Name: 通过特洛多毒素微注射可逆灭活，揭开鼠脑离散区在排卵调节中的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 了解低成本微注射系统构建方法，用于研究雌性哺乳动物下丘脑对排卵的神经调控机制。该技术可适配多种物种，为生殖神经生物学研究提供可及性工具。

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我们感谢华盛顿大学的 Raymond Sanchez 在手稿编辑方面提供的宝贵帮助，感谢理学硕士 Georgina Cortés 和理学硕士 Cintia Javier 在本技术标准化过程中提供的技术支持。我们还感谢萨拉戈萨高等研究学院兽医服务部门的成员：兽医 Adriana Altamirano、兽医 Roman Hernández 和兽医 Dolores-Elizabeth Guzmán，他们对实验动物的饲养与护理工作极为出色。本方案中所描述的实验得到了 DGAPA-PAPIIT 项目（资助号：IN216015）以及 CONACyT 项目（资助号：236908）对 Roberto Domínguez 的资助。Carlos-Camilo Silva 是墨西哥国立自治大学（UNAM）生物医学科学博士项目的一名博士生，同时受到墨西哥国家科学与技术理事会的资助（资助号：294555）。

作者声明本文无任何利益冲突。

本文介绍了一种可在任意给定时间瞬时失活清醒且未束缚大鼠脑内特定区域的方法。同时提供了一种简单的方法用于追踪其动情周期并评估排卵情况。通过比较经河豚毒素（TTX）处理动物与经载体处理动物的排卵结果，该实验方案可直接分析特定脑区在驱动排卵机制中的作用。除立体定位仪和微量注射泵（神经科学研究实验室常见设备）外，该方法无需昂贵材料。此类实验通常使用商用套管和微量注射器，但本文所述易于构建的系统可显著降低成本，且实验结果与商用产品无差异。使用本方案及随文附表所列材料，花费与一套供十只动物使用的商用试剂盒相同的费用，可制造出十倍数量的套管。无论研究所需的具体定制要求如何，制作十个双侧套管仅需数小时即可完成。此外，所有组件均可重复使用，进一步提高了成本效益。
除了具有较高的效益成本比外，该方案适用于任何实验室环境，任何具备啮齿类动物操作、立体定位手术以及生物毒素及其相关废弃物处理知识的人员（包括学生）均可开展。此外，该方案可进行调整，适用于各种啮齿类动物及其他小型哺乳动物（如兔子、雪貂、狨猴），甚至可用于鸟类和爬行动物等非哺乳类物种。除上述特性外，本方案的主要优势在于，可轻松调整用于研究受大脑调...

排卵是指每个动情周期/月经周期中，一个或多个成熟卵母细胞从卵巢中释放的过程。由于所有哺乳动物物种都依赖配子的产生来进行繁殖，因此了解调控排卵的机制在生物医学、畜牧业以及濒危物种保护等领域具有重大影响。排卵受下丘脑-垂体-卵巢轴的调控，该调控系统涉及多个下丘脑及下丘脑外区域、腺垂体中的促性腺激素细胞，以及与卵母细胞共同构成卵巢内卵泡的卵泡膜细胞和颗粒细胞1。
卵巢卵泡的生长、发育及最终排卵，依赖于促卵泡激素和黄体生成素这两种促性腺激素的紧张性与周期性分泌，这些激素由促性腺细胞分泌。促性腺激素的分泌模式对正常的卵泡发育和排卵至关重要，其分泌受促性腺激素释放激素（GnRH）的调控1,2。该神经肽由分布于间脑基底部的神经元合成，随后分泌至连接下丘脑与腺垂体的垂体门脉系统。GnRH神经元的分泌活动反过来又受到来自不同脑区突触输入的调节。这些脑区传递有关机体内外环境状态的信息，包括食物可获得性、光照周期长度以及血液中激素浓度。因此，它们塑造了每个物种的生殖模式，必须明确这些结构的具体作用，才能充分理解调控排卵的机制。例如，已有研究表明，动情周期中雌二醇水平的波动可调节GnRH的分泌；然而，GnRH神经元本身并不表达检测此类变化所需的雌二醇受体亚型。表达这些受体的两类神经元分别位于第三脑室的前腹侧室周区和弓状核，并与GnRH神经元形成突触连接。有证据表明，这些神经元能够感知雌二醇浓度，并通过释放强效诱导GnRH分泌的酮替肽（kisspeptin），进而刺激GnRH神经元的活动3。
涉及热损伤或化学损伤以及机械性去传入的实验使研究人员能够确定多种脑结构在排卵调节中的作用4,5,6,7,8,9,10,11,12。然而，这些实验的缺点在于具有侵入性和创伤性，需要在评估处理效应前经历数天的恢复期，从而阻碍了对处理急性效应的分析。此外，这些方法会永久性地影响靶向区域，并在长期干扰其他生理过程。由于上述问题，这些实验的结果通常受到动物体内稳态代偿机制的掩盖，难以准确获取该脑区所参与的时序调控动态信息。
通过导管套管对神经元活动进行短暂干扰的药物微量注射是一种合适的替代方法，可克服上述提到的种种缺点。可通过立体定位手术将套管植入任意脑区，使研究者能够在手术带来的混杂效应消失后，再开始药物处理。定时进行的药物微量注射使研究者能够检验特定脑区在某一过程特定阶段中所起作用的假设，并可在清醒且固定或自由活动的动物中实施。多种药物，包括局部麻醉剂、激动剂、拮抗剂、反向激动剂以及生物毒素（如河豚毒素，TTX），均可在特定时间微量注射至目标脑区。
TTX 是一种由河豚体内以及其他脊椎动物和无脊椎动物体内的细菌合成的生物毒素。TTX 通过选择性且可逆地阻断钠通道来抑制神经活动，从而抑制钠依赖性动作电位的产生。在 TTX 存在的情况下，细胞的去极化过程发生改变，因此细胞不再具有兴奋性，但仍保持存活状态。TTX 的阻断作用可由其分子结构解释：其分子中的胍基能够穿过钠通道的胞外部分，但由于分子其余部分体积较大而无法通过，因此被卡住并阻塞通道13,14,15,16,17。TTX 的作用机制使其成为研究神经系统的重要工具，广泛应用于体外和体内实验。脑内注射该毒素已被用于研究特定脑区在多种生理过程中的作用，包括记忆保持18、睡眠与觉醒19、位置识别20、空间导航21、药物成瘾22、体温调节23、精神分裂症的发生发展24、性行为25以及排卵调控26等。本实验方案描述了在清醒且自由活动的大鼠中，通过微量注射 TTX 短暂失活下丘脑核团对排卵过程的影响。

<table><tbody><tr><td>10 &amp;mu;L 汉密尔顿注射器</td><td>Hamilton</td><td>80314</td><td></td></tr><tr><td>21 G × 1&quot; 不锈钢穿刺针</td><td>BD</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>23 G × 1&quot; 不锈钢穿刺针</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>30 G × 1/2&quot; 不锈钢穿刺针</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>人工脑脊液</td><td>BASi</td><td>MD-2400</td><td></td></tr><tr><td>骨修剪器</td><td>精细科学工具公司</td><td>16152-12</td><td></td></tr><tr><td>微型钻头用钻头</td><td>精细科学工具公司</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>电推剪</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>切割片</td><td>Dremel</td><td>SM5010</td><td></td></tr><tr><td>剪切镊子</td><td>Truper</td><td>17367</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>Kola loka</td><td>K-1</td><td></td></tr><tr><td>牙科水泥</td><td>Nic Tone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恩诺沙星</td><td>Senosiain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超精细波恩剪刀</td><td>精细科学工具公司</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>面部口罩</td><td>Lanceta HG</td><td>60036</td><td></td></tr><tr><td>格拉费镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>精细科学工具公司</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>精细科学工具公司</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>羟丙甲纤维素人工泪液</td><td>Sophia Labs</td><td>8950015</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Pisa Agropecuaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>Aranda</td><td>1183</td><td></td></tr><tr><td>微量注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>788380</td><td></td></tr><tr><td>单体</td><td>Nic Tone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型电动工具</td><td>Dremel</td><td>3000</td><td></td></tr><tr><td>丁腈手套</td><td>Lanceta HG</td><td>69028</td><td></td></tr><tr><td>非穿刺式耳杆</td><td>David Kopf Instruments</td><td>855</td><td></td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Dermo Dine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含皂聚维酮碘</td><td>Germisin espuma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>压力镊子</td><td>Truper</td><td>17371</td><td></td></tr><tr><td>大鼠麻醉面罩</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 906</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液</td><td>PISA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>精细科学工具公司</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>精细科学工具公司</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Pisa Agropecuaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准电极夹持器</td><td>David Kopf Instruments</td><td>1770</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢丝</td><td>American Orthodontic</td><td>856-612</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 900LS</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>精细科学工具公司</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>特氟龙连接器</td><td>Basi</td><td>MD-1510</td><td></td></tr><tr><td>特氟龙管</td><td>Basi</td><td>MF-5164</td><td></td></tr><tr><td>河豚毒素</td><td>Alomone labs</td><td>T-500</td><td></td></tr><tr><td>麻醉蒸发器</td><td>Kent scientific</td><td>VetFlo</td><td></td></tr></tbody></table>

通过河豚毒素微量注射可逆性失活揭示大鼠脑内特定区域在排卵调节中的作用

Unraveling the Role of Discrete Areas of the Rat Brain in the Regulation of Ovulation through Reversible Inactivation by Tetrodotoxin Microinjections

已有多种实验方法被用于研究大脑在排卵调控中的作用。例如，通过损毁或去传入特定神经元群，但这些均为侵入性方法，会永久性破坏目标区域的结构完整性。这些方法常伴随间接效应，可能影响对急性及时间依赖性调控机制的分析。通过立体定位技术将导管套管植入特定脑区，经术后恢复期后，可在手术引起的不良效应消失后进行多种药物的微量注射。河豚毒素已被用于确定多个脑区在不同生理过程中的作用，因其可短暂抑制钠离子依赖性动作电位，从而阻断目标区域的所有神经活动。本方案将该方法与动情周期及排卵评估策略相结合，以揭示特定动情周期阶段中离散脑区在排卵调控中的作用。实验采用清醒且自由活动的大鼠（Rattus norvegicus），以避免麻醉剂和应激激素对排卵的抑制作用。该方案可轻松适用于其他物种、脑区靶点及药理学试剂，用于研究不同的生理过程。该方法未来的改进方向包括设计使用小直径玻璃毛细管替代导管套管的微量注射系统，以减少植入过程中对组织的损伤，并降低药物在目标区域外的扩散。

上述方案通过评估单次向大鼠中已知参与排卵调节的两个不同核团——视交叉上核和弓状核——之一注射河豚毒素（TTX）或对照溶剂（人工脑脊液；ACSF）的作用而进行验证。选择视交叉上核是因为其包含哺乳动物的中枢昼夜节律起搏器，参与调节诸如促性腺激素分泌等周期性事件。选择弓状核是因为其含有一群表达雌二醇受体的神经元，可在大部分动情周期中促进促性腺激素释放激素（GnRH）的分泌。微注射在动情前期14:00进行，该时段被称为“关键窗口期”，因许多调控促排卵前促性腺激素释放的中枢机制在此期间发生。处理后每日采集阴道涂片，并在预测的动情期当天09:00处死大鼠，此时阴道涂片显示为典型的动情期特征。另设一个对照组，包括五只在动情期阶段处死的完整（未手术）大鼠。通过Fisher精确概率检验，计算并分析手术后各组中维持动情周期的大鼠比例以及排卵大鼠的比例（排卵大鼠数/n）。采用Kruskal-Wallis检验对双侧卵巢排出的卵母细胞数量进行分析，随后进行Dunn检验。采用适当的统计学方法确保样本量充足。 
共对30只雌性大鼠进行了导向套管植入手术，目标为两个靶区之一。如<strong class="xfi...

本方案描述了一种低成本显微注射系统的构建方法，将其立体定位植入大鼠深部脑结构的操作步骤，以及在清醒且自由活动的大鼠中进行定时四乙基氯化铵微注射的流程。该研究的目的是通过抑制下丘脑结构的神经活动，揭示其在排卵调控中的参与作用。

已采用多种实验方法研究大脑在排卵调节中的作用。例如，损毁和……

本方案使研究人员能够在雌性哺乳动物动情周期的特定时间点，探究调控排卵的神经回路核团。该技术可被调整用于研究任何物种中大脑调控的各类过程。此外，他们还可以在实验室中减少人工操作步骤，从而降低总体成本。演示该实验操作的将是 Montserrat Bola

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通过特洛多毒素微注射可逆灭活，揭开鼠脑离散区在排卵调节中的作用

子宫内活体注射与电穿孔技术应用于胚胎大鼠新皮质，为操控单个前体细胞提供了强大工具……...

E16 大鼠胚胎的宫内脑室内注射与电穿孔

来源：Silva, C. et al. 通过河豚毒素微量注射可逆性失活解析大鼠脑内特定区域在排卵调节中的作用。 J. Vis. Exp.

向清醒雌性大鼠脑内注射河豚毒素以抑制排卵

本方案概述了注射电极的组装及其在麻醉大鼠脑内靶向区域进行精确药物递送的应用，随后通过记录电信号来监测神经元活动。...

大鼠脑内药物微量注射结合电生理记录

本视频展示了从新生大鼠脑组织中分离富含催产素受体的脑核团。通过冠状面切片，随后识别并精确 punched...

从新生大鼠脑组织中分离富含催产素受体的细胞核

来源：Lai, J., et al. 在啮齿类动物大脑中同时进行电生理记录与抑制剂微注射。J. Vis. Exp.

抑制大鼠神经元活动及其通过电生理学检测的方法

在此，我们制备一种具有双重功能的玻璃移液管：通过药物微注射抑制深部脑结构，并通过同步的电生理记录实时监测其效应。...

在啮齿类动物大脑中同步进行电生理记录与抑制剂微注射

通过立体定位注射表达 cDNA 或 shRNA...

应用立体定位注射技术研究基因对动物行为的影响

本方案描述了在大鼠进行学习与记忆任务时，如何暂时且远程地抑制离散脑区中神经元活动的方法。该方法结合了药理遗传学（仅由设计药物激活的设计受体）与一种行为范式（感觉预条件），旨在区分学习过程中的不同组分。...

一种在学习特定阶段远程抑制啮齿类动物神经活动的方法

啮齿类动物是研究行为和复杂精神疾病分子基础的合适模型。通过在清醒啮齿类动物中进行脑部微量注射，可用于阐明疾病的神经生物学基础。本文介绍了一种高效且可定制的脑部微量注射方法，以及用于量化动机的工具性条件行为范式。...

啮齿类动物脑部微量注射研究动机行为的分子基础

本方案描述了一组利用离体脑片中的光遗传学刺激，鉴定来自远端脑区的长程输入的细胞类型特异性功能连接的方法。...

在体小鼠脑切片中长程投射通路的光遗传学刺激：颅内立体定位注射方法

通过颅骨进入并利用颅骨解剖标志进行引导，是小鼠脑部定位的常用立体定位手术方法。本文概述了一种用于靶向延髓尾部及上段颈髓的替代性立体定位手术方法。 通过...

立体定位手术方法用于向延髓尾部及上段颈髓进行微量注射 通过 小鼠中的大池

了解低成本微注射系统构建方法，用于研究雌性哺乳动物下丘脑对排卵的神经调控机制。该技术可适配多种物种，为生殖神经生物学研究提供可及性工具。

通过河豚毒素微量注射可逆性失活揭示大鼠脑内特定区域在排卵调节中的作用

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