创伤性脑损伤后神经炎症与血流动力学反应的系统分析

这些方法可用于表征脑损伤后的神经炎症和血流动力学反应，作为采用偏最小二乘回归进行多变量系统分析的一部分。这些技术有助于更全面地了解大脑对损伤的反应。为诱导损伤，需确认麻醉小鼠对足趾夹捏无反应，并将小鼠俯卧置于一层薄膜的中央位置。

用双手拉紧组织，将小鼠尾巴固定于拇指下，并将小鼠头部置于导向管下方。当小鼠位置就绪后，瞄准两眼后方与双耳前方之间的区域，从导向管顶部释放撞针，撞击小鼠头部背侧。撞击瞬间，小鼠头部将冲破组织，实现头颈部的快速加速。

损伤后，将小鼠置于37摄氏度的加热垫上，仰卧位恢复。经过两分钟的稳定期后，轻轻地将DCS传感器放置在小鼠颅骨的右侧半球，使光学传感器的上边缘与眼睛后缘对齐，传感器侧面沿中线对齐。用手掌覆盖传感器，以屏蔽室内光线，采集五秒钟的数据。

然后，将传感器重新放置在左半球上方，采集五秒钟的左半球数据。为评估多重细胞因子和磷酸化蛋白的产生，每约三毫克收获的动物脑组织中加入150微升混合裂解缓冲液。使用1,000微升移液器吸头将组织机械吹打15至20次。

将匀浆后的样品置于旋转仪上，在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，然后通过离心收集组织碎片。将上清液转移至新管中，并对样品进行离心以去除任何残留的沉淀物。将上清液转移至新管中，按照标准操作规程通过 BCA 法测定蛋白浓度。

根据新试管中的线性范围分析结果，将每种样品制备为25微升，并调整至最佳蛋白质浓度。使用测定缓冲液将每份样品的总体积标准化至25微升。为制备测定板，向96孔板的每个孔中加入200微升洗涤缓冲液，并在摇床上以每分钟750转的速度振荡10分钟。

孵育结束后，倾去洗涤缓冲液，并将酶标板轻拍在纸巾上以去除残留液体。接着，向每个孔中加入 25 µL 检测缓冲液，再向背景孔中额外加入 25 µL 缓冲液。向相应的样本孔中加入 25 µL 稀释后的样本，并将多重磁珠混合液涡旋震荡 1 分钟，然后向每孔加入 25 µL 充分重悬的磁珠悬液。

当所有磁珠添加完毕后，用封板膜密封反应板，并用铝箔包裹，于2至8摄氏度下振荡孵育过夜。次日早晨，将反应板置于磁力架上，确保各孔与磁铁位置对齐。静置两分钟后，保持反应板仍附着在磁力架上，倾去各孔中的液体，随后向每孔加入200微升洗涤缓冲液。

振荡两分钟后，将酶标板置于磁力架上静置两分钟。随后，在酶标板仍附着于磁力架的状态下倾倒弃去各孔内容物，并按前述方法用新的洗涤缓冲液每孔200 µL洗涤酶标板。第二次洗涤后，每孔加入25 µL检测抗体，用铝箔重新覆盖，在室温下以750 rpm转速孵育一小时。

孵育结束后，向每孔加入 25 µL 链霉亲和素-藻红蛋白，将酶标板放回摇床，在室温下继续孵育 30 分钟。孵育结束后，将酶标板置于磁力分离器上静置 2 分钟，然后倾去孔内液体。用 200 µL 新鲜洗涤缓冲液洗涤酶标板两次，每次洗涤后向每孔加入 75 µL 合适的驱动液。

然后，在室温下将磁珠在板式振荡器上重新悬浮5分钟，并根据制造商的说明在分析仪上读取板孔结果。在此分析中，脑血流量在最后一次损伤后4小时通过扩散相关光谱法进行测量。随后可确定每个半球的脑血流指数和平均脑血流指数。

可在采集所有样本数据之前进行线性范围分析，以确定合适的蛋白质上样量。通过从样本数据中减去背景测量值来制备细胞因子数据，然后计算每种分析物的Z分数数据。可采用吞噬细胞小胶质细胞活化标志物或其他感兴趣的变量作为响应变量，细胞因子测量值作为预测变量，进行偏最小二乘回归分析。

可进行方差最大旋转，以最大化潜变量一上数据与活化标志物测量值之间的协方差。潜变量一中较高的载荷权重对应于与活化标志物高表达最相关的细胞因子表达。活化标志物与细胞因子之间的线性回归分析表明，在潜变量一中载荷权重最大的那些细胞因子在本分析中也具有统计学显著性。

尽管本方案的重点是创伤性脑损伤，但这些方法可广泛适用于研究多种影响大脑的病理状况。我们使用这些技术来帮助识别可在后续实验中进行调控的可行靶点，以建立因果机制关系，最终目标是为轻度创伤性脑损伤开发新的治疗策略。