使用SAX-HPLC从不同植物物种中提取和定量可溶性、放射性标记肌醇多磷酸盐
June 26th, 2020
在这里，我们描述了强抗离子交换高性能液相色谱的[3H]-肌醇标记幼苗，这是一种高度敏感的方法，用于检测和量化植物中的肌醇聚磷酸盐。
这里演示的协议有助于阐明植物肌醇多磷酸盐的生物合成，并回答有关它们在植物代谢和发育的某些方面的作用的问题。这种方法非常敏感，因为使用放射性标记的肌醇磷酸盐前体可以可靠地检测植物中所有肌醇磷酸盐物种。此方法的可视化演示非常重要，因为大多数植物生物学家都不熟悉 HPLC 分析和所需的设置。
此外，如果不进行适当的演示，很难遵循此协议的关键步骤，如提取肌醇磷酸盐。首先建立一个由两个独立的HPLC泵组成的系统，一个用于缓冲器 A，一个用于缓冲B。通过重力或通过第三个低压泵为两个泵安装活塞密封清洗。
将两个泵连接到动态混合器，然后将混合器连接到具有至少一毫升容量的样品环的喷射阀。使用毛细管将喷射阀连接到柱，将柱连接到分数收集器。在方培养皿上一排播种莲子，里面装满了固体生长介质，在去维化水中由0.8%的细菌性藻剂组成。
让种子在黑暗中四摄氏度下分层至少三天。将种子放在生长培养箱中。将 10 至 20 株幼苗转移到一个 12 井清澈的平底细胞培养板中，该培养板中填充了两毫升半强度 MS 盐溶液，该溶液辅以 1%蔗糖，并调整为 pH 5.7。
将 45 个 3H 肌醇的微库利添加到板中，然后轻轻旋转。用盖子盖住盘子，用微孔手术胶带密封。然后把它放回成长孵化器。
贴标签五天后，从介质上取出幼苗，用去维水短暂清洗。用纸巾擦干，然后转移到1.5毫升的微离心管中，确保不要过度填充管子。将管子在液氮中捕捉，并将其储存在零下80摄氏度，直到提取。
从冰柜中取出样品，并放在液氮中，直到准备好使用。用微离心管研磨，直到它们开始解冻，然后加入500微升的冰冷萃取缓冲液。继续研磨，直到样品均质且溶液着色。
在18，000倍的G和4摄氏度下将样品离心10分钟。然后将上一液转移到一个新鲜的1.5毫升管中。用于萃取的管子被视为固体放射性废物，需要相应地处理。
小心地在提取物中加入300微升的中和缓冲液，这将立即引起蛋白质的沉淀和冒泡。一分钟后，将样品与移液器尖端和移液器五微升混合到 pH 纸上，以确保 pH 值在 7 到 8 之间。如有必要，添加少量中和缓冲液或萃取缓冲液，直到达到所需的 pH 值，让样品在冰上用打开的盖子至少休息一小时。
然后离心10分钟，将上看液转移到一个新鲜的1.5毫升管中。为小瓶收集器配备 96 个小闪烁小瓶，并为每个小瓶填充两毫升合适的闪烁鸡尾酒，与低 pH 缓冲液和高磷酸铵浓度兼容。启动 HPLC 系统，然后激活活塞密封清洗，并整个运行过程中保持激活。
用合适的注射器手动注射样品。启动泵和梯度。当 HPLC 运行正在进行时，请定期检查压力。
起始压力应在 18 到 24 bar 左右，一旦达到 100% 缓冲 B，应缓慢上升到 50 到 60 bar。跑步后，紧密地关闭小瓶，用闪烁的鸡尾酒剧烈摇动小瓶混合。如果不直接进行测量，请将小瓶保持直立位置在黑暗中。
要测量分数，请使用适合小小瓶的机架将小瓶插入闪烁计数器机架，并在液体闪烁计数器中测量每个小瓶五分钟。准备 2D 折线图，其中根据保留时间绘制每分钟测量计数或 CPM。要相互比较样本，请将每个样本的每个洗除分数的 CPM 从 25 分钟到 96 的 CPM 相加，并将该样本中的总 CPM 除以其他样本的总 CPM 来规范化数据。
要对某些肌醇聚磷酸盐峰执行相对定量，并随后创建包含复制数据的条形图进行统计分析，请使用可计算色谱峰值区域的专用软件继续分析。此处显示了从 A.thaliana 提取物获得的完整肌醇多磷酸盐光谱。峰很好地分离，可以分配给不同的异构体。
当使用老年柱时，明显减少肌醇六磷酸盐和缺乏肌醇黄磷酸盐是可见的。SAX-HPLC分析还对L.japonica幼苗进行了分析，这些幼苗的种植和标记条件与阿拉伯植物幼苗相同。虽然从阿拉伯磷酸盐中可以看见所有肌醇多磷酸盐物种和峰，但两个物种之间特定肌醇多磷异构体的相对数量存在差异。
为了证明样品在提取后不必立即进行分析，一个样品被分成两半，在储存在零下80摄氏度后的第二天分析。SAX-HPLC 新鲜样品和冷冻样品的轮廓之间的差异并不显著，这表明一个冷冻-解冻周期不会损害样品，并且该方法本身会产生可重复的结果。尝试此协议时，始终用萃取缓冲液彻底研磨样品，并瞄准中和后接近中性 pH，以确保在 SAX-HPLC 分析中最大限度地回收标有放射性标的肌醇磷酸盐。
从 SAX-HPLC 运行中可以纯化无线电标签，供以后使用，例如在相互反应中，无需闪烁鸡尾酒即可收集分数，并且仅测量少量等分。
概述
本文介绍了一种高灵敏度的方法，用于检测和定量植物中的肌醇多磷酸盐，使用强阴离子交换高效液相色谱（SAX-HPLC）。该协议旨在阐明这些化合物的生物合成及其在植物代谢和发育中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物代谢
- 生物化学
- 分析化学
背景
- 肌醇多磷酸盐在植物生物学中扮演着关键角色。
- 传统方法可能缺乏对这些化合物的检测灵敏度。
- HPLC是一种用于分离和分析生化化合物的强大技术。
- 放射性标记的前体增强了检测的可靠性。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来分析植物样品中的肌醇多磷酸盐。
- 提供HPLC设置和操作的可视化演示。
- 促进对关键提取和分析步骤的理解。
使用的方法
- 用[3H]-肌醇标记的幼苗的制备。
- 从植物组织中提取肌醇磷酸盐。
- 使用SAX-HPLC进行分离和定量。
- 使用闪烁计数法测量分数。
主要结果
- 成功分离了肌醇多磷酸盐异构体。
- 比较了不同植物种类之间的分析谱。
- 展示了方法在冻融循环中的可靠性。
- 定量分析了肌醇多磷酸盐峰值。
结论
- SAX-HPLC方法对于分析肌醇多磷酸盐是有效的。
- 视觉协议增强了理解和可重复性。
- 研究结果为植物代谢过程的知识做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables sensitive detection and quantification of inositol polyphosphates in plant systems, supporting target validation in plant signaling pathways. By providing quantitative, reproducible data on InsP species including PP-InsPs, it aids mechanistic de-risking in early discovery. The approach offers predictive confidence for prioritizing plant-based therapeutic hypotheses and pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of inositol phosphate biosynthesis and functional role in plant metabolism.
- Operational Value: Provides high-sensitivity detection of low-abundance, charged InsP species via radiolabeling and SAX-HPLC separation.
- Scientific Value: Supports discrimination of non-enantiomeric isomers and PP-InsPs (InsP7, InsP8) for precise target characterization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative chromatographic profiles for comparative analysis across plant species or conditions.
- Operational Value: Establishes a standardized, reproducible workflow from radiolabeling to data normalization for assay readiness.
- Scientific Value: Enables relative quantification of InsP peaks using peak area analysis for statistical comparison across replicates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates cross-species applicability (Arabidopsis thaliana, Lotus japonicus) for translational biomarker alignment.
- Operational Value: Shows method robustness across freeze-thaw cycles, supporting sample banking and multi-timepoint studies.
- Scientific Value: Facilitates understanding of InsP involvement in plant development and stress responses, informing preclinical model selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to support hypothesis testing and pathway clarification in plant-based target validation.
- Discovery Biology: Supports functional interrogation of InsP signaling pathways through sensitive detection of metabolic flux.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative InsP profiles with high sensitivity and isomer resolution.
- Analytics: Enables normalization and peak area quantification for statistical analysis and comparative screening.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical via cross-species profile comparison and method reproducibility.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable analytical platform for InsP profiling across diverse plant models and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through precise InsP speciation and quantification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across laboratories and plant species.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in plant signaling pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative InsP pathway modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiolabeling, HPLC operation, and scintillation counting.
- Needs dual HPLC pumps, dynamic mixer, injection valve, fraction collector, and scintillation counter.
- Demands cross-team standardization for radiolabel handling, extraction, and neutralization steps.
- Requires adaptation of extraction buffers and gradients for different plant matrices and InsP profiles.
- Limited by radioactivity safety protocols, waste disposal, and access to scintillation detection equipment.
