直接耦合视网膜电图（DC-ERG）记录小鼠视网膜色素上皮光诱发的电反应

直流视网膜电图（DC-ERG）技术可用于无创性评估视网膜色素上皮功能，以监测与年龄相关的变化或疾病进展，并评价药物干预的效果。该技术通过简化毛细管电极的制备过程，提高了DC-ERG的可重复性和操作便捷性。此外，还可结合标准的欧姆软件应用程序，以促进数据分析。

首先，将25号注射器针头小心地穿过硅胶垫片，插入电极 holder 的后壁。在缓慢抽出针头的同时，用脱气的HBSS填充电极 holder 的底部，注意避免引入气泡，然后装回螺纹帽但不要拧紧。重新插入注射器针头，用HBSS填充间隙中的空余空间，并在填充时保持毛细管水平，以防止溶液从另一端溢出。

握住已填充的毛细管弯曲端，缓慢将另一端穿过松开的帽盖，并拧紧螺帽固定。倾斜电极架，使毛细管电极开口向上，以便气泡排出，并将毛细管置于真空室中脱气 5 至 10 分钟。随后，缓慢释放真空，重新填充电极架和玻璃毛细管，操作如演示所示。

为微电极夹持器制作一个定制支架时，需从8号T型夹的一侧取下黑色聚缩醛夹片，并使用带有磁性球头的圆柱底座（经加工切成一半）来调节高度。用M3规格的螺母将改造后的T型夹固定在磁性球头安装螺钉上，并将约一英寸长、经改造的锥形木制手柄（由棉签清洁棒改制而成）以一定角度插入支架中，从而将微电极夹持器固定在自制的T型夹磁性球头关节支架内。然后，利用稀土磁铁圆柱底座，将定制的电极夹持器支架牢固地固定在显微镜载物台的金属板上，实现围绕180度轴线的360度旋转。

进行电极测试时，首先将组装完毕且充满HBSS的毛细管微电极轻轻放入盛有HBSS的小容器中。将针状接地电极和位于中心的银/氯化银参考电极一同置于同一HBSS溶液中以完成电路，并选择或创建适当的标识符以描述待测小鼠。要选择将要执行的直流耦合视网膜电图（DC-ERG）方案，请点击“Protocols”（方案），然后选择DC-ERG。

点击运行。将弹出一个包含患者信息的对话框。如果信息正确，请点击“是”，然后进入六步中的第一步。

关闭法拉第笼的门，然后单击“impedance”以显示阻抗模式。确认口部参考电极、尾部接地电极和记录电极的数值在可接受范围内，然后单击“step”进入六步中的第四步，以测试基线稳定性。要开始查看轨迹，请单击“preview”。

波形应为低噪声，峰峰值幅度小于200微伏。进行实验时，先在镇静小鼠的角膜上滴一滴5%盐酸丙帕他卡因，以麻醉角膜，随后滴加一滴2.5%盐酸去氧肾上腺素和5%托吡卡胺以散大角膜。在ERG系统软件中，确认已选择正确的受试者。

点击方案。在方案描述下，选择DC-ERG并点击运行。点击“是”以确认正在进行正确的测试。

使用六个步骤中的第一步，打开圆顶内的微弱红光，并将小鼠放置在加热的记录台上。用镊子小心地撑起后肢的皮肤。一只手牢固地握住针电极，另一只手将电极皮下插入后肢，以固定电极位置。

将参比银-氯化银电极放入动物口腔内，使中心的圆片紧贴后侧颊部，并固定于牙齿后方。在将毛细管电极放置到眼睛上之前，先将电极架调整至玻璃毛细管呈垂直方向，并用食指轻弹电极架，以去除可能引入的气泡。使用25号针头用HBSS填充毛细管尖端，并检查毛细管，确保尖端无气泡残留。

将电极架放置到位，使充满HBSS的毛细管开口端轻轻接触角膜。小心避免产生气泡，将润滑眼用凝胶的分装器倒置，弃去最初的几滴。然后在每只眼睛上滴加一滴润滑眼用凝胶，以维持导电性，并防止记录过程中角膜干燥。

为了记录直流视网膜电图（DC-ERGs），单击“步骤”以选择六个步骤中的第五步，然后单击“阻抗”以使用阻抗检测界面检查左右眼的电阻。每只眼睛的记录电极阻抗值应相近，且接地电极和参考电极的阻抗值均应低于10千欧姆。

单击预览以查看左右眼的轨迹，并等待最多10分钟以获得稳定的基线。然后，单击停止以退出轨迹预览，再单击运行以开始记录。此处显示了来自条件性敲除小鼠和野生型小鼠的示例数据集。

在本次分析中，电极内存在微小气泡，导致信号轨迹的峰-峰值噪声增大。在另一次分析中，通过在将微电极组装到电极夹持器支架内之前，使用真空室处理，消除了气泡。

可以计算前25秒的拟合直线，从而对漂移校正后的反应进行重新绘图，并确定直流视网膜电图（DC-ERG）各组分的振幅。正如预期，视网膜色素上皮（RPE）中cure 7.1钾通道表达的减少显著减弱了c波和快速振荡，表明视网膜色素上皮的电学特性受到明显损害。此处展示了将DC-ERG各组分的相对振幅归一化至野生型后，相对于两个最大的光诱发a波振幅所绘制的结果。

这种分析方法可以确定视网膜色素上皮（RPE）电反应的降低是否仅由光感受器活性的下降所引起，还是存在起源于RPE本身的潜在缺陷。在进入小鼠记录阶段之前，请务必获得稳定的基线，并定期重新检查电极，以排除可能引入的气泡。

可在进行直流视网膜电图（DC-ERG）之前记录暗适应ERG，以评估视锥细胞介导的视网膜功能。也可在直流视网膜电图之后进行明适应ERG，以评估视锥细胞介导的视网膜反应。