Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

这是成体神经发生领域的一个关键方案。在这里，我们详细介绍了成功染色所需的步骤。该技术可以同时识别分裂细胞中共表达的特定蛋白质，同时保持组织完整性。

我们建议提前检测组织抗体和条件。关键步骤是膜透化、仔细的 DNA 变性以及测试封闭和洗涤步骤的时间。对于新实验室来说，标准化技术是一项挑战。

啮齿动物中胸苷类似物的试剂制备和给药对于成功结果至关重要 对于胸苷类似物 BrdU 给药，固定下腹腔以抑制实验大鼠，并使用配备 23 号针头的 1 毫升注射器腹膜内注射新鲜制备的 50 毫克/公斤 BrdU 溶液到动物体内。在适当的实验终点，收集大脑并冷冻大脑，以便使用低温恒温器切片机采集 40 微米厚的冠状切片，并将切片放入冷冻保护溶液中 24 孔细胞培养板的各个孔中，按照收集顺序。收集完所有切片后，将样品在零下 20 摄氏度下储存长达几个月。

为了评估 BrdU 染色，使用过氧化物酶反应与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，将切片从冷冻保护溶液转移到 0.1 摩尔 PBS 中，直到样品达到室温，然后用新鲜的 0.1 摩尔 PBS 冲洗组织 3 次，每次洗涤 10 分钟。最后一次洗涤后，在室温下将切片在内源性过氧化物酶封闭溶液中孵育 30 分钟，然后在 0.1 摩尔 PBS 中洗涤 3 次，每次 10 分钟。最后一次洗涤后，将切片在 37 摄氏度下在 2 摩尔盐酸中孵育 20 分钟，然后在 0.1 摩尔硼酸盐缓冲液中冲洗 10 分钟。

在冰冷的 0.1 摩尔 PBS 中洗涤 3 次后，将样品在室温下在 PBS+ 封闭溶液中孵育 2 小时，然后在 4 摄氏度下与小鼠抗 BrdU 一抗在 PBS+ 中孵育过夜。3 次 0.1 mol PBS 洗涤后，在室温下将样品与适当的小鼠生物素化二抗在 PBS+ 中孵育 2 至 4 小时。洗涤后，在室温下用 ABC 溶液处理切片 1 小时，然后进行 3 次 0.1 摩尔 PBS 洗涤。

最后一次洗涤后，将切片转移到 DAB-过氧化物酶底物溶液中孵育 2 至 10 分钟，直到切片变为深灰色。如果可以看到阳性细胞，则用 3 次 15 分钟的自来水洗涤液冲洗样品，然后用 3 次 0.1 摩尔的 PBS 液冲洗。最后一次洗涤后 使用软刷小心地将切片安装在糊化的载玻片上，在室温下风干过夜。

第二天早上，使用永久性封固剂将盖玻片盖在样品上。为了定量 BrdU 阳性细胞，首先，在显微镜上使用 4 倍放大镜来识别齿状回，并沿 Z 轴仔细搜索颗粒细胞层以查找 BrdU 标记的细胞核。选择用于在整个齿状回中搜索细胞的间隔部分后，计数所有 BrdU 阳性细胞。

标记细胞核的形态可以根据细胞掺入的 BrdU 量而变化。在 Z 轴上缓慢移动，以量化每只动物至少 10 个切片和每组至少 5 只动物的所有细胞核，这些动物整合了一个簇。对于图像反卷积，打开衍射点扩散函数 3D 插件，填写所有需要的数据，单击 OK 并保存文件。

接下来，打开 DeconvolutionLab2 插件并将匹配的 Z-stack 图像和 PSF 文件拖动到相应的窗口插槽中。选择反卷积算法和迭代次数，然后单击 run。要将反卷积图像合并为单个 Z 堆栈图像，请选择 Image and Stacks 并单击 Z project。

从投影类型菜单中，选择 Max Intensity （最大强度）。单击 OK 并保存文件。要创建 RGB 图像，请选择 图像 和 颜色 ，然后单击 合并通道 从下拉菜单中将相应的图像设置为所需的颜色通道。

然后取消选中 Create composite 框。单击 OK 并保存文件。创建完所有通道图像后，打开至少两个图像文件，并为每个图像文件选择不同的颜色通道以创建 RBG 图像。

在这些图像中，可以观察到具有 BrdU 标记细胞的代表性齿状回切片。正如在这些切片的放大图像中观察到的那样，标记的细胞表现出强烈的深色染色。值得注意的是，未进行体力活动的对照大鼠和暴露于体力活动的实验组之间的 BrdU 阳性细胞数存在显着差异，与其他报告的结果一致，这些结果表明体力活动会增加成年齿状回的细胞增殖。

尝试此方案时，请使用新鲜制备的溶液并轻轻处理组织。海马体在通过海马体进行治疗时很容易与其他载玻片分离，并且可能会被遗漏。该程序可适用于 DNA 合成的 DNA 标记和指数评估以及加倍染色细胞增殖研究。

我们希望这项工作对科学界有所帮助，并使在免疫组织化学技术下更容易回答细胞增殖研究中的新问题。