Name: 静脉畸形的患者衍生异种移植模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 了解如何利用患者来源的内皮细胞构建小鼠静脉畸形异种移植模型。该技术可重现组织病理学特征，支持临床前治疗测试，并适用于其他血管或淋巴管异常研究。

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作者感谢 Nora Lakes 对本文的校对。本手稿中报道的研究工作由美国国立卫生研究院下属的国家心肺血液研究所资助，资助编号为 R01 HL117952（E.B.）。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

<ol><li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+malformation%3A+update+on+aetiopathogenesis%2C+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Phlebology%3A+The+Journal+of+Venous+Disease%22%5BJournal%5D)">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li>
<li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li>
<li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42(2016).</li>
<li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li>
<li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43(2016).</li>
<li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li>
<li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+%28PDX%29+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889(2019).</li>
<li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li>
<li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen%2C+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74(2011).</li>
<li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen%2C+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative%22%5BJournal%5D)">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).</li>
<li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li>
<li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li>
<li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xenograft+model+for+venous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li>
<li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li>
<li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种建立静脉畸形（VM）患者来源异种移植模型的方法。该小鼠模型为研究者深入理解病理性管腔扩张提供了优良的实验体系，并将有助于开发更有效且具有靶向性的VM治疗策略。该方法也可轻松拓展用于研究其他类型的血管畸形，例如毛细血管淋巴管静脉畸形16。要成功构建可重复的血管病变模型，有几个关键步骤。首先，患者来源的内皮细胞在注射时必须保持纯度（不含其他细胞类型）并处于指数生长期。污染的成纤维细胞或其他间充质非内皮细胞（non-EC）通常具有细长的形态，易于识别。极少数情况下，即使使用抗CD31抗体偶联磁珠进行纯化后，培养物中仍可能残留少量非内皮细胞，此类培养物需进一步利用内皮特异性细胞表面标志物进行纯化。另一种替代方法是进行内皮细胞的单细胞克隆扩增，可确保突变内皮细胞（mutant-EC）的均一性，因为整个培养物中的所有细胞均来源于单一细胞。然而，该方法不推荐用于VM来源的内皮细胞，因为此类细胞在经历9‒10次传代后通常会停止增殖，并转变为衰老表型。因此，在异种移植实验中必须使用第3至8代之间的细胞，且注射前一日不得进行传代操作。
异种...

血管系统发育缺陷是多种疾病的潜在病因，包括静脉畸形（VM）。VM 是一种先天性疾病，其特征是静脉的形态发生异常和扩张1。对 VM 组织和内皮细胞（EC）的重要研究表明，两个基因存在功能获得性突变：TEK（编码酪氨酸激酶受体 TIE2）和 PIK3CA（编码 PI3 激酶（PI3K）的 p110α（催化亚基）亚型）2,3,4,5。这些体细胞突变导致包括 PI3K/AKT 在内的关键血管生成/生长信号通路发生配体非依赖性的过度激活，从而引起扩张的静脉畸形3。尽管已有这些重要的遗传学发现，但触发异常血管生成以及形成扩大的血管腔道的后续细胞和分子机制仍尚未完全阐明。
在正常和病理性血管生成过程中，新生血管从已有的血管网络中 sprout（出芽），内皮细胞（EC）经历一系列重要的细胞过程，包括增殖、迁移、细胞外基质（ECM）重塑以及管腔形成6。内皮细胞的二维和三维（2D/3D）体外培养是分别研究这些细胞特性的有力工具。然而，目前迫切需要一种小鼠模型，能够在宿主微环境中模拟病理性血管扩张，同时为转化研究中靶向药物的临床前评估提供高效平台。
迄今为止，尚未报道与 TIE2 功能获得性突变相关的转基因小鼠血管畸形（VM）模型。目前的转基因血管畸形小鼠模型依赖于激活型突变 PIK3CA p.H1047R 的全身性或组织特异性表达3,5。这些转基因动物为研究该 PIK3CA 热点突变在整体或特定组织中的效应提供了重要见解。然而，这些模型的局限性在于会形成高度病理性血管网络，导致早期死亡。因此，这些小鼠模型无法充分反映突变事件的散发性特征以及血管畸形病理的局部性本质。
相反，患者来源的异种移植模型是将来源于患者的病理组织或细胞移植或注射到免疫缺陷小鼠体内而建立的7。异种移植模型是深入认识疾病发展机制及发现新型治疗药物的有力工具8。此外，使用患者来源的细胞可使科研人员重现突变的异质性，从而研究患者表型的谱系特征。
本文描述了一种实验方案：将表达突变型组成性激活 TIE2 和/或 PIK3CA 的患者来源的血管畸形内皮细胞（VM EC）皮下注射至无胸腺裸鼠背部。如既往血管异种移植模型所述，注射的血管细胞被悬浮于细胞外基质（ECM）支架中，以促进血管生成9,10,11。这些 VM 内皮细胞可发生显著的形态发生，并在缺乏支持细胞的情况下形成扩张的、具有灌注功能的病理性血管。该血管畸形异种移植模型为靶向药物在抑制管腔异常扩张方面的临床前评估提供了一个高效的平台。

<table><tbody><tr><td>裸鼠（无胸腺），(Foxn1-nu)；5-6周龄，雄性</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>生物素标记的荆豆凝集素-I（UEA-I）</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1065</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>瓶顶滤器（500 ml；0.2 &amp;micro;M）</td><td>Thermo Fisher</td><td>974106</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>BSA</td><td>A7906-50MG</td><td>细胞培养；组织学分析</td></tr><tr><td>二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>游标卡尺</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50996491</td><td>病灶栓测量</td></tr><tr><td>CD31偶联磁珠（Dynabeads）</td><td>Life Technologies</td><td>11155D</td><td>内皮细胞分离</td></tr><tr><td>细胞筛（100 &amp;mu;M）</td><td>Greiner</td><td>542000</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>锥形管；聚丙烯（15 mL）</td><td>Greiner</td><td>07 000 241</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>锥形管；聚丙烯（50 mL）</td><td>Greiner</td><td>07 000 239</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>柯普林染色缸</td><td>Ted Pella</td><td>21029</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>盖玻片（50 × 22 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545E</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>DAB：3,3'-二氨基联苯胺试剂（ImmPACT DAB）</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Corning</td><td>10-027-CV</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>内皮细胞分离</td></tr><tr><td>耳标钳</td><td>VWR</td><td>10806-286</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>EDTA（0.5 M，pH 8.0）</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基-2（EGM2）子弹套装（基础培养基及补充剂）</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>伊红Y（酒精基）</td><td>Thermo Scientific</td><td>71211</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30910.03</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>带滤芯吸头 1,250 &amp;mu;L</td><td>MidSci</td><td>AV1250-H</td><td>多个步骤</td></tr><tr><td>带滤芯吸头 20 &amp;mu;L</td><td>VWR</td><td>10017-064</td><td>多个步骤</td></tr><tr><td>带滤芯吸头 200 &amp;mu;L</td><td>VWR</td><td>10017-068</td><td>多个步骤</td></tr><tr><td>缓冲福尔马林溶液（10%）</td><td>Sigma</td><td>F04586</td><td>病灶栓解剖</td></tr><tr><td>血细胞计数板（INCYTO；一次性）</td><td>SKC FILMS</td><td>DHCN015</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Vector Hematoxylin</td><td>H-3401</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>人血浆纤维连接蛋白纯化蛋白（1 mg/mL）</td><td>Sigma</td><td>FC010-10MG</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>过氧化氢溶液（30% w/w）</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td></td><td></td><td>分析</td></tr><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-106-01</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>基底膜基质（无酚红；无LDEV）</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>内皮细胞分离</td></tr><tr><td>显微镜载玻片 Superfrost（75 mm × 25 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>1255015-CS</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>针头，26G × 5/8 英寸，皮下无菌针头</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD305115</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>正常马血清</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-2000</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺（100X）</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>永久封片剂（VectaMount）</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>研钵C型，光滑头</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431F55</td><td>内皮细胞分离</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>血清移液管（10 ml）</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>血清移液管（5 ml）</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>碳酸钠（Na2CO3）</td><td>Sigma</td><td>223530</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>链霉亲和素-辣根过氧化物酶浓缩液（用于免疫组化）</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-5004</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>注射器（60 ml）</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>注射器滤器（0.2 &amp;micro;M）</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>注射器（1 mL，带鲁尔锁）</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD-309628</td><td>皮下注射</td></tr><tr><td>细胞培养处理培养皿（100 × 20 mm）</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>细胞培养处理培养皿（145 × 20 mm）</td><td>Greiner</td><td>639160</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>细胞培养处理培养皿（60 × 15 mm）</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Tris碱（Trizma碱）</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4%）</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA，1X（0.05% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA）</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Biorad</td><td>170-6531</td><td>组织学分析</td></tr><tr><td>惠顿瓶</td><td>VWR</td><td>16159-798</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>组织学分析</td></tr></tbody></table>

一种静脉畸形的患者来源异种移植模型

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

静脉畸形（VM）是一种血管发育异常，由静脉网络发育障碍导致，表现为扩张且常有功能障碍的静脉。本文旨在详细描述一种模拟人类静脉畸形并能反映患者异质性的鼠类异种移植模型的建立方法。研究发现，内皮细胞（EC）中激活性体细胞（非遗传性）TEK（TIE2）和PIK3CA基因突变是导致静脉畸形病理性血管扩张的主要驱动因素。以下方案描述了携带突变型TIE2和/或PIK3CA的患者来源内皮细胞的分离、纯化与扩增过程。将这些内皮细胞皮下注射至免疫缺陷的无胸腺小鼠背部，以形成扩张的血管样结构。使用携带TIE2或PIK3CA突变的内皮细胞所形成的病灶在注射后7‒9天内即可观察到明显的血管化，并在组织病理学特征上重现了静脉畸形患者组织的表现。该静脉畸形异种移植模型为研究驱动静脉畸形形成与扩展的细胞和分子机制提供了可靠的平台。此外，该模型在转化医学研究中具有重要价值，可用于评估新型候选药物在抑制人类静脉畸形中异常血管扩张方面的有效性。

本方案描述了基于将患者来源的内皮细胞（EC）皮下注射至免疫缺陷裸鼠背部，建立小鼠血管畸形（VM）异种移植模型的过程。在从VM组织或病灶血液中初次分离细胞后，可在4周内收获内皮细胞克隆（图1A,B）。注射后次日，异种移植病灶栓塞物覆盖的表面积约为80‒100 mm2。据我们观察，携带TIE2/PIK3CA突变EC的病灶栓塞物在注射后7‒9天内即可出现肉眼可见的血管化并实现灌注14,15（图1C-E）。然而，病灶生长程度存在差异，反映了患者及样本间的异质性。
病灶组织块能够高度再现人类血管畸形（VM）组织的组织病理学特征：扩张的血管腔由单层扁平的内皮细胞衬覆（图1F‒H）。这些血管结构通常含有红细胞，证实其与宿主小鼠的脉管系统形成...

我们提供了一种建立静脉畸形小鼠异种移植模型的详细方案。该模型基于皮下注射携带TIE2和/或PIK3CA基因激活突变的患者来源内皮细胞。异种移植病灶能够高度模拟静脉畸形患者组织的组织病理学特征。

静脉畸形（Venous malformation, VM）是一种血管异常，源于静脉网络发育障碍，导致静脉扩张且常伴有功能障碍……

该方案可用于建立能够重现静脉畸形组织病理学特征的患者来源异种移植模型，并进一步用于开展临床前治疗试验。该技术提供了一个快速且可靠的NVivo系统，可对患者来源的内皮细胞的每日生长情况以及对实验性治疗的反应进行持续监测。该方法可轻松适用于研究其他类型的血管或淋巴管异常。首先制备用于注射的细胞悬液。用5毫升预热至37摄氏度的0.05%胰蛋白酶-EDTA，在37°C下消化内皮细胞2分钟。加入5毫升EGM以中和胰蛋白酶，并将细胞收集至150毫升锥形管中。以400 × g离心5分钟，然后吸除上清液，将细胞重悬于3毫升EGM中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。将含有目标细胞数量的体积转移至新的50毫升锥形管中，通过离心再次收集细胞沉淀。吸除上清液，留下少量液体以松动细胞沉淀。每注射一次，用220微升BMEM重悬细胞沉淀。将细胞悬液在冰上充分混匀，注意避免产生气泡。通过拉动活塞，将BMEM细胞培养液吸入一支1毫升的注射器中。将一根26号无菌针头锁紧在注射器上，并在注射前将准备好的注射器平放在冰上。确保小鼠已充分麻醉后，将其置于俯卧位，并用70%乙醇对注射区域进行消毒。轻轻滚动已准备好的注射器，以重悬可能沉降的细胞。将气泡轻弹至注射器末端，并排出少量细胞悬液。在注射部位捏起皮肤，形成一个帐篷状结构。然后将针头插入皮肤正下方，并通过松开捏起的皮肤确认针头仅位于皮内，以避免将细胞悬液注入肌肉组织。固定针头，缓慢而小心地注入 200 µL 细胞悬液，形成一个小型球状隆起。注意避免将细胞悬液注射到肌肉中。使用游标卡尺测量每个移植块的长度和宽度。将解剖出的异种移植块并排置于切板上，紧邻直尺，拍摄图像以记录病灶的大体血管情况。然后将凝胶块置于室温下浸入10%福尔马林中固定过夜。解剖后，将病灶凝胶块进行组织学分析，并用UEA-1染色以检测凝胶块内来源于人源的内皮细胞。在病灶切片内采用20倍物镜的明场显微镜，沿X平面模式选取五个高倍视野（HPF）图像，避免视野重叠。确保在拍摄的图像上包含比例尺。在 ImageJ 中打开 HPF 图像。为校准比例尺的像素，使用直线工具划过比例尺，然后点击“分析”并选择“设置比例尺”，将测得的像素转换为毫米。接下来，单击“分析”→“设置测量”，选择面积并添加到叠加图像中。使用“分析”和“测量”功能测量高倍视野（HPF）的总区域面积，并保存该测量值用于定量分析。使用手绘选区工具，手动勾画出UEA-1阳性血管腔的轮廓。单击“分析”和“测量”以量化所圈定的区域。测量每个高倍视野（HPF）内的所有血管通道。对每张切片中选取的五个高倍视野（HPF）重复此过程，并将所得数值转移至 Excel 进行进一步分析。然后根据文稿中的说明计算血管面积百分比和血管密度。采用本方案，含有 TIE2 或 PIK3CA 高度活化突变内皮细胞的病损小块在注射后 7 至 9 天内可明显观察到血管化和灌注。这些病损小块在组织病理学特征上与人类血管畸形（VM）组织高度相似，可见由单层扁平内皮细胞排列形成的大血管样结构。这些血管结构通常含有红细胞，表明其与宿主小鼠血管系统形成了功能性吻合。使用人特异性凝集素UEA-1进行免疫组织化学染色，可确认血管区域的衬里细胞来源于人源植入细胞，而非小鼠血管组织。在完成该操作后，可对病损组织切片进行增殖或凋亡标志物的额外染色，以分析实验处理的具体效应。该示意图模型已用于静脉畸形新疗法的临床前研究，例如mTOR抑制剂雷帕霉素，其在多项针对静脉畸形患者的临床试验中已显示出疗效。

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与传统的基于塑料培养皿的组织培养检测方法相比，患者来源的异种移植（PDX）模型能更可靠地再现黑色素瘤的分子和生物学特征，并能更准确地预测治疗反应。本文介绍了我们建立新型 PDX 模型以及对已有 PDX...

一种黑色素瘤患者来源的异种移植模型

通过穿透小鼠肾下腹主动脉的双层管壁进入下腔静脉，建立主动脉-下腔静脉瘘，随后通过部分结扎下腔静脉在其流出道处形成狭窄。该可重复模型可用于研究中心静脉狭窄。...

利用动静脉瘘合并流出道狭窄建立中心静脉狭窄的小鼠模型

本实验方案旨在通过使静脉承受动脉血压，实验性地建立静脉内膜增生模型，以开发在使用静脉移植进行血管重建手术后减轻静脉内膜增生的策略。...

一种模拟使用静脉移植物进行血管重建手术的兔静脉移植模型，用于评估动脉血压下的内膜增生

我们描述了一种通过尾静脉注射内源性HER2扩增的炎性乳腺癌细胞系建立的乳腺癌脑转移异种移植小鼠模型。...

通过尾静脉注射炎症性乳腺癌细胞建立脑转移模型

在本方案中，通过左侧胸壁的小切口进行新型猪静脉旁路移植术，且无需体外循环。术后病理学研究显示内膜增厚。...

建立与评估猪静脉移植物疾病模型

了解如何利用患者来源的内皮细胞构建小鼠静脉畸形异种移植模型。该技术可重现组织病理学特征，支持临床前治疗测试，并适用于其他血管或淋巴管异常研究。

一种静脉畸形的患者来源异种移植模型

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