nm</td></tr><tr><td>U-FUW滤光片组</td><td>Olympus</td><td>U-FUW</td><td>激发 340 - 490 nm，二向色镜 410 nm，抑制 420 nm</td></tr></tbody></table>

利用胸苷类似物brdu分析大鼠细胞增殖与神经发生的免疫组织化学技术

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

在成年海马神经发生（AHN）研究领域中，最重要的环节之一是识别新生成的细胞。胸苷类似物（如5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU））的免疫检测是一种用于可视化这些新生细胞的标准技术。因此，通常通过腹腔注射将BrdU注入小型动物体内，使该胸苷类似物在DNA合成过程中掺入正在分裂的细胞中。随后通过脑切片的免疫组织化学分析进行检测。每一个使用过该技术的研究团队都清楚，要获得成功的染色结果，必须对每一个细微步骤给予特别关注。例如，一个关键步骤是使用盐酸（HCl）进行DNA变性，以使抗体能够进入细胞核并实现染色。然而，现有的科学文献中对此类步骤的详细描述极为有限。因此，对于新建立的实验室而言，标准化该技术具有挑战性，往往需要数月时间才能获得阳性且成功的实验结果。本研究的目的是详细描述并阐明在使用胸苷类似物BrdU进行免疫染色时，如何获得阳性且成功结果的具体操作步骤。该实验方案包括试剂的配制与准备、胸苷类似物在啮齿类动物体内的给药、经心脏灌注、组织处理、过氧化物酶免疫组织化学反应、亲和素-生物素复合物的使用、免疫荧光染色、复染、显微镜成像以及细胞分析。

上述方法用于量化成年大鼠在自主进行体力活动后海马区新生细胞的数量，并与未进行额外体力活动的对照组进行比较。我们采用新生大鼠的海马区作为阳性对照。选取3月龄雄性大鼠，进行为期7天的自主体力活动（无尽转轮）方案。在第6天，大鼠接受BrdU注射（见第2节），之后每12小时注射一次，共完成三次注射。为确保完成三次细胞周期分裂，动物在最后一次BrdU注射后8小时经心脏灌注固定（见第3节）。同样程序也应用于未进行体力活动的3月龄大鼠，作为对比对照组。作为阳性对照，出生后第1天的幼鼠仅接受一次BrdU注射，操作如上文第2节所述。注射后24小时（出生后第2天），幼鼠被实施安乐死，头部浸入PFA溶液中，操作如步骤3.4所述。成年大鼠经深度麻醉（步骤3.1）后，按步骤3.2所述进行经心脏灌注。取出脑组织并进行后固定（步骤3.4）。脑组织被切成40 μm厚的冠状切片（步骤3.5）。切片按步骤4所述进行BrdU免疫组织化学处理。
我们采用辣根过氧化物酶与DAB免疫组化反应（步骤4.1）对齿状回（DG）中BrdU阳性细胞进行染色和计数。图5显示了含有BrdU标记细胞的DG切片。图5C,D展示了DG切片的代表性区域，放大倍数更高。标记细胞呈现强烈的深色染色，以箭头标示。插图显示了实验组和对照组中标记细胞的平均数量（按步骤8.1所述，计数的阳性细胞数乘以6）。Student t检验显示两组间BrdU阳性细胞数量差异具有统计学意义（t(10) = 2.704，p = 0.0222）。未进行体力活动的对照组为2,040 ± 314个细胞（n = 6只大鼠）。相比之下，体力活动组平均有3,606 ± 486个BrdU阳性细胞（n = 6只大鼠）。由此可见，体力活动可增加BrdU阳性细胞数量。因此，本结果与其他已有报道一致，表明体力活动可促进成年齿状回的细胞增殖17。
<img alt="静态平衡，荧光显微镜图像；细胞分布，样本比较，比例尺 10 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：BrdU标记细胞核不同形态的示例。BrdU是一种DNA合成标记物，可标记细胞核。在海马区，BrdU阳性细胞核呈半椭圆形，位于齿状回颗粒下区。由于BrdU通过竞争机制被掺入，每个细胞的掺入量存在差异，这将在后续细胞核的可视化中体现出来。（A）免疫荧光图像。（B）未使用额外扩增方法的过氧化物酶反应图像。黄色箭头指示伪影和非特异性信号。黑色或白色箭头指示BrdU阳性细胞。1 – 核完整、着色深的半椭圆形细胞核。2 – 含有斑点的细胞核，细胞核边界清晰，内部有多个斑点。3 – 斑点较少的细胞核，细胞核边界清晰，内部仅有少量斑点。4 – 较小的细胞核，可能为处于不同分化阶段的细胞，但仍属于该微环境的一部分。5 – 成簇的前体细胞正处于分裂状态，因此可观察到多个细胞聚集形成的致密细胞群。在此类细胞群中，计数时必须格外谨慎，以避免将阳性细胞误判。红色箭头指示正在分裂的细胞核，可能被误认为单个细胞。每个细胞均被框出，并可在Z轴平面上实时区分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经发生分析、共聚焦显微镜、BrdU、DAPI、GFAP、海马细胞层、50 µm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：单通道与合并通道的代表性 RGB 图像。 上方图像显示原始 z 轴层叠图像，下方图像显示三维去卷积后的 z 轴层叠图像。（A）齿状回低倍放大图像。（B）各通道的 RGB 图像，以及（C）RGB 合并图像。该脑组织来自对照组。免疫荧光染色未使用额外的信号放大方法。BrdU（红色）、DAPI 作为复染剂（蓝色）、GFAP（胶质纤维酸性蛋白）作为星形胶质细胞标记物（绿色）。ML = 分子层；GCL = 颗粒细胞层；SGZ = 颗粒下区。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑切片组织学、比较分析、神经发生、显微镜观察、运动对神经发生的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：各实验组中BrdU标记细胞（深色明显）的代表性齿状回（DG）切片。 采用辣根过氧化物酶反应，并结合亲和素-生物素-过氧化物酶复合物扩增法进行染色。(A, B) 显示DG区域的低倍镜图像，(C, D) 显示框选区域的高倍镜图像。图A和图C来自运动组，图B和图D来自对照组。插图显示运动组与对照组中标记细胞的平均数量（按步骤8.1所述，计数阳性细胞后乘以6）。ML = 分子层；GCL = 颗粒细胞层；SGZ = 颗粒下区；箭头指示BrdU阳性细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：视频显示沿 z 轴分布在不同层中的阳性细胞的不同焦平面。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_1.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：沿 z 轴在不同层中分布的阳性细胞簇在不同焦平面的视频展示。 缓慢移动 z 轴以定量分析构成一个簇的多个细胞核。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_2.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>显微镜类型：</td>
			<td colspan="5">落射荧光显微镜 Olympus BX53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>光源：</td>
			<td colspan="5">130 W 高压汞弧灯 (U-HGLGPS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>采集软件：</td>
			<td colspan="5">CellSens 标准版</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">滤光片组：</td>
			<td colspan="2">货号</td>
			<td>激发波长范围</td>
			<td>二向色镜</td>
			<td>抑制波长范围</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">U-FUW</td>
			<td>340 - 490 nm</td>
			<td>410 nm</td>
			<td>420 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">U-FBW</td>
			<td>460 - 495 nm</td>
			<td>505 nm</td>
			<td>510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">U-FGW</td>
			<td>530 - 550 nm</td>
			<td>570 nm</td>
			<td>575 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">相机：</td>
			<td colspan="2">型号：</td>
			<td colspan="3">CCD 相机 UC50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">光谱范围：</td>
			<td colspan="3">290 – 1000 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">CCD 芯片尺寸：</td>
			<td colspan="3">2/3 英寸，2588（宽度 ×7）× 1960（高度 ×8）像素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">像素尺寸：</td>
			<td colspan="3">3.4 × 3.4 µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">荧光染料：</td>
			<td colspan="2">名称</td>
			<td>激发波长 (nm)</td>
			<td>发射波长 (nm) *3</td>
			<td>发射颜色</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">4,6-二脒基-2-苯基-吲哚盐酸盐 (DAPI)</td>
			<td>345</td>
			<td>455</td>
			<td>蓝色</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">四甲基罗丹明-异硫氰酸酯 (TRITC)</td>
			<td>541</td>
			<td>572</td>
			<td>红色</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">异硫氰酸荧光素 (FITC)</td>
			<td>494</td>
			<td>519</td>
			<td>绿色</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Cy3</td>
			<td>552</td>
			<td>565</td>
			<td>红色</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">封片剂与浸油：</td>
			<td colspan="3">名称</td>
			<td colspan="2">介质折射率 *1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">空气（载玻片与物镜之间无介质）</td>
			<td colspan="2">1.00029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂</td>
			<td colspan="2">1.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Permount 封片剂</td>
			<td colspan="2">1.519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">低自发荧光浸油 (MOIL-30 Type F)</td>
			<td colspan="2">1.518</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">放大倍率物镜（平场萤石）</td>
			<td>放大倍数</td>
			<td>数值孔径 (NA) *2</td>
			<td>分辨率 (µm)</td>
			<td>图像像素间距 (nm) *5</td>
			<td>Z 轴切片间距 (nm) *6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X</td>
			<td>0.13</td>
			<td>2.12</td>
			<td>850</td>
			<td>3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.92</td>
			<td>340</td>
			<td>3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.55</td>
			<td>170</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.37</td>
			<td>85</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.21</td>
			<td>34</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：显微镜设置参数与点扩散函数（PSF）文件创建要求。 在衍射PSF 3D插件窗口中有11个参数栏位用于创建PSF文件。每个栏位说明如下：*1 - 介质折射率：载玻片与物镜之间介质的折射率（例如，空气 = 1.00029）。*2 - 数值孔径：所用物镜的数值孔径（NA），当使用与物镜设计不匹配的浸没介质时，必须进行校正。*3 - 波长：荧光染料的最大发射波长（nm）。*4 - 轴向球面像差：0.00。*5 - 图像像素间距：CCD像素尺寸（nm）/放大倍数（例如，3.4 µm，100倍物镜，3400/100 = 34 nm）。*6 - Z轴图像间距离。*7 - 宽度：输入待去卷积图像的像素宽度。*8 - 高度：输入待去卷积图像的像素高度。*9 - 深度，切片数：z-stack中的图像数量。*10 - 归一化：所有像素值之和等于1。*11 - 标题：PSF文件的命名。该文件应与对应的唯一z-stack图像相匹配。

本文介绍了四种最常用的可视化BrdU阳性细胞的技术，用于检测大鼠中的成年神经发生。本研究包括试剂制备、胸苷类似物给药、经心脏灌注、组织制备、过氧化物酶免疫组织化学反应、免疫荧光、信号放大、复染、显微镜成像以及细胞分析的操作说明。

利用胸苷类似物BrdU分析大鼠细胞增殖与神经发生的免疫组织化学技术

成体海马神经发生（AHN）领域中最重要的环节之一是鉴定新生成的细胞。

这是成体神经发生领域的一项关键实验方案。本文详细描述了实现成功染色所需的各个步骤。该技术能够在保持组织完整性的前提下，同时鉴定处于分裂状态的细胞中共同表达的特定蛋白质。我们建议预先测试组织抗体及实验条件。关键步骤包括膜通透化、谨慎的DNA变性，以及优化封闭和洗涤步骤的时间。对于新建立的实验室而言，该技术的标准化具有挑战性。在啮齿类动物中，胸苷类似物的试剂配制与给药对于实验成功至关重要。进行胸苷类似物BrdU给药时，固定实验大鼠的下腹部以限制其活动，使用带有23号针头的1毫升注射器，将新配制的50毫克/千克BrdU溶液经腹腔注射入动物体内。在适当的实验终点，取出脑组织并将其冷冻，以便使用冷冻切片机获取40 µm厚的冠状切片，并按采集顺序将切片放入24孔细胞培养板的各个孔中，每孔加入冷冻保护液。当所有切片收集完毕后，将样品置于-20 °C保存，可保存数月之久。为了评估BrdU染色，使用过氧化物酶反应及亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，将切片从冷冻保护液转移至0.1摩尔PBS中，直至样品达到室温，随后用新鲜的0.1摩尔PBS洗涤组织三次，每次10分钟。最后一次洗涤后，在室温下将切片置于内源性过氧化物酶阻断液中孵育30分钟，接着用0.1摩尔PBS洗涤三次，每次10分钟。最后一次洗涤后，将切片在37摄氏度下用2摩尔盐酸孵育20分钟，随后用0.1摩尔硼酸缓冲液冲洗一次，每次10分钟。在冰冻的0.1摩尔PBS中清洗三次后，将样品在PBS+封闭液中于室温孵育两小时，随后在4摄氏度下用小鼠抗BrdU一抗抗体在PBS+中过夜孵育。经过三次0.1摩尔PBS清洗后，将样品在室温下用适当的小鼠生物素化二抗抗体在PBS+中孵育两至四小时。清洗后，于室温下用ABC溶液处理切片一小时，随后进行三次0.1摩尔PBS清洗。最后一次洗涤后，将切片转移至DAB-过氧化物酶底物溶液中，孵育2至10分钟，直至切片变为深灰色。若能观察到阳性细胞，用自来水冲洗三次，每次15分钟，随后用0.1摩尔PBS缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后，用软毛刷小心地将切片贴附于明胶包被的载玻片上，在室温下空气干燥过夜。第二天早晨，使用永久封片剂将盖玻片覆盖在样品上。为了定量BrdU阳性细胞，首先在显微镜下使用4倍物镜识别齿状回，并沿Z轴仔细搜索颗粒细胞层中被BrdU标记的细胞核。在选定整个齿状回区域的间隔切片进行细胞搜索后，计数所有BrdU阳性细胞。标记细胞核的形态可能因细胞掺入的BrdU量不同而发生变化。在Z轴上缓慢移动，对每只动物至少10个切片、每组至少五只动物中整合成簇的全部细胞核进行定量分析。进行图像去卷积时，打开衍射点扩散函数3D插件，填写所有必需的数据，点击“确定”并保存文件。接下来，打开 DeconvolutionLab2 插件，将匹配的 Z 轴层叠图像和点扩散函数（PSF）文件拖入对应的窗口槽中。选择反卷积算法及迭代次数，然后点击运行。要将反卷积后的图像合并为单一的 Z 轴层叠图像，请选择图像和堆栈，然后点击 Z 投影。从投影类型菜单中选择“最大强度”。点击“确定”并保存文件。要创建 RGB 图像，请选择“图像”和“颜色”，然后点击“合并通道”，在下拉菜单中将相应的图像设置到所需的彩色通道。然后取消勾选“创建复合图像”选项，点击“确定”并保存文件。当所有通道图像生成后，打开至少两个图像文件，并为每个图像文件选择不同的颜色通道，以创建RGB图像。在这些图像中，可以观察到具有 BrdU 标记细胞的典型齿状回切片。从这些切片的放大图像中可见，标记细胞呈现出明显的深色染色。值得注意的是，未进行体力活动的对照组大鼠与接受体力活动的实验组大鼠之间，BrdU 阳性细胞数量存在显著差异，这一结果与其他已报道的研究一致，表明体力活动可增加成年个体齿状回中的细胞增殖。进行该方案时，应使用新鲜配制的溶液，并轻柔操作组织。海马体在处理过程中容易与其余切片分离，可能导致遗漏。该方法可适用于DNA标记和索引评估、DNA合成以及双染细胞增殖研究。我们希望这项工作对科学界有所帮助，并使得在免疫组织化学技术研究细胞增殖时，更容易回答新的科学问题。

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使用胸苷类似物BrdU分析大鼠细胞增殖和神经发生的免疫组织化学技术

我们建立了一种策略，用于检测胸苷类似物（CldU和IdU）在成年小鼠组织中的顺序掺入，以量化连续两轮的细胞分裂。该策略适用于检测长寿命组织的细胞更新、致癌转化或过渡性增殖细胞。...

免疫荧光法检测原代组织中的两种胸腺嘧啶类似物（CldU 和 IdU）

在本视频中，我们通过检测放射性示踪剂氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入细胞DNA的情况，来测定神经前体细胞的增殖能力。该技术可用于研究特定药物和生长因子处理后细胞的增殖情况。...

DNA合成检测：利用放射性氚标记胸腺嘧啶掺入法评估增殖细胞中DNA合成的技术

来源：Olesen, M. V.,et al．采用光学分数法估算电休克疗法大鼠模型中的细胞数量．J. Vis. Exp.（2017）．...

使用光学分馏器技术定量大鼠脑组织中新生成的神经元

成年哺乳动物新生神经元的功能仍是当前研究的活跃领域。电离辐射可抑制新神经元的生成。利用计算机断层扫描引导的局部照射（CFIR），现可通过三维解剖定位特定的神经前体细胞群，来评估成年神经发生的生物学功能。...

功能性质疑成年下丘脑神经发生：基于局灶性放射学抑制的研究方法

下丘脑, 神经发生, 成年神经发生, 放射抑制, 神经干细胞, 神经前体细胞, 辐照, 焦点性照射, 脑功能成像, 功能分析

本文描述了调控和分析NF-κB依赖性成年海马神经发生的实验方法。提供了一种详细的实验方案，用于检测小鼠认知功能的齿状回依赖性行为学测试（称为“空间模式分离-巴恩斯迷宫”）。该技术也有助于在其他实验条件下开展相关研究。...

NF-κB依赖性成体神经发生的调控与分析方法

在怀孕小鼠中给予两种胸苷类似物EdU和BrdU，可分析胚胎小鼠脑内神经细胞和前体细胞的细胞周期进程。该方法有助于确定基因毒性应激（包括电离辐射）对脑发育的影响。...

评估基因毒性应激后小鼠发育大脑中神经干细胞与前体细胞的细胞周期进程

本入门级实验方案以小胶质细胞和神经元成分的标记物为例，介绍了完成啮齿类动物脑组织免疫组织化学染色所需的试剂、仪器和操作技术。...

冷冻切片大鼠脑组织免疫组织化学染色初学者指南：小胶质细胞与神经元染色示例

本文介绍了一种利用脑片组织培养技术研究海马体出生后神经发生的实验方法。该方法可实现 体外...

用于研究出生后神经发生的器官型脑片培养

本视频文章展示了一种全面的实验方案，可在同一组织切片中检测并定量成年海马神经发生的各个阶段。我们改进了一种方法，以克服在无法获得来自不同宿主物种的合适抗体时，间接多重免疫荧光技术所存在的局限性。...

使用同源物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生

本方案展示了如何在小鼠中建立可靠的高频刺激（HFS）方法。通过HFS直接和间接地对海马齿状回中的神经元进行电刺激。 体内神经元活动和分子信号传导通过以下方式检测 c-fos...

一种通过高频刺激激活小鼠齿状回的侵入性方法

本实验方案的目的是描述一种用于分析成年神经干细胞/祖细胞在特定局部神经环路化学遗传学操控下行为反应的方法。...

检测成年海马神经前体细胞的环路特异性调控

学习使用BrdU免疫组织化学技术检测大鼠脑组织中细胞增殖与神经发生的方法。该方案涵盖胸苷类似物腹腔注射、组织处理及显微成像等关键步骤，为评估成年海马齿状回神经发生提供可靠手段。

利用胸苷类似物BrdU分析大鼠细胞增殖与神经发生的免疫组织化学技术

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