利用SAX-HPLC从不同植物物种中提取和定量可溶性放射性标记的肌醇多磷酸盐

本文所展示的实验方案有助于阐明植物肌醇多磷酸盐的生物合成过程，并解答其在植物代谢和发育某些方面作用的相关问题。该方法具有高度敏感性，因为使用了放射性标记的肌醇磷酸前体，能够可靠地检测植物中所有类型的肌醇磷酸化合物。对该方法进行可视化演示尤为重要，因为大多数植物生物学家对高效液相色谱（HPLC）分析及其所需的实验设置并不熟悉。

此外，该方案中的关键步骤（如肌醇磷酸的提取）若无适当的演示，很难准确操作。首先建立一个包含两台独立高效液相色谱泵的系统，分别用于缓冲液 A 和缓冲液 B。这两台泵需通过计算机或主泵进行同步控制。为两台泵均配备活塞密封清洗装置，可通过重力或第三台低压泵实现。

将两台泵连接至一个动态混合器，然后将混合器连接至带有至少一毫升容量样品环的进样阀。使用毛细管将进样阀连接至色谱柱，并将色谱柱连接至组分收集器。在装有固体培养基的方形培养皿中，沿一行播种植莲子，培养基由去离子水中含0.8%细菌学琼脂组成。

将种子置于黑暗条件下，在 4 °C 至少冷藏处理三天。将种子放入培养箱中。取 10 至 20 株幼苗转移至一个 12 孔透明平底细胞培养板的孔中，每孔加入 2 mL 添加 1% 蔗糖并调节 pH 至 5.7 的半倍浓度 MS 盐溶液。

向培养板中加入 45 微居里的 3H-肌醇，并轻轻混匀。用盖子盖住培养板，并用微孔手术胶带密封。然后将其放回培养箱中继续培养。

标记五天后，将幼苗从培养基中取出，用去离子水短暂清洗。用纸巾吸干水分，转移到1.5毫升的微量离心管中，注意不要装填过满。将离心管在液氮中快速冷冻，随后于-80°C保存，直至进行提取。

从冷冻机中取出样品，并在使用前保持在液氮中。用微型离心管研磨杵研磨样品，直至开始解冻，然后加入 500 µL 冰冷的提取缓冲液。继续研磨，直到样品完全匀浆且溶液呈现颜色。

将样品在 18,000 ×g 及 4 °C 条件下离心 10 分钟。然后将上清液转移至新的 1.5 毫升离心管中。用于提取的离心管被视为固体放射性废物，需按规定进行处理。

向提取物中小心加入 300 微升中和缓冲液，此时会立即出现蛋白质沉淀和气泡。一分钟后，用移液器吸头混匀样品，并吸取 5 微升滴加到 pH 试纸上，确保 pH 值在 7 至 8 之间。如有必要，少量添加中和缓冲液或提取缓冲液，直至达到所需 pH 值，然后将样品置于冰上静置至少一小时，盖子保持打开状态。

然后离心10分钟，并将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。将馏分收集器配备96个小型闪烁瓶，并向每个闪烁瓶中加入2毫升适合的闪烁液，该闪烁液需兼容低pH缓冲液和高浓度磷酸铵。启动高效液相色谱（HPLC）系统，然后开启活塞密封清洗程序，并在整个运行过程中保持其处于激活状态。

使用合适的注射器手动进样。启动泵和梯度程序。在高效液相色谱运行过程中，定期检查压力。

起始压力应在18至24 bar之间，并在达到100%缓冲液B时缓慢上升至50至60 bar。运行结束后， tightly 密封小瓶，并用力振荡各组分与闪烁液混合。若不立即进行测量，应将小瓶直立放置于避光处。

为测定各组分，将小瓶插入适合小瓶的闪烁计数器架中，并在液体闪烁计数器中对每个小瓶测量五分钟。绘制一幅二维线图，以每分钟计数（CPM）为纵坐标，以保留时间（retention time）为横坐标。为比较不同样品之间的差异，对数据进行归一化处理：分别计算每个样品在第25至96分钟洗脱组分的CPM总和，再将每个样品的总CPM除以其他样品的总CPM。

为了对特定肌醇多磷酸峰进行相对定量，并随后创建包含重复实验数据的柱状图以进行统计分析，请继续使用能够计算色谱图峰面积的专业软件进行分析。此处展示的是从拟南芥（A.thaliana）提取物经闪烁计数后获得的完整肌醇多磷酸谱图。各峰之间分离良好，可分别归属于不同的异构体。

使用老化色谱柱时，可见肌醇六磷酸的峰明显减少，且无法检测到肌醇焦磷酸。同样条件下培养并标记的日本列当（L.japonica）幼苗也进行了SAX-HPLC分析。尽管可能观察到所有已知来自拟南芥的肌醇多磷酸种类及其色谱峰，但两种物种之间特定肌醇多磷酸异构体的相对含量存在差异。

为了证明样品在提取后无需立即进行分析，将一份样品分为两份，其中一半在–80 °C保存一天后进行检测。新鲜样品与冷冻样品的SAX-HPLC谱图之间无显著差异，表明一次冻融循环不会对样品造成损害，且该方法本身可产生可重复的结果。在实施本方案时，务必在冷冻状态下使用提取缓冲液将样品充分研磨，并在中和后尽量使pH接近中性，以确保SAX-HPLC分析时放射性标记的肌醇磷酸获得最大回收率。

可以通过SAX-HPLC运行后收集未添加闪烁液的组分并仅测量少量等分试样，从而纯化放射性标记物质以供后续使用，例如用于相互反应实验。